Abstract
Fundo
Anti-mitótico (microtúbulos de -stabilizers), tais como vincristina e vinblastina foram mostrado clinicamente bem sucedida no tratamento de vários cancros. No entanto, o desenvolvimento de células de resistência a drogas limita as suas eficácias em situações clínicas. Portanto, os experimentos foram realizados para determinar os possíveis mecanismos de resistência aos medicamentos relacionados com a aplicação da terapia do cancro anti-mitótico.
principais conclusões
A KB- resistentes de-estabilizador derivado-KB microtúbulos
L30 linha de células de câncer de
foi gerado para este estudo. KB-
L30
células apresentaram resistência cruzada a vários microtúbulos de-estabilizadores incluindo BPR0L075, vincristina e colchicina através de múltiplas drogas resistente (MDR) mecanismos independentes de. Surpreendentemente, KB-
L30
células apresentaram hiper-sensibilidade ao microtúbulos-estabilizador, paclitaxel. Os resultados das análises de RT-PCR revelou que a expressão de ambas as classes II e III β-tubulina foi regulada para baixo em KB-
L30
células, em comparação com as suas células cancerígenas KB parentais. Além disso, a análise de sequenciação de ADN revelou seis locais de mutação novas presentes no exão IV do gene de βI-tubulina. modelagem computacional indicou que existe uma relação direta entre mutações βI-tubulina e alteração na montagem de microtúbulos e instabilidade dinâmica KB-
L30
células e este modelo previu foi apoiada por um conjunto de microtúbulos aumentou e reduziu microtúbulos instabilidade dinâmica KB-
L30
células, como mostrado por análise de Western blot.
Conclusões e significado
Nosso estudo demonstrou que estas novas mutações em exon quatro da resistência induzida βI-tubulina para microtúbulos de-estabilizadores e hiper-sensibilidade ao estabilizador de microtúbulos através de uma alteração na montagem de microtúbulos ea dinâmica em células cancerosas. Mais importante, o estudo revela que as células cancerosas pode adquirir a capacidade de resistência da droga a compostos anti-mitóticos através de várias alterações nas redes de microtúbulos. Este estudo forneceu mais informações molecular na seleção de drogas para pacientes com mutações de tubulina específicas
Citation:. Cheung CHA, Wu S-Y, Lee T-R, Chang C-Y, Wu J-S, Hsieh H-P, et al. (2010) Cancer Cells Adquirir mitóticas propriedades de resistência à droga através Beta I-tubulina mutações e alterações na expressão da beta-tubulina Isotipos. PLoS ONE 5 (9): e12564. doi: 10.1371 /journal.pone.0012564
editor: Wen-Liang Zhou, Sun Yat-Sen University, China
Recebido: 21 de junho de 2010; Aceito: 12 de agosto de 2010; Publicação: 03 de setembro de 2010
Direitos de autor: © 2010 Cheung et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações intramurais NSC98-3114-M-006-002 e NSC98-2323-B-400-004 do Conselho Nacional de Ciência, Taiwan, República da China, DOH99-TD-C-111-004 a partir do Departamento de Saúde , Taiwan, República da China e CA-097-PP-02 dos Institutos Nacionais de pesquisa em Saúde, Taiwan, República da China. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
os microtúbulos são filamentos de proteínas do citoesqueleto composto de α-tubulina e as moléculas de p-tubulina. Nas células, filamentos dos microtúbulos rapidamente alternam entre as fases de crescimento e retração (instabilidade dinâmica) durante o ciclo celular [1]. Uma vez que os microtúbulos desempenham um papel crucial na regulação do aparelho mitótico, rompimento de microtúbulos pode induzir a paragem do ciclo celular na fase M, a formação de fusos mitóticos anormais, e, finalmente, desencadeamento de sinais para a apoptose. A descoberta de que a actividade citotóxica de vários compostos é através da interferência com o aparelho do fuso mitótico tem atraído muita atenção, no âmbito das duas últimas décadas, e os microtúbulos tornaram-se um alvo farmacológico atractivo para a descoberta de drogas anti-cancro. Os compostos anti-mitóticas tais como a vincristina, vinblastina (-microtúbulo desestabilizar
vinca alcalóide
) e paclitaxel (taxano de estabilização de microtúbulos) foram desenvolvidos para atingir cancros clinicamente [2], [3]. Embora os taxanos e
Vinca
alcalóides são eficazes para a gestão dos diferentes malignidades, o seu potencial está limitada pelo desenvolvimento de resistência a múltiplas drogas (MDR) [4], [5]. MDR é multi-fatorial, com um percurso que conduz à resistência mediada pela expressão através de bombas de efluxo de transmembrana, nomeadamente, o
H r
170000 P-glicoproteína (P-gp170 /MDR) e a proteína de resistência a múltiplas drogas (MRP) [5], [6]. Para além da expressão de MDR, mecanismos adicionais de resistência às drogas anti-mitóticas também têm sido descritos anteriormente. Estes incluem alterações na expressão de isotipo tubulina e as mutações no gene da tubulina [7], [8]. As células que contêm mutações tais como D45Y, S172A, D197N, D224N, S234N, L240I e K350N na classe I beta-tubulina foram encontrados resistentes a colchicina e
Vinca
alcalóide [7]. Por outro lado, as células que contêm mutações tais como P173A, Q292E e Y422C na classe I beta-tubulina foram consideradas resistentes a epotilona (agente de estabilização de microtúbulos) [9]. Curiosamente, a sobre-expressão de βIII-tubulina foi demonstrada em células de paclitaxel-resistentes [10], [11], [12]. No entanto, alterações combinados (em alternâncias na expressão tubulina isotipo e mutações no gene β-tubulina) nas redes de microtúbulos são raramente demonstrado nas células de cancro de resistência a drogas anti-mitóticas.
Neste estudo, um microtúbulo de -stabilizer resistente à linha celular de cancro foi usada para investigar novas alterações presentes em células que foram capazes de induzir a resistência a compostos anti-mitóticos. KB-
L30
é uma linha celular de cancro resistente à derivada-KB BPR0L075 (microtúbulos de-estabilizador). O nosso estudo revelou que KB- publicada
L30
células sobre-expresso da survivina, que conduz para a estabilização de redes de microtúbulos e resultando na resistência a compostos de estabilização de microtúbulos [13]. No entanto, a regulação negativa de survivina apenas parcialmente restaurada a droga-sensibilidade a microtúbulos de-estabilizadores colchicina e BPR0L075, sugerindo que o mecanismo de fármaco-resistentes adicional está presente nesta linha de células [13]. Aqui, nós investigamos mecanismos adicionais que podem ser responsáveis pela resistência aos medicamentos para microtúbulos de-estabilizadores em KB-
L30
células.
Resultados
KB-
L30
células mostram fármaco-resistência aos microtúbulos de-estabilizadores e hiper-sensibilidade ao estabilizador de microtúbulos
a linha de células de câncer de BPR0L075 resistente derivado do KB, KB-
L30
, foi gerada em nosso laboratório. Em breve, KB-
L30
era uma linha celular monoclonal seleccionado relativamente à resistência em caso de exposição contínua da linha celular de cancro parental, KB, para concentrações crescentes do composto de microtúbulos de-estabilização, BPR0L075. KB-
L30
células são cultivadas num meio com 30 nM de BPR0L075 para manter a sua característica resistente à droga. Esta linha específica de células de cancro resistente a drogas é seis vezes mais resistente à BPR0L075, em comparação com as suas células parentais (Tabela 1) (Figura 1A). Além disso, KB-
L30
células apresentam resistência cruzada com outros agentes de estabilização de microtúbulos de, colchicina (7-vezes mais resistente) e vincristina (7-vezes mais resistente) (Tabela 1) (Figura 1B e C) . Surpreendentemente, esta linha de células de cancro resistente a fármacos é 5 vezes mais sensíveis ao agente de estabilização de microtúbulos paclitaxel como em comparação com as células KB (Tabela 1) (Figura 1D).
KB e KB-
L30
células foram tratadas com várias concentrações de BPR0L075 (a), colchicina (B), vincristina (C) e paclitaxel (D) durante 3 dias e a viabilidade celular foi medida por ensaio de viabilidade celular MTT.
Multiple-drogas de proteína resistente (MDR) não está presente no KB-
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células
estudo anterior demonstrou que o composto de microtúbulos de-estabilização BPR0L075 foi igualmente eficaz em ambos os MDR /MRP células cancerosas negativas e positivas [14], indiretamente sugerindo que o BPR0L075 resistência KB-
L30
células exibem propriedades de resistência a drogas através do mecanismo de MDR /MRP-independente. Para apoiar ainda mais as conclusões anteriores, RT-PCR foi realizada para determinar se KB-
L30
células sobre-expressos MDR-1. RT-PCR A análise revelou que nem KB nem KB-
L30
células expressam MDR-1 (Figura 2A). Em contraste, MDR-1 foi expresso na linha celular de cancro vincristina resistente, KB-VIN10 (controlo positivo) (Figura 2A). Além disso, os resultados do quantitativo em tempo real PCR revelou que outra importante bomba de efluxo de drogas, MPR-1, não era sobre-expressos em KB-
L30
células, em comparação com suas células KB parentais (Figura 2B). Em contraste, o MRP-1 foi sobre-expressa na linha celular de controlo positivo, KB-20-A (Figura 2B). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que KB-
L30
células induzida resistência à microtúbulos de-estabilizadores através de mecanismos de MDR-independentes.
A expressão do MDR-1 em KB, KB-
As células KB-VIN10 L30
e foi analisada por RT-PCR (A). A expressão de MRP-1 em KB, KB-
células KB-20 L30
e foi analisada por PCR em tempo real (B). GAPDH foi utilizado como um controlo interno, tanto RT-PCR em tempo real e análises de PCR.
KB-
L30
células apresentam alterações na expressão de isótipo beta tubulina
desde KB-
L30
células induzidas BPR0L075 e colchicina resistência através do mecanismo de MDR /MRP-independente, outros mecanismos de resistência a drogas tem sido investigada. tem sido amplamente demonstrado que as alterações da expressão da p-tubulina isotipos ao nível do ARNm estão relacionados com a mitótico indução de resistência a drogas em células de cancro [15], [16]. Aqui, a expressão de isotipos p-tubulina em kb e KB-
células L30
foi analisado por RT-PCR. Ao nível do ARNm, a expressão de classe II e III isotipos β-tubulina foi reduzida em KB-
L30
células, em comparação com os microtúbulos de estabilizadores de células KB sensíveis (Figura 3A). A quantidade de classe II e III isotipos beta-tubulina expressos em KB-
L30
células foi reduzido em 35% e 40%, em comparação com as suas células parentais. Em contraste, não houve diferença significativa na expressão da classe I, IV
a e IV
B isotipos p-tubulina entre as duas linhas de células (Figura 3A).
A expressão de diferentes isotipos β-tubulina em kb e KB-
células L30
foi analisado por RT-PCR. GAPDH foi usada como um controlo interno (A). RT-PCR e nested-PCR análises dos exons 1, 2, 3 e 4 no gene β-tubulina de classe III da KB e KB-
L30
células. Primeira pista, células KB e segunda pista, KB-
L30
células (B). PCR-SSCP análises dos exons 1, 2, 3 e 4 no gene β-tubulina de classe III da KB e KB-
L30
células. pista, células KB primeira e segunda pista, KB-
L30
células (C).
KB-
L30
células apresentam múltiplas mutações no exão quatro dos βI-tubulina gene
a contribuição de mutações pontuais p-tubulina na indução de resistência à droga para vários compostos anti-mitóticos foi também descrito anteriormente [7], [8], [17]. Desde classe I de p-tubulina representa ~ 90% do pool intracelular total nas células, a sequência do gene de βI-tubulina de KB-
células L30
foi analisada. Em primeiro lugar, a RT-PCR foi realizada para determinar se qualquer sequência de inserção larga escala ou deleção estavam presentes no exão 1, 2, 3 e 4 do gene βI-tubulina de KB-
L30
células. Os resultados de RT-PCR e electroforese em gel não revelou diferenças significativas no tamanho molecular (comprimento) de qualquer um dos exões do gene de βI-tubulina entre KB-
L30
e células KB (Figura 3B). Este resultado indicou que larga escala de inserção sequência ou eliminação não estava presente no gene βI-tubulina de KB-
L30
células. Determinou-se ainda mais a presença da mutação de ponto único em KB-
L30
células através da realização de análise de cadeia simples Polimorfismo de Conformação (SSCP). SSCP é a separação electroforética de ácidos nucleicos de cadeia simples com base em diferenças subtis na sequência de (geralmente um único par de bases), o que resulta em uma estrutura secundária diferente e uma diferença mensurável na mobilidade através de um gel. Aqui, os resultados da análise de SSCP do ADN genómico βI-tubulina não mostrou nenhum desvio de bandas de mobilidade do exão 1, 2 e 3 da KB-
L30
, quando comparada com a de células KB (Figura 3C). Surpreendentemente, a análise de SSCP revelou uma mudança de padrão no exão 4 de βI-tubulina em KB-
L30
células.
sequenciação de ADN foi realizada para re-confirmar os resultados acima. Consistente com os resultados de ambas as análises de SSCP, sequenciação de ADN do βI-tubulina de KB-
RT-PCR e L30
células não revelaram qualquer mutação presente no seu exão 1, 2 e 3 regiões (dados não mostrados). Curiosamente, sequenciamento de DNA revelou múltiplas mutações presentes no exão 4 de βI-tubulina de
L30
células KB-. Os dados de sequenciação são os resultados de um mínimo de duas experiências. Seis mutações pontuais foram encontradas no nucleótido 947 de T para A (sentido), 1114 de A para T, 1145 de C para T, 1213 de G para A, 1294 de G para A e 1.310 de G para T (Figura 4A). Estas mutações correspondem a mutações de aminoácidos V316D, T372S, S382L, E405K, E432K e G437K (Figura 4B).
sequenciação de ADN do ADN genómico βI-tubulina revela seis mutações pontuais presentes no exão 4 (A) . sequência de amino-ácido traduzida do exão 4 mutada do gene βI-tubulina (B). A expressão da proteína mutada βI-tubulina e a sua integração em redes de microtúbulos foram revelados por microscopia de imuno-fluorescente. As células foram sondadas com anticorpo anti-βI-tubulina (C). A transfecção do gene mutado βI-tubulina em células KB reduziu a sensibilidade ao fármaco in vitro para BPR0L075 (D).
imunofluorescência foi realizada para determinar se o gene mutado βI-tubulina se traduziu em que proteínas foram posteriormente incorporadas nas redes de microtúbulos em KB-
células L30
. KB-
células L30
foram coradas com anticorpo anti-βI-tubulina e o anticorpo secundário conjugado com FITC. Os resultados da microscopia de imunofluorescência revelou que a proteína mutada βI-tubulina estava presente como parte das redes de microtúbulos (Figura 4C). Para demonstrar que as mutações de tubulina foram de facto responsável por causar o fenótipo resistente BPR0L075, transfecção do gene e a sobre-expressão do mutante βI-tubulina que contém as mutações acima foi realizada em células KB. ensaio de viabilidade celular MTT revelou que as células KB transfectadas com o βI-tubulina mutada mostraram um aumento da resistência à BPR0L075 (IC
50 11 nM), em comparação com as células transfectadas com o plasmídeo vazio de controlo (IC
50 7 nM) e de tipo selvagem βI-tubulina (IC
50 7 nm) (Figura 4D). Assim, a expressão do βI-tubulina mutada fez desempenhar um papel na sensibilidade droga para BPR0L075 em células KB.
estudos de modelagem de computador para mutações βI-tubulina na resistência BPR0L075
mutações tubulina pode ser associado com um ou outro local de ligação a droga alterada ou alterações na estabilidade dos microtúbulos. Aqui, modelagem computacional foi empregado para dar informações estruturais. A estrutura tridimensional da tubulina (código PDB: 1SA0) foi utilizado [18] e o programa de descoberta de estúdio 2,1 (Accelrys, Inc.) foi aplicada para construir modelo por mutação de resíduos e realizando minimização de energia. Neste modelo, o resíduo V318D (correspondente a V316D em KB-
L30
) está localizado no local de ligação de colchicina em βI-tubulina (Figura 5A). Val318 (tipo selvagem) formado interações hidrofóbicas com colchicina. No entanto, o resíduo mutado (V mutado para D) afasta-se a colchicina para formar uma ligação de hidrogénio com o resíduo R320, resultando na perda de interacção hidrofóbica com colchicina (figura 5A) no estudo de modelação. Este resultado indica que V318D pode enfraquecer a afinidade de ligação da colchicina à tubulina p-. Por outro lado, as mutações do resíduo 392 (localizado na hélice 11) e o resíduo 382 (localizados no loop perto da hélice 11) alterar a conformação da hélice 11, o que pode aumentar as interacções longitudinais e, consequentemente, alterar a estabilidade de microtúbulos (Figura 5B ) [19]. E415K (correspondente a E405K em KB-
L30
) está localizado na região de H11-H12 perto da interface do dímero que está envolvido em contactos longitudinais. Resíduo 415, mutado de Lys para Glu, quebra as interacções de ligações hidrogénio com K402 resíduo e, consequentemente, conduz ao movimento de K402 mais perto do α-tubulina. O deslocamento do resíduo K402 (Figura 5C) conduz a contactos próximos com resíduos? V260, Y262 e W346 na α-tubulina, aumentando as interacções entre β-tubulina e α-tubulina. Hélice 11 está localizado na interface de α-tubulina e dímero β-tubulina. Em conclusão, o estudo de modelagem computacional indica que as mutações de tubulina em KB-
L30
células pode aumentar a montagem de microtúbulos e estabilidade.
KB-
L30
células apresentam maior montagem de microtúbulos e reduziu dinâmica dos microtúbulos
Para determinar se a estabilidade e dinâmica de microtúbulos em KB-
células L30
foram afetados por mutações no βI-tubulina como predicado pela análise computacional, análise de Western blot foi realizada. Aqui, a análise de mancha de Western revelou que a quantidade tanto peletes α- e β-tubulina presentes na KB-
L30
células foram aumentados quando comparados com as suas células KB parentais (Figura 6A). Em contraste, a forma solúvel de β-tubulina presente em KB-
L30
células foi diminuída em comparação com a de células KB (Figura 6A). imunofluorescência também foi usado para apoiar ainda mais o resultado acima. Os microtúbulos foram marcadas com o anticorpo anti-tubulina β Rodamina-conjugado e as células foram visualizadas ao microscópio. KB-
L30
células parecem ter maior teor de microtúbulos, em comparação com as células KB (Figura 6B). Além disso, a utilização de microtúbulos de-estabilizador, BPR0L075, foi capaz de reduzir o teor de microtúbulos em KB-
L30
células (Figura 6B). Tomados em conjunto, os nossos resultados sugerem que KB-
L30
células exibiram aumento da montagem de microtúbulos.
A quantidade de α- solúvel e insolúvel e β-tubulina em KB e KB-
L30
células foi analisada por Western blotting. Actina foi utilizado como um controlo de carga (A). A integridade das redes de microtúbulos em KB e KB-
células L30
foi mostrado por microscopia de imuno-fluorescente. As células foram sondadas com anticorpo anti-tubulina β (B). dinâmica dos microtúbulos em células foram analisadas por análise de Western blot. -Acetilado α-tubulina foi utilizada como um indicador indirecto da dinâmica dos microtúbulos e a quantidade de acetilada-α-tubulina foi analisada em BPR0L075 e células KB tratados com paciltaxel por Western blotting. Alfa-tubulina (forma total) foi utilizado como controlo de carga (C). A quantidade do α-tubulina-acetilado endogenamente em KB e KB-
células L30
foi analisada por Western blotting. Alfa-tubulina (forma total) foi utilizado como controlo de carga (D).
instabilidade dinâmica de microtúbulos é caracterizado por transições abruptas estocásticos entre as fases de extensão e de encurtamento. Ao nível molecular, o aumento da acetilação α-tubulina é considerado como um marcador da dinâmica reduzida de microtúbulos. Aqui, a análise de mancha de Western revelou que a quantidade de acetilada α-tubulina foi diminuída em células KB BPR0L075 incubados, de um modo dependente da concentração (Figura 6C). Em contraste, a quantidade de acetilada α-tubulina foi aumentada em células incubadas com paclitaxel (Figura 6c). Microtúbulos desestabilizador foi achado na indução de funcionamento dinâmico dos microtúbulos instabilidade e estabilizador de microtúbulos foi encontrada a funcionar na redução da instabilidade dinâmica dos microtúbulos [20], [21]. Assim, a quantidade de acetilada α-tubulina presente nas células pode ser relacionada com a sensibilidade de células a vários compostos anti-mitóticos. Para determinar se KB-
L30
células exibiam reduzidas dinâmica dos microtúbulos, a análise Western blot foi utilizada para determinar o nível de acetilação α-tubulina presente nas células resistentes aos medicamentos. Aqui, a análise de mancha de Western revelou que a quantidade de acetilada α-tubulina foi aumentada em KB-
células L30
, em comparação com as células KB (Figura 6D). Consistente com a previsão do modelo computacional, nossos resultados revelaram que KB-
L30
células exibiram uma estabilização dos microtúbulos reforçada e dinâmica dos microtúbulos reduzidos. Além disso, os nossos dados indicam que a alteração da estabilidade de microtúbulos e dinâmica em KB-
células L30
pode ser causado pela presença de mutada βI-tubulina, resultando na resistência a microtúbulos de-estabilizantes e hiper-sensibilidade a estabilizadores de microtúbulos.
Discussão
compostos anti-mitóticas foram mostrados bem sucedida no tratamento de vários cancros. No entanto, o desenvolvimento de células de resistência a drogas limita as suas eficácias em situações clínicas. Portanto, é importante para determinar o possível mecanismo de resistência aos medicamentos relacionados com a aplicação da terapia anti-cancro da mitose. correlação positiva entre a expressão de proteínas de resistência multi-droga MDR-1, MRP-1 e a indução de resistência a drogas para compostos anti-mitóticos em cancros tem sido amplamente relatado anteriormente [4], [5]. No entanto, a resistência aos medicamentos a compostos anti-mitóticas em células cancerosas é pensado para ser multi-fatorial. Aqui, demonstramos que o BPR0L075 resistente KB-
L30
células não expressam MDR-1 e MRP-1. Mais importante, o estudo identifica novos locais de mutação no exão 4 de βI-tubulina que são capazes de induzir uma resistência ao medicamento a microtúbulos de-estabilizantes e hiper-sensibilidade a microtubule-estabilizadores através de ambas as alterações no local de ligação de drogas e de microtúbulos estabilidade.
Os KB-
L30
células resistentes BPR0L075 utilizados neste estudo parece adquirir suas propriedades resistentes aos medicamentos através de mecanismos /MRP-independentes MDR. Em primeiro lugar, KB-
L30
células não expressavam duas das bombas de efluxo de drogas mais comuns, MDR-1 e MRP-1. Além disso, ao contrário dos inibidores de microtúbulos tradicionais, tais como a vincristina e paclitaxel, BPR0L075 é eficaz na supressão do crescimento de células de ambas as linhas de células de tumor MDR /MRP-positivos e negativos [14].
In vivo
, BPR0L075 mostraram uma potente actividade contra o crescimento de tumores de xenoenxerto de carcinoma gástrico MKN-45, carcinoma cervical humano KB, KB-e derivado P-gp170 /MDR -overexpressing células KB-VIN10 em ratinhos nus [14]. No entanto, BPR0L075 foi ineficaz na indução da morte de KB-
L30
células neste estudo. Portanto, nosso estudo indicou que MDR /MRP não desempenham um papel importante na resistência à microtúbulos de-estabilizadores como BPR0L075, colchicina e vincristina em KB-
L30
células.
Desde MDR e MRP não desempenham um papel importante na indução de resistência a drogas em KB-
L30
células, outros mecanismos de resistência a fármacos devem estar presentes nas células. compostos de ligação à tubulina, tais como vincristina, colchicina e paclitaxel, inibir o progresso de mitose celular através da inibição da formação do fuso mitótico dinâmica durante L
2 /H de fase. Portanto, mutações no alvo da droga, tubulina, podem interferir com a eficácia de compostos anti-mitóticos. De facto, mutações em ambos α- e β-tubulina em células de ovário de hamster Chinês foram mostrados para resultar em resistência à colchicina e vinblastina [8]. Além disso, as mutações no β-tubulina em células de cancro do ovário foram mostrados para resultar em resistência à epotilona e taxanos [22]. Neste estudo, seis novos locais de mutação foram encontrados presente no gene βI-tubulina de KB-
L30
células. Estas mutações correspondem aos aminoácidos de mutações V316D, T372S, S382L, E405K, E432K e G437K. Estes locais de mutação são apresentados no exão quatro regiões em vez do exão um, dois e três que foram previamente identificados [7]. Isto é particularmente importante como mutações no exão quatro em causar resistência ao fármaco anti-mitótico são menos demonstrado quando comparado com o exão 1, 2 e 3. Neste estudo, a sobre-expressão das tubulinas mutantes (continha vários sítios mutados) em células KB reduziu a sensibilidade à droga de microtúbulos composto de estabilização de BPR0L075 em comparação com células transfectadas com vector vazio ou tubulina de tipo selvagem. As pequenas diferenças entre as células transfectadas com o mutante-tubulina e tubulina de tipo selvagem foram, provavelmente, devido à grande quantidade de expresso endogenamente tubulina de tipo selvagem presente nas células KB transfectadas. Transfecção de construções que contêm β-tubulina com mutação diferente único sítio em células KB também foi realizado para determinar se uma mutação único sítio específico no gene era de facto suficiente para causar resistência a drogas para BPR0L075 (dados não mostrados). No entanto, os resultados do nosso estudo revelou nenhuma diferença significativa na sensibilidade ao fármaco entre as células transfectadas com o mutante (mutação no local único) e de tipo selvagem βI-tubulina (dados não mostrados). Este resultado pode, eventualmente, ser explicada pelos seguintes itens: 1) os locais de mutação não foram localizados diretamente sobre a locais de ligação específica de drogas e 2) a estrutura tridimensional do βI-tubulina não foi significativamente alterado por qualquer única mutação site que foi revelado nesta estude. Em vez disso, todos os seis mutações presentes no exão 4 pode juntos contribuem para a alteração de estruturas tridimensionais do βI-tubulina, resultando nas alterações de sensibilidade às drogas em KB-
L30
células.
Com a utilização de modelação computacional, os mutantes em regiões do modelo computacional que previstos foram analisados para comparar com o aumento ou a diminuição das interacções antes e depois de mutações. Em nosso modelo, foram identificados os locais de mutações βI-tubulina e as resultantes mudanças de conformação na proteína βI-tubulina foram predicados com potenciais efeitos sobre a montagem de microtúbulos e estabilidade. De acordo com o modelo computacional, foram observados níveis aumentados de polímeros de tubulina na KB- resistente a BPR0L075
L30
células quando comparados às células parentais sensíveis a fármacos (Figura 6A e 6B). Além disso, o nível de acetilada α-tubulina foi também aumentado em KB-
L30
células (Figura 6D), o que indica que reduzida instabilidade dinâmica dos microtúbulos estava presente nesta linha celular específica. Um papel para níveis de polímero de microtúbulos alterados na resistência de vincristina de leucemia linfoblástica aguda foi demonstrada
in vivo
anteriormente [23]. Além disso, um xenoenxerto de vincristina-resistente com níveis elevados de tubulina polimerizada foi mostrado relativamente sensíveis ao paclitaxel-polimerização de microtúbulos [23]. Além disso, um estudo também relatou que a instabilidade dinâmica dos microtúbulos de células cancerosas A549-T12 paclitaxel-resistentes aumentou significativamente em comparação com as suas células parentais [24]. Deste modo, aumentado a polimerização de microtúbulos e reduzida instabilidade dinâmica causada por mutações tubulina pode representar um mecanismo de sobrevivência contra microtúbulos compostos desestabilizadores. Por outro lado, a polimerização dos microtúbulos melhorada e reduzida instabilidade dinâmica pode melhorar a eficácia dos compostos de estabilização de microtúbulos, tais como o paclitaxel. Na verdade, o nosso estudo publicado demonstrou que a sub-regulação de survivina (IAPs) microtúbulos de-polimerização induzida, resultando no aumento da sensibilidade ao fármaco de células KB a colchicina e BPR0L075 [13]. Além disso, o mesmo tratamento parcialmente restaurada sensibilidade da KB-
L30
células para BPR0L075 através do processo de polimerização de microtúbulos de-[13]. No entanto, a regulação negativa de survivina não afectou a actividade de caspases [13]. Tomados em conjunto, estes resultados indicaram que o equilíbrio entre tubulina polimerizada e não polimerizado pode ser um determinante importante da resposta à quimioterapia com base anti-mitótico.
Também é importante notar que a regulação de βII- e isotipos βIII-tubulina foi observada em KB-
L30
células. A literatura revela que a sobre-expressão de βIII-tubulina induzida paclitaxel e docetaxel-resistência em células de cancro [7], [10], [16]. Elevado nível de expressão βIII-tubulina foi também demonstrado estar associada com a resistência ao paclitaxel e diminuiu a sobrevivência em pacientes com carcinoma de [25]. Curiosamente, um estudo recente do Tseng
et al.
Providenciou uma possível explicação para este fenómeno. Modelos matemáticos e computacionais de seu estudo indicam que microtúbulos de estabilização de agentes, colchincine e seus derivados, ligam-se mais forte ao βIII-tubulina como comparar com outros isotipos beta-tubulina [26]. Assim, as alterações na expressão de βIII-tubulina podem alterar a sensibilidade aos derivados de colquicina que inibem a polimerização de microtúbulos. Portanto, a regulação negativa do βIII-tubulina também pode contribuir para a sua maior sensibilidade ao paclitaxel ea sensibilidade reduzida a colchicina /BPR0L075 em KB-
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células.
Em conclusão, mostramos que as novas mutações no exão 4 de a-tubulina βI induzida resistência a microtúbulos de-estabilizantes e hiper-sensibilidade ao estabilizador de microtúbulos através da alteração na montagem de microtúbulos e dinâmica em células cancerosas. Este relatório indica ainda que as células cancerosas podem alterar a estabilidade e dinâmica das redes de microtúbulos através de vários mecanismos, tais como mutações de tubulina e expressões isotipo diferencial simultaneamente, resultando na terapia do cancro resistente a anti-mitótico. Os resultados deste estudo fornecem informações molecular na selecção de drogas para os doentes com mutações específicas de tubulina e também tem implicações importantes para o desenvolvimento de futuras compostos anti-mitóticos que são capazes de direccionar células cancerosas resistentes a drogas. No entanto, novos estudos são necessários para determinar se estas mutações βI-tubulina específicos podem ser encontrados em amostras clínicas (pós-tratamento) e sua correlação com a resistência aos medicamentos.
Materiais e Métodos
As linhas celulares , anticorpos e reagentes
células de carcinoma oral humana (KB) foram comprados na American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Esta linha celular de cancro específico também foi descrito como um contaminante HeLa pela ATCC. KB e KB-derivados KB-
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células foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, NY), suplementado com 5% de soro fetal bovino, penicilina (100 U /mL), estreptomicina (100 ug /mL) e L-glutamina (0,29 mg /mL), a 37 ° C. Os anticorpos utilizados neste estudo foram: um anticorpo de ratinho anti-αtubulin (Upstate sinalização celular, Lake Placid, NY), um anticorpo de ratinho anti-βtubulin (BD PharMingen, Franklin Lakes, NJ) e um anticorpo anti-actina de murganho (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA).
Estabelecimento da linha celular resistente a BPR0L075-KB derivado
humanas células de carcinoma orais (kb) foram cultivadas em meio RPMI 1640, como descrito anteriormente.