Sumário
macrófagos associados a tumores têm sido mostrados para promover o crescimento do tumor. Eles podem ter uma função obrigatória na angiogénese, invasão e metástase através da libertação de mediadores inflamatórios. A sua presença no cancro do ovário tem sido correlacionada com um mau prognóstico em pacientes com estas. O catiónico humano proteína antimicrobiana-18 (hCAP18) /LL-37 foi originalmente identificada como uma molécula efectora do sistema imune inato. Ele é liberado por células da imunidade inata, como macrófagos, a microorganismos de combate. Estudos anteriores caracterizaram o hCAP18 /LL-37 como um factor de crescimento que foi mostrado para promover a progressão do tumor do ovário. No entanto, o papel hCAP18 /LL-37 tem no desenvolvimento do tumor de ovário promoveu-macrófago e como a sua expressão é controlada no presente contexto permanece pouco compreendido. Aqui, demonstramos em experiências de co-cultura de macrófagos e células de cancro do ovário de um aumento significativo no
In vitro
proliferação e invasividade das células de tumor é observado. Estas propriedades de crescimento e invasão aprimorados correlacionada com hCAP18 /LL-37 indução. HCAP18 /LL-37 de expressão foi reduzido por adição de dois anticorpos neutralizantes, RST2 ou TLR6, bem como inibidores da CYP27B1 ou do VDR. progressão de células de sinalização de vitamina D3 e tumor Além disso, tanto o TLR2 ou anticorpo TLR6 reduzida
in vitro
. A adição de inibidores da CYP27B1 ou VDR revogada TLR2 /6 a expressão induzida por activação de hCAP18 /LL-37 em macrófagos. Knockdown de produziu-tumoral V1 versicam por RNAi nestas células de tumor levou a uma diminuição de indução hCAP18 /LL-37 em macrófagos. Versicam V1 knockdown também inibiu TLR2 e sinalização de vitamina D3, assim como o crescimento e invasividade de essas células tumorais no
In vitro
co-cultura. Em resumo, descobrimos que V1 versicam aumenta hCAP18 /LL-37 expressão em macrófagos através da ativação de TLR2 e mecanismos dependentes de vitamina D subsequentes que promovem a progressão do tumor de ovário
in vitro
.
Citation : Li D, Wang X, Wu JL, Quan WQ, Ma L, Yang, F. et ai. (2013) Tumor-Produzido versicam V1 Melhora hCAP18 /LL-37 Expressão em macrófagos através da ativação de TLR2 e vitamina D3 Sinalização para promover o cancro do ovário Progressão
In Vitro
. PLoS ONE 8 (2): e56616. doi: 10.1371 /journal.pone.0056616
editor: Qiang Wang, Cedars-Sinai Medical Center, Estados Unidos da América
Recebido: 03 de julho de 2012; Aceito: 15 de janeiro de 2013; Publicação: 12 de fevereiro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Li et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China concede (81272603); Programa de Pesquisa da Comissão de Ciência e Tecnologia de Putuo District, Shanghai (PTKW09-B02). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
um microambiente tumoral desempenha um papel crítico na iniciação e promoção do tumor. Este microambiente única contém células imunes inatas, linfócitos e do tecido conjuntivo bem como células malignas [1]. células imunitárias inatas (também conhecidas como células mielóides), incluem macrófagos, liberam citocinas e quimiocinas, bem como a influência tumorigênese [1] – [3]. macrófagos associados a tumores (TAMs) são um componente importante de infiltrados inflamatórios em tumores. TAM são derivadas de precursores monócitos circulantes por quimioatractivos, secretado por ambas as células tumorais e estromais [4], [5]. Os estudos clínicos continuam a demonstrar uma correlação entre uma alta populações de TAMs um mau prognóstico no ovário, mama, próstata, pulmão e cânceres cervicais [6] – [8]. Existe um crescente corpo de evidência que vários factores pró-inflamatórios produzidos por macrófagos, promover o crescimento do tumor, angiogénese, invasão e metástase [1], [5], [9]. No entanto, o papel efectivo um número de moléculas pró-inflamatórias têm chave na promoção do tumor e os seus mecanismos de expressão e função permanece pouco compreendido.
O humana catiónica antimicrobiana proteína-18 (hCAP18) /LL-37 é a péptido único conhecido catelicidina em seres humanos [10]. HCAP18 /LL-37 é constitutivamente produzido em numerosos tipos de células incluindo macrófagos, neutrófilos, células epiteliais da pele da pele, trato gastrointestinal e do trato urinário, pelo epidídimo e pelas células epiteliais respiratórias [11], [12]. O gene HCAP18 consiste de 3 domínios: região do péptido de sinal N-terminal, o domínio semelhante a catelina altamente conservados e a região C-terminal do péptido denominado LL-37 [13]. O péptido de LL-37 é mantida na sua forma de pró-péptido, até a clivagem por protease 3 apenas antes da secreção [14], [15]. O péptido-LL 37 serve várias funções diferentes em reacções imunes, incluindo a modulação imunológica, reacção inflamatória, proliferação celular, angiogénese, e a actividade anti-apoptótica [16]. LL-37 foi estabelecida como um contribuinte para tumorigênese e progressão do tumor [16], [17]. Estudos têm demonstrado em cancros do ovário LL-37 contribui para a proliferação celular, invasão e progressão do cancro através da estimulação directa de células tumorais, o início da angiogénese e recrutamento de células imunitárias [14], [18], [19]. O tratamento com um sintético, um péptido biologicamente activo LL-37 ou expressão transgénica LL-37 aumenta significativamente a proliferação de células de tumor do pulmão. Esta pesquisa sugere que LL-37 atua como fator de crescimento para o cancro do pulmão humano [20]. Além disso, LL-37 é também considerada para aumentar a proliferação e metástase em tumores da mama e melanomas malignos [21], [22]. Em conjunto, estes resultados suportam a hipótese de que a LL-37 funções de um fator de crescimento em células transformadas.
Uma variedade de estímulos, incluindo moléculas pró-inflamatórias, fatores de crescimento, nutrientes, produtos bacterianos, e especialmente a inflamação e lesão up expressão -regulate de hCAP18 /LL-37 [16]. Nos seres humanos a 1,25-di-hidroxivitamina D3 (1,25D3) regula positivamente a expressão de hCAP18 /LL-37 através do receptor de vitamina D (VDR) em monócitos, macrófagos, kerationocytes na epiderme [23], [24]. Pesquisas anteriores que incidiu sobre intracelular
Mycobacterium tuberculosis
demonstraram activação TLR2 em macrófagos humanos expressão de VDR e genes CYP27B1-regulada. Esta cascata de acontecimentos aumenta a produção de 1,25D3, o que por sua vez leva à indução de hCAP18 /LL-37 [24]. Estudos recentes sobre o microambiente do tumor demonstraram factores de carcinoma de pulmão de Lewis (LLC), células produzidas como versicano, são necessários para o crescimento do tumor de pulmão e metástase. Além disso, este processo é dependente da activação da célula mielóide TLR2-mediada [25], resultando na activação de NF-kB dos factores inflamatórios TNFa, IL-6 produção [26], [27].
O objectivo deste estudo é investigar os mecanismos de regulação do hCAP18 /LL-37 no microambiente tumoral. Aqui relatamos a V1 versicam derivada a partir de células tumorais aumenta hCAP18 /LL-37 de expressão em macrófagos por meio da activação de TLR2 e mecanismos dependentes de vitamina D subsequentes. Além disso, é desta cadeia de eventos de sinalização celular que promove a proliferação de células de tumor de ovário e invasão. Estes resultados propor novo mecanismo para hCAP18 /LL-37 regulação no microambiente do tumor. Além disso, eles fornecem insights sobre os fatores críticos envolvidos na progressão do câncer.
Materiais e Métodos
As linhas celulares e reagentes
As linhas de células de cancro do ovário humanos OV-90 e SKOV3 as células foram obtidas a partir da American Type Culture Collection, e outras linhas celulares de cancro do ovário humano HO-8910, as células foram adquiridos a 3AO Shanghai Institute of Cell Biology, Academia chinesa de Ciências. Estas células foram cultivadas em meio Eagles Modificado da Dulbecco (DMEM) (laboratórios Hyclone. Inc, sul, Utah, EUA) suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (FCS) (Invitrogen, Grand Island, NY, EUA), 100 U /mL de penicilina , e 100 U /mL de estreptomicina (Hyclone laboratórios. Inc). As culturas de células foram realizadas a 37 ° C em ar humidificado com 5% de CO
2. FCS foi substituído com 10% de soro inativado pelo complemento humano (HS) (obtido a partir do banco de sangue do Hospital Tongji, da Universidade de Tongji. Aprovação institucional dos comitês de ética em pesquisa local (revisão interna e dos Conselhos de Ética do Hospital Tongji, Universidade Tongji ) foi obtido antes da realização do presente estudo) 24 horas antes da experiência. Anticorpo neutralizante anti-hCAP18 /LL-37 (2 ug /mL, clone # mAb 3D11, Hycult biotecnologia, Holanda), anti-TLR2 (10 ug /ml, o clone # mAb 383936, R D Systems, Minneapolis, MN, EUA ), anti-TLR6 (10 ug /ml, o clone # mAb C5C8, Invivogen, San Diego, CA, EUA) e o itraconazol inibidor CYP27B1 (10
@ 7 M, Sigma Aldrich, St. Louis, MO) ou antagonista VDR ZK159222 (10
-7 M, um presente da Schering AG, Berlim, Alemanha) foram adicionados como indicado 2 horas antes da co-cultura ou outro estímulo. TLR2 ligando /6 Pam2CSK4 foi obtido a partir de Invivogen. 25D3 (a 25-hidroxivitamina D3, o precursor 1,25D3) foi comprado (Biomol, Plymouth Meeting, PA, EUA) e ressuspensas em etanol a 10
-2 M em tubos âmbar e armazenou-se a -80 ° C em pequenas alíquotas.
Geração de humanos do sangue periférico macrófagos derivados de monócitos
foi obtida a aprovação institucional dos comitês de ética em pesquisa local (revisão interna e dos Conselhos de ética do Hospital Tongji, Universidade Tongji) antes realização do estudo. macrófagos derivados de monócitos do sangue periférico humano foram geradas como previamente descrito [28]. Resumidamente, as células mononucleares de sangue periférico (PBMC) de doadores de sangue saudáveis do banco de sangue do Hospital da Universidade de Tongji Tongji foram isoladas a partir de crostas inflamatórias através de Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare, Uppsala, Suécia) de centrifugação de densidade. As PBMC foram deixadas aderir a frascos de cultura durante 1 h a 37 ° C em DMEM suplementado com 1% de soro humano, após o que as células não aderentes foram removidas por lavagem vigorosa com PBS. As células aderentes foram cultivadas em 20 ml de DMEM (FCS a 10%) suplementado com 50 ng /ml de factor de estimulação de colónias de macrófagos (M-CSF) (eBioscience, San Diego, CA, EUA) durante 7 dias para permitir a diferenciação para macrófagos.
Coculturing células de cancro do ovário e macrófagos
Para estudos de co-cultura com células cancerosas e macrófagos, células de cancro foram semeadas no fundo de placas multi-poços de cultura de células e macrófagos foram colocados em inserções Transwell (0,4 mm, Corning Incorporated, Corning, NY, EUA) com uma membrana permeável em relação aos líquidos, mas não para as células. As células foram incubadas durante a noite em DMEM suplementado com 10% de soro humano. As transwells foram inseridos dentro da cavidade de multi-poço da placa de cultura e cultivados durante o tempo indicado.
O número de células contagem
macrófagos derivados de monócitos (1 × 10
4 células) e cancro células (1 × 10
4 células) foram semeadas em placas de 24 poços trans poços ou de cultura de células e as placas incubadas durante a noite. As células foram co-cultivadas durante 4 dias e, em seguida, inserções Transwell (contenha macrófagos) foram removidos, as células cancerosas foram colhidas por tripsinização e contadas com um hemocitómetro (Beckman Coulter, Fullerton, CA, EUA).
ensaio de proliferação celular ELISA BrdU
proliferação de células de cancro do ovário, foi determinada utilizando a proliferação celular ELISA comercialmente disponível, BrdU (colorimétrica) Kit (Roche, Mannheim, Alemanha). Após 4 dias de co-cultura com macrófagos, inserções Transwell (contêm macrófagos) foram removidos, e os sobrenadantes de células de tumor foram aspirados e foram adicionados 400 ul /poço de meio de crescimento contendo 10 uM de BrdU. As células foram incubadas durante 2 horas adicionais, a 37 ° C. Rotulagem meio foi removido tocando fora e as células foram fixadas por adição de 200 ul de FixDenat. solução FixDenat foi completamente removido batendo. 400 ul de solução de trabalho /poço de anti-BrdU-POD foi adicionado e as células foram incubadas durante 90 min à temperatura ambiente. O conjugado de anticorpo foi removido por desligando e os poços foram lavados 3 vezes com PBS. Depois disso, foram adicionados 400 ul /poço de uma solução de substrato e a solução foi incubada à temperatura ambiente durante 5-30 min. 200 ul 3N H
foi adicionado 2SO
4 a cada poço e as placas foram incubadas durante 1 min sobre o agitador. A absorvância foi medida usando leitor de ELISA a 450 nm.
ensaio de invasão
ensaio de invasão foi realizada utilizando um BD BioCoat Matrigel Invasão Secção (BD Biosciences, Bedford, MA, EUA) com um 8 uM tamanho dos poros da membrana de PET, uniformemente revestidas com Matrigel BD matriz como descrito [18], [29]. células cancerosas privadas de soro foram adicionadas à câmara superior a uma densidade de 1 × 10
4 células por poço. 1 × 10
4 macrófagos foram colocados dentro da câmara inferior. Câmara estava cheia de DMEM mais 10% HS. No tempo indicado, as células aderentes na parte inferior da membrana foram removidos e sedimentadas por centrifugação. O sedimento celular foi resolvido em 100 ul de PBS e centrifugadas nas lâminas. Após secagem ao ar, os citospinas foram coradas com 5 mL de DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA). células que migraram por campo de alta potência foram determinadas por microscopia de fluorescência.
SKOV3 ou meio condicionado de macrófagos
O meio condicionado foi colhido a partir de células SKOV3 ou macrófagos humanos derivados de monócitos do sangue periférico incubadas em DMEM isento de soro durante 24 h, e filtrada através de um filtro de 0,2 um. SKOV3 amostras de meio condicionado (CM) SKOV3-foram adicionados aos macrófagos primários humanos por 24 h, depois do que vários genes de expressão foram ensaiadas. Macrófagos meio condicionado (CM-M) foram adicionados às linhas de células de cancro do ovário humano, durante 24 h, e os sobrenadantes das células foram medidas por ELISA para V1 versicano.
transdução celular
Log células SKOV3 crescimento eram lavou-se uma vez com PBS e ressuspensas a 2 x 10
7 células /ml em 1 ml de Gene Pulser reagente tampão de electroporação (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA), misturado com 20 ug de plasmídeos versican V1 ARNi ou simulada plasmídeos de ARNi (ambos da OriGene Technologies, Inc., Rockville, MD, EUA). Electroporações foram efectuadas utilizando um Gene Pulser-(Bio-Rad) a 280 V e 960 uF na cuvete de 0,4 cm (Bio-Rad). As amostras foram transferidas para frascos de cultura contendo meio DMEM completo With10% de FCS em 25 cm
2 e incubadas a 37 ° C em 5% de CO
2. 48 horas mais tarde, o meio de crescimento foi alterado e puromicina (Invitrogen) foi adicionado a uma concentração de 5 ug /ml. O meio de cultura foi mudado a cada 4 dias com o meio de crescimento fresco (contendo 5 ug /ml de puromicina). Após 4 semanas, foram identificadas populações positivas policlonais (pools) com base na análise de Western blot para expressão V1 versicano. Os clones positivos individuais foram eventualmente isolados por diluição limitante análise em placas de 96 poços.
blotting
análise de Western blot de Western foi realizada como descrito anteriormente [30]. Resumidamente, 30 ug extractos de proteína total foram carregados em géis de 10% SDS-poliacrilamida, submetido a electroforese, e transferidas para membranas Hybond C extra-(Amersham Bioscience, Buckinghamshire, Reino Unido). Os sobrenadantes das células foram concentrados primeiro a 1/10 do seu volume inicial por centrifugação a vácuo e, em seguida, submetido a 4-12% de gel de gradiente de Nu /PAGE (Invitrogen). Os anticorpos primários incluíram: Coelho V1 anti-versicam (1:1000; Abcam, Cambridge, UK) e de coelho anti-hCAP18 /LL-37 (1:500; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA), anti-rato β-actina (1:10000; Sigma Aldrich, Steinheim, Alemanha). Conjugado com HRP de cabra anti-coelho (1:5000; Santa Cruz Biotechnology) ou de coelho anti-rato (1:1000; Dako, Glostrup, Dinamarca) foram utilizados como anticorpo secundário
isolamento do ARN e em tempo real. PCR
Celulares RNAs totais foram preparadas com RNeasy além de mini-kit (Qiagen, Santa Clarita, CA, EUA) de acordo com a recomendação do fabricante. tempo real misturas reaccionais de PCR foram descritos anteriormente [28]. Resumidamente, o ADNc foi sintetizado por reacção de transcrição reversa utilizando o estojo de síntese de primeira cadeia de ADNc (Invitrogen). PCR em tempo real foi realizado utilizando o QPCR SYBR Green Mix (Bio-Rad) em tempo real de uma máquina de PCR sistema AB 7300 (AB Applied Biosystems, Singapura). Foram utilizados os seguintes iniciadores de PCR: β-actina, 5′- AGCCTCGCCTTTGCCGA-3 ‘e 5′-CTGGTGCCTGGGGCG-3′; hCAP18 /LL-37, 5’-TGGGCCTGGTGATGCCT-3 ‘e 5′-CGATGTTCCTTCGACAGGAAGC-3′; VDR, 5’-AAGGACAACCGACGC CACT-3 ‘e 5′-ACACACCTGTAGCCGTACTA-3′; CYP27B1, 5’-ACCCGACAC GGAGACCTTC-3 ‘e 5′-CACAGGTGCGACAACTGGTA-3′; Cpy24, 5’-CGCAG CGGCTGGAGAT-3 ‘e 5′-ATGGCGTTTCTTCCGATGCC-3′; TLR1, 5’-AACCC ATTCCGCAGTACTCCA-3 ‘e 5′-AAGGCCACGTTTGCTCTTTTC-3′; TLR2, 5’-CAATGATGCTGCCATTCTCAT-3 ‘e 5′-ATTATCTTCCGCAGCTTGC A-3′; TLR3, 5’-ACAACTTTAGCACGGCTCTGGA-3 ‘e 5′-ACCTCAACTGGGATC TCGTCA-3′; TLR4, 5’-AGTTTCCTGCAATGGATCAAGG-3 ‘e 5′-CTGCTT ATCTGAAGGTGTTGCAC-3’; TLR6, CCCATTCCACAGAACAGCAT-3 ‘e 5′-A TAAGTCCGCTGCGTCATGA-3′; CD14, 5’-TGTGAGCTGGACGATGAAGAT-3 ‘e 5′-CAGACACACACTGGAAGGCTT-3’. Especificidade de RT-PCR foi controlada por controlos “não transcrição inversa” e análise de curva de fusão. Os resultados da PCR quantitativas foram obtidas usando o método ΔΔCT (limiar de ciclo). Os dados foram normalizados para níveis de p-actina em cada amostra.
ensaio ELISA para versicam
As amostras de sobrenadantes de cultura de células foram analisados por ELISA versicam ciências da vida (USCN humano, INC. De Houston, TX, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. O limite de detecção do ensaio foi de 0,107 ng /mL.
A análise estatística
Os valores são apresentados como média mais ou menos SEM. As comparações entre os grupos foram analisadas pelo teste t (frente e verso). Foram considerados resultados estatisticamente significativos para valores de p inferior a 0,05.
resultados
A expressão de hCAP18 /LL-37 em macrófagos promover a proliferação e invasão de células de cancro do ovário
TAM substituídos por macrófagos derivados de monócitos do sangue periférico para
in vitro
experiência de co-cultura tinha sido relatado por vários grupos. Estes relatórios indicam que os macrófagos derivados de monócitos do sangue periférico têm função equivalente à MAT [27], [31]. Para determinar o efeito sobre a proliferação de macrófagos as células cancerosas do ovário, Transwell inserções foram utilizados como um modelo de co-cultura. macrófagos derivados de monócitos do sangue periférico humano foram colocadas em inserções Transwell e várias linhas celulares de cancro do ovário foram semeadas no fundo de placas de 24 poços. As células co-cultura foram cultivadas durante 4 dias de co-cultura em DMEM contendo 10% de HS ou de tratamento com o EGF, como um controlo positivo. O crescimento de HO-8910, OV-90, células SKOV3, e 3AO foram significativamente aumentadas quando co-cultivadas com macrófagos humanos derivados de monócitos do sangue periférico (Fig. 1a). Para evitar hCAP18 /LL-37 monócitos foram pré-tratados de função com um anticorpo neutralizante hCAP18 /LL-37 antes da co-cultura com células de cancro do ovário. Em experiências em que os monócitos foram pré-tratados com o anticorpo neutralizante hCAP18 /LL-37 uma inibição significativa de HO-8910 co-cultura, OV-90, foi observada SKOV3, e 3AO crescimento de células (Fig. 1A). A inibição do crescimento celular foi observado nas experiências de co-cultura de anticorpo de controlo IgG1 (Fig. 1a). Para avaliar o crescimento do ovário células cancerosas induzida por macrófagos de incorporação de BrdU nas cadeias de ADN recém-sintetizadas medidos utilizando anticorpos anti-BrdU em um ensaio ELISA. Consistente o aumento observado na proliferação celular, síntese de DNA em HO-8910, OV-90, células SKOV3, e 3AO foi notavelmente aumentada quando as células foram co-cultivadas com macrófagos (Fig. 1B). Como esperado, a adição do anticorpo neutralizante hCAP18 /LL-37 reduziu o efeito do macrófago na proliferação de células do cancro do ovário (Fig. 1B). Em seguida, células de cancro do ovário, foi investigada a invasão. Estes capacidade das células para invadir inserções Matrigel-revestidas também foi significativamente melhorada por macrófagos (Fig. 1C, D). Depois de meios de co-cultura foi tratada com o anticorpo neutralizante PACS /LL-37, que a invasão de células de tumor significativamente atenuado (Fig. 1C, D). Estes resultados sugerem um papel direto para PACS /LL-37 na promoção da invasão de células tumorais. Um anticorpo de controlo IgG de não interferir com a invasão de células do cancro do ovário (Fig. 1C, D). Tomados em conjunto, estes dados sugerem que é necessária hCAP18 /LL-37 para a proliferação induzida por macrófagos e invasão de células de cancro do ovário.
Para as experiências de co-cultura de células de cancro do ovário com macrófagos, monócitos do sangue periférico humano derivado os macrófagos (1 × 10
4 células) foram colocados em inserções Transwell e células de cancro do ovário (1 × 10
4 células) foram semeadas no fundo de placas de 24 poços. As células foram pré-incubadas com 2 ug /mL de anti-hCAP18 /LL-37 ou um controlo de isotipo de IgG1 Ab (2 ug /ml) durante 2 h. As células foram co-cultivadas em DMEM (10% HS) durante 4 dias. 100 ng /ml de EGF (Sigma, Steinheim, Alemanha) foi utilizado como controlo. (A) A proliferação de células de cancro do ovário foi medida por contagem do número de células. proliferação (B) celular foi medida por ELISA (marcação com BrdU) análise. ensaio (C) invasão. Os ensaios de invasão foi realizada utilizando um BD BioCoat Matrigel Invasão câmara com uma membrana de tamanho de poro de 8 um de PET, uniformemente revestidas com Matrigel BD matriz. Os resultados são médias ± SEM, diferença significativa, n = 3, * P 0,05. ensaio de invasão (D) Matrigel de SKOV3. a coloração DAPI de células tumorais migraram. As secções representativas são mostrados (um) SKOV3 nenhum tratamento. (B) SKOV3 + macrófagos. (C) SKOV3 macrófagos + + neutralizante anti-hCAP18 /LL-37 (2 ug /ml). (D) SKOV3 macrófagos + + controle Ab de isotipo de IgG1 (2 ug /ml). (E) SKOV3 + EGF (100 ng /ml).
As células tumorais desencadear a activação de vitamina D3 e TLR2 sinalização e regulação da hCAP18 /LL-37 em macrófagos
Para cima investigar o padrão de hCAP18 /LL-37 expressão, os macrófagos humanos foram co-cultivadas com células SKOV3. A indução de hCAP18 /LL-37 ARNm (Fig. 2A) e de proteína (de comprimento completo hCAP18 /LL-37 e clivado LL-37, Fig. 2B), os níveis aumentados em macrófagos. Por outro lado, não houve diferenças significativas na hCAP18 /LL-37 ARNm ou níveis de pró-péptido observada em células SKOV3 (Fig. 2A, B). N, maduro LL-37 não foi detectado nas células SKOV3 (Fig. 2B). Estes resultados indicaram que os macrófagos e células SKOV3 não contribuir para a libertação do péptido de LL-37. Para avaliar o nível de hCAP18 /LL-37 e clivado LL-37 na forma de células, foi realizada transferência Western em sobrenadantes de células após 24 h de co-cultura. Um aumento significativo nos níveis de o precursor e péptido clivado foi observada em comparação com os macrófagos ou células SKOV3 (Fig. 2C).
macrófagos derivados de monócitos do sangue periférico humano e células SKOV3 foram coincubated como descrito na Figura 1 . Os ARNs totais e proteínas de células SKOV3 e macrófagos foram isolados 24 h após a co-cultura. (A) A expressão de hCAP18 /LL-37 ARNm foi medido por PCR em tempo real. (B) A expressão de proteína hCAP18 /LL-37 foi analisada por Western blot. β-actina serviu como controlo de carga. (C) transferência de Western de sobrenadantes de células a partir de células SKOV3, macrófagos, e de co-cultura a 24 h. (D, E) A indução de VDR, CYP24, CYP27B1, TLRs e ARNm de CD14 foi medida em macrófagos por PCR em tempo real. Os resultados são a mudança de dobragem média ± SEM, diferença significativa, n = 3, * P 0,05; ns, não significativo.
Dada a VDR foi relatado para mediar a expressão de hCAP18 /LL-37 [23], [24] Nós investigamos se a expressão de VDR e genes relacionados são induzidas durante co-cultura. De facto, um aumento nos níveis de ARNm de VDR foi observado quando os macrófagos foram co-cultivadas com células SKOV3 (Fig. 2D). Além disso, a enzima catabólica 1,25 D3 CYP24 (também conhecido como Cyp24A1) foi induzida em macrófagos quando foram co-cultivados com células tumorais. CYP27B1, que catalisa a conversão da pró-vitamina D3 hormona inactiva (25D3) na forma bioactiva (1,25D3) [24], os níveis de mRNA foram igualmente sobre-regulada no modelo de co-cultura (Fig. 2D). Tem sido relatado que a activação de TLR2 leva a indução dependente de vitamina D de hCAP18 /LL-37 em macrófagos [32]. TLR2, 6 e mRNA CD14 níveis todos mostraram o aumento esperado em macrófagos co-cultivadas. Os níveis de TLR1, TLR3, e TLR4 expressão não foram alteradas nestas células de macrófagos (Fig. 2E).
indução mediada por células do cancro do ovário da hCAP18 /LL-37, VDR, CYP24, e CYP27B1 em macrófagos é dependente de TLR2 e TLR6
a seguir, procuraram determinar se a indução de hCAP18 /LL-37 era dependente de indução TLR2. macrófagos humanos derivados de monócitos do sangue periférico foram incubados durante 2 h com um anticorpo neutralizante de TLR2 ou um anticorpo de controlo de isotipo IgG1, em seguida estimuladas durante 24 h em meio condicionado de células SKOV3 (SKOV3-cm), com 10% de HS. Em células de macrófagos tratados com o anticorpo neutralizante TLR2 foi observada uma redução significativa no hCAP18 /LL-37 indução, foi observado nenhum efeito significativo sobre a indução de genes em amostras tratadas anticorpo de controlo (Fig. 3A). Para determinar se a indução de VDR, CYP24, e CYP27B1 também foi influenciado pela exposição ao anticorpo neutralizante TLR2, os níveis de ARNm foram medidos. As amostras expostas ao anticorpo sameTLR2 demonstrou nenhuma indução de VDR, CYP24, ou CYP27B1, novamente sem inibidor influências foram observados nas amostras de controlo de anticorpo de IgG (Fig. 3B-D). Estas experiências foram repetidas utilizando um anticorpo TLR6 neutralizantes, foi observado o mesmo padrão de inibição, com indução de hCAP18 /LL-37, VDR, CYP24, e CYP27B1 sendo bloqueado nas amostras de anticorpo TLR6, mas não no grupo de controlo (Fig. 3A -D). Combinando anticorpos neutralizantes TLR2 e TLR6 oferecida a possibilidade de um efeito sinérgico inactivação destes genes (Fig. 3A-D). Estes dados indicam a indução mediada por tumor de hCAP18 /LL-37 requer a actividade de TLR2 /6 em macrófagos. Este mecanismo de indução se acredita estar envolvido na sinalização de vitamina D3. Em mais apoio do nosso modelo, a adição de anticorpos contra a RST2 ou TLR6 neutralizantes suprimiu significativamente a proliferação das células SKOV3 e invasividade (Fig. 4A, B). Combinando TLR2 e TLR6 anticorpos neutralizantes resultou num efeito sinérgico na inibição de progressão de células SKOV3 (Fig. 4A, B). Estes resultados indicam a activação de TLR2 ou TLR6 é necessário para a progressão de células de tumor.
macrófagos humanas foram pré-incubadas com 10 ug /ml de anti-TLR2, 10 ug /ml de anti-TLR6 ou um anticorpo de controlo de isotipo de IgG1 (10 ug /ml) durante 2 h. Em seguida, os macrófagos foram cultivadas com DMEM (10% HS) ou SKOV3-CM (10% HS) durante 24 h, e ARNs totais foram extraídos por ensaio de PCR em tempo real. (A) hCAP18 /LL-37 ARNm. (B) mRNA VDR. (C) ARNm CYP24. (D) CYP27B1 ARNm. A alteração média ± SEM de dobragem, n = 3, * P . 0,05
macrófagos derivados de monócitos do sangue periférico humano e células SKOV3 foram pré-incubadas com 10 ug /ml de anti-TLR2, 10 ug /ml de anti -TLR6 ou com um controlo do isotipo de IgG1 Ab (10 ug /ml) durante 2 h. As células foram co-cultivadas em DMEM (10% HS) durante 4 dias. 100 ng /ml de EGF foi usada como controlo. (A) O número de células, proliferação e invasão de células SKOV3 foram medidos. A alteração média ± SEM de dobragem, n = 3, * P 0,05. ensaio de invasão (B) Matrigel de SKOV3. a coloração DAPI de células tumorais migraram. As secções representativas são mostrados como indicado. (A) nenhum tratamento SKOV3. (B) SKOV3 + macrófagos. (C) SKOV3 macrófagos + + neutralizante anti-TLR2. (D) SKOV3 macrófagos + + neutralizante anti-TLR6. (E) SKOV3 macrófagos + + neutralizante anti-RST2 e anti-TLR6. (F) SKOV3 + macrófagos + controlo de isotipo IgG1 Ab. (G) SKOV3 + EGF (100 ng /ml).
expressão TLR2 /6 mediada de hCAP18 /LL-37 via CYP27B1 e VDR ativação
A bioconversão depende CYP27B1 de 25D3 para 1,25D3 é uma característica fundamental da vitamina hCAP18 /LL-37 expressão mediada por D [33]. Para determinar se a activação induzida por tumores de TLR2 /6 melhorada bioactividade da CYP27B1, conduzindo assim a hCAP18 /LL-37 expressão, os macrófagos foram expostos a TLR2-TLR6 ligando Pam2CSK4, na presença e na ausência de meios de 25D3 (DMEM sem soro ). Expressão de hCAP18 /LL-37 não foi influenciado quando expostos a 25D3 ou Pam2CSK4 independentes uns dos outros. No entanto, hCAP18 /LL-37expression foi induzida após exposição simultânea (Fig. 5A). Além disso, a inibição da CYP27B1 por itraconazol bloqueado TLR2 6 activação /e um aumento subsequente níveis inhCAP18 /LL-37 ARNm (Fig. 5A). A adição do antagonista de VDR ZK159222 também inibiu a indução de hCAP18 /expressão LL-37, tal como determinado pelos níveis de ARNm (Fig. 5A). A seguir, co-cultivadas macrófagos primários e SKOV3-CM (sem soro) na presença de uma gama de concentração, 25D3 e níveis de hCAP18 /LL-37 ARNm foram medidos por qPCR. Numa outra experiência de macrófagos /co-cultura SKOV3-CM a adição de 25D3 aumentou significativamente os níveis de hCAP18 /LL-37 mRNA de uma forma dependente da dose (Fig. 5B). É digno de nota que SKOV3-CM sem HS não induziu a expressão de hCAP18 /LL-37 (Fig. 5B) por causa da insuficiente de vitamina D em meio de cultura [24], [33]. Esses resultados, portanto, sugerem que a ativação induzida por tumor de TLR2 /6 em macrófagos humanos desencadeia hCAP18 /LL-37 expressão. Além disso os dados apoia esta a regulação é dependente do CYP27B1 e VDR mediada produção endógena de 1,25D3
.
(A) macrófagos humanos foram pré-tratados com o VDR antagonista ZK159222 (10
-7 M) ou o itraconazol antagonista CYP27B1 (10
-7 M) durante 2 horas e depois estimuladas com ligando TLR2 6 /Pam2CSK4 (100 ng /ml) na presença ou ausência de 25D3 (10
~ 6 M) (DMEM, sem soro) durante 24 h. Expressão de hCAP18 /LL-37 ARNm foi determinada como descrito na Figura 3. (B) Regulamento de hCAP18 gene /LL-37 na estimulação com 25D3 em DMEM (sem soro) ou SKOV3-CM (sem soro). Alteração média vezes ± SEM, n = 3, * p . 0,05
V1 versicam secretado-Tumor ativa TLR2 e TLR6 para induzir a expressão hCAP18 /LL-37 em macrófagos
Como indicado acima, a co-cultura de macrófagos /células SKOV3 activado TLR2 /6 e, assim, aumentou hCAP18 /LL-37 de expressão em macrófagos. Estes resultados sugerem que factores solúveis indeterminados produzidos pelas células SKOV3 mediar este processo. Kim et al. demonstrou que V1 versicam, um ativador de macrófagos que age através de TLR2 e seus co-receptores TLR6 e CD14, está-se regulamentada em muitos tumores humanos, incluindo o cancro do ovário e cancro do pulmão, e aumenta de pulmão crescimento tumoral metastático [25]. Para determinar se V1 versicam poderia ser o factor responsável solúvel para o /6 activação TLR2 observado aqui que examinaram os níveis de expressão V1 versican em células tumorais co-cultivadas com os macrófagos. Figura 6A mostrou a expressão da proteína V1 versicam foi aumentada em lisados celulares totais de células SKOV3, HO-8910, OV-90, e as células 3AO quando co-cultivadas durante 24 h. Para investigar o nível de secreção V1 versicam a partir de células do tumor dos ovários que incubadas SKOV3, HO-8910, OV-90, e as células 3AO com meio condicionado de macrófagos (M-CM) durante 24 h. Os ensaios de ELISA foram realizados para determinar a presença de V1 versicam segregada no meio celular.