Abstract

O câncer de bexiga (BCA) é um tumor maligno comum em todo o mundo e tem uma alta probabilidade de recorrência após o diagnóstico e tratamento inicial. Como resultado, a vigilância recorrente, envolvendo principalmente cistoscopias repetidas, é um componente crítico da gestão pós diagnóstico do paciente. Desde cistoscopia é invasivo, caro e um possível impedimento para a adesão do paciente com exames periódicos de acompanhamento, novas tecnologias não invasivas para ajudar na detecção de doença recorrente e /ou cancro primário da bexiga são fortemente necessário. Neste estudo, metabolômica com base espectrometria de massa foi utilizada para identificar assinaturas bioquímicos na urina humana que diferenciam o cancro da bexiga de controles não-cancerosas. Mais de 1000 compostos distintos foram medidos incluindo 587 compostos nomeados de identidade química conhecida. identificação de biomarcadores inicial foi conduzida usando um conjunto de amostras 332 objecto de amostras de urina retrospectivos (coorte 1), que incluiu 66 amostras positivas BCa. Um conjunto de 25 candidatos a biomarcadores foi selecionada com base em significância estatística, diferença vezes e cobertura via metabólica. Os 25 candidatos a biomarcadores foram testados contra um conjunto de amostras de urina independente (coorte 2) usando análise de floresta acaso, com esfingomielina palmitoil, lactato, adenosina e succinato fornecendo o mais forte poder preditivo para diferenciar câncer de coorte 2 a partir de amostras de urina não-cancerosas. Coorte 2 metabolito profiling revelou metabólitos adicionais, incluindo araquidonato, que eram mais elevados em coorte 2 câncer vs. controles não-cancerosas, mas estavam abaixo dos limites de quantificação na coorte 1 profiling. Os metabolitos relacionados com o metabolismo de lípidos pode ser biomarcadores especialmente interessantes. Os resultados sugerem que os metabolitos na urina pode fornecer uma muito necessária não-invasiva adjunta de diagnóstico para cistoscopia para a detecção de câncer de bexiga e de gestão de doença recorrente

Citation:. Wittmann BM, Stirdivant SM, Mitchell MW, Wulff JE, JE McDunn , Li Z, et al. (2014) cancro de bexiga de biomarcador descoberta Usando global metabolômica Profiling de urina. PLoS ONE 9 (12): e115870. doi: 10.1371 /journal.pone.0115870

editor: Mohammad O. Hoque, Johns Hopkins University, Estados Unidos da América

Recebido: 23 de maio de 2014; Aceito: 27 de novembro de 2014; Publicação: 26 de dezembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Wittmann et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. O financiamento para coleta de amostras e anotação foi apoiado por bolsas NIH 1R01-CA151489-01 (Bogdan Czerniak PI), e NIH /NCRR 5 UL1 RR24982 -02 (YL co-investigador). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Metabolon adquiriu amostras na taxa por base amostral

CONFLITO DE INTERESSES:. Os autores leram a política da revista e tem as seguintes conflitos: BMW, SMS, MWM, JEM, ZL, BPN, MVM e RLW são funcionários da Metabolon Inc .; YL colabora em estudos de investigação com Abbott, Cepheid e Pacific Edge, mas não como um consultor ou alto-falante. Esses interesses concorrentes não alteram a adesão dos autores para todas as políticas de jornal sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Em os EUA, o câncer de bexiga é o 4

th tipo de câncer mais comum em homens e o

th tipo de câncer 11 mais comum em mulheres [1]. Em os EUA para 2012, estima-se que 73.000 novos casos seriam diagnosticados e 15.000 pessoas morrem da doença [1]. Os doentes com cancro da bexiga mais frequentemente se apresentam com hematúria [2]. Diagnóstico de cancro da bexiga, naqueles pacientes que se apresentam com hematúria, envolve principalmente a cistoscopia, juntamente com imagens, citologia e biópsia [3]. Cistoscopia e citologia são os padrões atuais para diagnóstico inicial e recorrência, mas existem limitações. Cistoscopia pode não conseguir visualizar certas áreas dentro da bexiga e também pode falhar na detecção de todos os cancros, particularmente alguns casos de carcinoma in situ [4]. Citologia tem alta especificidade e selectividade para tumores de alto grau, mas não consegue proporcionar um forte valor preditivo para tumores de baixo grau [5]. As opções de tratamento são baseados em teste e se há invasão do tecido muscular. A maioria dos cancros da bexiga (75%) são carcinomas uroteliais classificadas como não-invasivos musculares cancros da bexiga (NMIBC). Em NMIBC, aproximadamente 70% dos pacientes apresentam-se com fase pTa, pT1 20% com e 10% com carcinoma in situ (CIS) [6]. A taxa de recorrência para NMIBC após a ressecção do tumor é alta, com estimativas variando de 35 a 80% [6], [7]. Devido ao risco de recorrência do tumor ou progressão, diretrizes estabelecidas recomendam que os pacientes NMIBC ser monitorado após o diagnóstico e tratamento inicial [8], [9]. Uma programação regular de cistoscopia é recomendado para vigilância, com uma frequência de cada 3-6 meses por 3 anos e anualmente lá depois [10], [11]. Como resultado, o cancro da bexiga pode ser visto como uma doença crônica com follow-up ao longo da vida necessário. vigilância a longo prazo contando com cistoscopia, além de ser invasiva, tem o potencial para eventos adversos e pode envolver despesas consideráveis ​​a longo prazo [12], [13]. Além disso, a aversão ao paciente a cistoscopia poderá prejudicar a aderência do paciente com as recomendações de vigilância regulares [14]. Há uma forte necessidade clínica de um não-invasiva, alternativa barata para cistoscopia que irá auxiliar na detecção de cânceres primários, monitorar a recorrência e ajudar a estratificar pacientes quanto ao risco de recorrência e progressão. Recentes avanços em metabolômica abriram a possibilidade de utilizar metabolitos na urina como biomarcadores para o câncer [15] – [18]. Um número de estudos compararam as diferenças metabolito nos tumores da bexiga em relação ao tecido benigno e identificaram biomarcadores de cancro candidatos [19] – [23]. Um estudo também analisou as diferenças de metabolitos na urina entre pacientes com câncer de bexiga em relação ao câncer de controles livres [19]. Estudos anteriores foram muitas vezes limitadas no número de detectados metabolitos nomeados e um perfil metabólico mais abrangente pode produzir novos biomarcadores candidatos e algoritmos de previsão. Relatamos aqui o perfil metabolômica de urina de dois grupos de doentes com cancro da bexiga e seus respectivos controles não-cancerosas. Os dados sugerem vários biomarcadores de câncer de bexiga candidato que pode oferecer valor prognóstico na identificação de urinas positivas cancerosas.

Materiais e Métodos

Seleção de Pacientes

Retrospective (coorte 1) e prospectiva ( coorte conjuntos de amostras 2) de urina foram obtidas a partir de um repositório urina IRB-aprovado (IRB # CR00008160 /STU032011-187) na Universidade do Texas Southwestern Medical Center (UTSW). Todos os indivíduos foram consentido com autorização por escrito. Coorte 1 bexiga urinas positivas câncer eram de indivíduos que apresentaram câncer primário ou recorrente. amostras de urina anuladas foram obtidos antes da cistoscopia para assuntos de positivos de câncer de coorte 1 bexiga, juntamente com controles de história câncer e hematúria. Cistoscopias foram conduzidas como parte da vigilância contínua ou para a detecção de câncer e resultados foram utilizados para diagnosticar o estado do câncer atual, presente ou ausente. Coorte 2 amostras de urina foram obtidas de indivíduos que apresentem hematúria ou de indivíduos com história de doença vigilância passando. urinas positivas cancro da bexiga em coorte 2 foram obtidos de indivíduos que apresentaram qualquer doença primária ou recorrente. Metadados em relação à idade, sexo, raça e estágio e grau de câncer estava disponível para ambos os grupos.

metabolômica Profiling

O plataformas espectrômetro de massa, a extracção de amostras e preparação, configurações e condições de instrumento, e os dados controlando foi previamente descrito em detalhe [24]. Em resumo, os principais componentes do processo podem ser resumidas como se segue. A osmolaridade de cada amostra de urina é determinado antes do processamento. Um cocktail de padrões de recuperação foi adicionado às amostras de urina e alíquotas de 100 uL foram extraídas em 500 uL de metanol. O extrato resultante foi dividida em três frações de perfis metabólicos não segmentados e randomizado para análise. Cada amostra foi seca sob vácuo para remover o solvente orgânico. As amostras foram caracterizadas por meio de três plataformas independentes: cromatografia líquida de ultra-alta desempenho /espectrometria de massa (UHPLC-MS /MS) no modo de ião negativo, UHPLC-MS /MS, na espectrometria de cromatografia de massa modo de iões positivos e gasosa (GC-MS ) após sialilação. A reprodutibilidade do protocolo de extracção foi avaliada pela recuperação dos compostos xenobióticos incrementadas em cada amostra de urina antes da extracção. Os grupos 1 urinas foram analisados ​​por meio de uma plataforma que consiste de um Waters ACQUITY UHPLC (Waters Corporation, Milford, MA, EUA) e um espectrómetro de massa Thermo Finnigan-LTQ (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA. EUA), enquanto era coorte 2 analisados ​​por meio de uma plataforma composta por um Waters ACQUITY UHPLC e uma ThermoFisher Scientific Orbitrap Elite alta resolução /espectrometria de massa exata em massa (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA. EUA). Os compostos foram identificados por comparação com as entradas da biblioteca de padrões purificadas ou entidades desconhecidas recorrentes. Identificação de entidades químicas conhecidos foi baseada em comparação com as entradas da biblioteca de padrões metabolômicos purificados com base nas propriedades cromatográficas e espectros de massa. Como desta escrita, mais de 4000 compostos padrão purificados disponíveis comercialmente tinha sido adquirida e registrada nas LIMS para distribuição para plataformas tanto o LC e GC para determinação de suas características analíticas. entidades adicionais (compostos não identificados) foram identificados em virtude de sua natureza recorrente (ambos espectral cromatográfica e massa). Estes compostos têm o potencial para ser identificado por aquisição futura de um padrão de correspondência purificado ou por análise estrutural clássica.

A análise estatística

Todas as análises estatísticas foram realizadas na versão 2.14.2 R [25] . Teste de Wilcoxon foi utilizado para determinar a significância estatística de metabólitos diferenças médias entre grupos de comparação. Para todas as análises, os valores em falta (se houver) foram imputados com o mínimo observado para esse composto particular (valores imputados foram adicionados após o bloqueio-normalização). As análises estatísticas foram realizadas em dados transformados em logaritmos naturais para reduzir o efeito de quaisquer potenciais valores extremos nos dados. Além disso, os dados foram normalizados para provar a osmolalidade para compensar as diferenças na concentração de urina. floresta aleatória é uma técnica de classificação supervisionada com base em um conjunto de árvores de decisão [26] e foi realizada em R versão 2.14.2. agrupamento hierárquico de cancro da bexiga e perfis abundância de urina de controle foi realizada em ArrayStudio versão 5.0 utilizando ligação completa e de correlação de Pearson como a métrica de similaridade (OmicSoft, Raleigh, NC). Cálculos da AUC e curvas ROC foram realizadas com o pacote PROC em R [27]. O algoritmo de multi-bioquímica, usadas para gerar as AUCs e curvas ROC, foi treinado e testado a partir de dados que foi escalonados de modo que as medianas dos dois a coorte-1 e coorte-2 negativos foram iguais a 1. A adaptação permite o teste em um algoritmo escala adequada para os coeficientes embutidos derivados do conjunto de treinamento.

resultados

populações Assunto

profiling urina metabólica foi realizada em duas coortes de assunto. Coorte 1 foi utilizado como uma identificação exploratória /biomarcador definido para identificar compostos bioquímicos cujos níveis foram diferentes nas urinas de urinas de cancro da bexiga relativamente aos níveis de controlo nas urinas. Coorte 2 foi utilizada como uma segunda descoberta definir e para testar o valor preditivo dos biomarcadores candidatos seleccionados a partir do conjunto de dados coorte 1, mas desde coorte 2 amostras foram analisadas sobre uma plataforma de espectrometria de massa mais sensível, metabolitos que somente foram medidos na coorte 2 As amostras também foram de interesse. Coorte 1 foi um conjunto de amostras de urina coletadas retrospectiva da Universidade do Texas Southwestern, enquanto coorte 2 amostras foram coletadas prospectivamente na mesma instituição. Um resumo dos dados demográficos do paciente para os duas coortes é apresentado na Tabela 1. Os grupos 1 66 urinas composta dos indivíduos diagnosticados com BCa e 266 controlos não-BCa. Urinas em coorte 1 foram coletadas de indivíduos com qualquer doença primária ou recorrente. Algumas diferenças nas composições globais de gênero e raça estavam presentes em coorte 1. controles não-CBE no coorte 1 podem ser subdivididos em três populações: 1) indivíduos que apresentaram hematúria; 2) indivíduos com uma história de BCa, mas nenhuma doença atual e 3) indivíduos normais, sem histórico de BCa. Coorte 2 foi composto por 29 urinas de indivíduos diagnosticados com BCa e 79 controles não-BCa. Como na coorte 1, houve algumas diferenças de gênero e equilíbrio racial entre o BCa e controles não-BCa. Coortes 2 urinas foram obtidas de indivíduos com doença quer primária ou recorrente em uma proporção idêntica à do grupo 1 (59% de repetição: 41% primária). Também digno de nota-se uma diferença de coorte na percentagem de alto grau vs. tumores BCa de baixo grau, com coorte 1 que tem uma percentagem muito maior de BCa alto grau (79%) do que coorte 2 (59%).

perfis e análise metabolômica

as amostras de urina foram extraídos e perfil metabólico foi realizada usando positivo (+) e negativa (-) LC-MS /MS e também por GC-MS, para obter uma ampla cobertura dos compostos bioquímicos presente. MS picos foram identificados utilizando software de pico de integração /identificação do proprietário Metabolon, através da comparação de dados de pico MS com a de uma biblioteca de padrões purificadas ou entidades desconhecidas recorrentes. Na sequência de imputação de valores mínimos observados, ingresse procedimentos de transformação e normalização, análise estatística foi realizada para identificar diferenças estatisticamente significativas nos níveis de metabólitos entre os grupos de comparação. Profiling de coorte 1 medidos 499 nomeados e 624 bioquímicos sem nome, enquanto perfis de coorte 2 medidos 587 nomeados e 541 bioquímicos sem nome. Listas de todos os metabolitos nomeados medidos nas duas coortes são mostrados na S1 Tabelas S2. O aumento do número de compostos nomeados medidos no grupo 2, em relação a grupos 1, em parte, reflecte a maior sensibilidade do MS instrumento massa exacta utilizada para coorte 2 e uma ampliação da biblioteca bioquímica no período de tempo entre coortes de perfil 1 e 2 . Um teste de amostra Wilcoxon dois foi empregada para identificar diferenças estatisticamente significativas nos níveis de metabolitos na coorte 1 urinas BCa relativamente ao controlo urinas. A análise estatística foi realizada comparando urinas BCa a todos os grupos de controle combinados; ou comparando BCa para cada um dos subgrupos de controlo. O número de diferenças estatisticamente significativas nos níveis de compostos chamados variou 178-233 entre as diferentes comparações (Tabela 2). Em geral, o número de compostos bioquímicos estatisticamente significativas não variar muito ao comparar amostras positivas BCa para os diferentes grupos de controlo. Análise de coorte 2 urinas BCa vs. controles, usando um teste de Wilcoxon, identificou 75 bioquímicos nomeados como mostrar as diferenças estatisticamente significativas com 70 bioquímicos elevados e 5 bioquímicos inferiores em BCa urinas relativamente ao controlo urinas (Tabela 2). O menor número de diferenças estatisticamente significativas na coorte 2 em relação ao grupo 1 pode reflectir, em parte, os números de amostra inferiores em coorte 2. A percentagem mais elevada de tumores estágio superior na coorte 1 em relação à coorte 2 também pode ter afetado o número de estatisticamente diferenças significativas observadas.

identificação de biomarcadores candidatos

Uma estratégia foi empregada para usar coorte 1 para identificar biomarcadores candidatos e para classificar a coorte mais interessante 1 biomarcadores para a previsibilidade BCa usando a coorte 2 amostras definido. Um diagrama de fluxo de trabalho da estratégia utilizada para testes de biomarcadores e de confirmação é exibida na Fig. 1. agrupamento hierárquico foi realizada no conjunto de dados de coorte 1, utilizando todas as amostras (332) e todos os bioquímicos chamados, excluindo as drogas exógenas (total = 442). Os resultados do agrupamento hierárquico são apresentados na Fig. 2, com um certo grau de aglomeração BCa amostra observada. Os resultados de agrupamento sugerem que as diferenças de metabólitos entre o câncer e sem câncer existem grupos e que estas diferenças têm uma capacidade para diferenciar as amostras de urina

Abreviaturas:. HX, BCa negativo, mas com história de BCa; Hema, apresentando negativo BCa com hematúria.

diagnóstico BCa Assunto (coleta pós urina) é indicado na barra inferior. Clustering foi realizada utilizando ligação completa e de correlação de Pearson como a semelhança métrica. Comparando

Seleção de candidatos biomarcadores dos dados de 1 de coorte Set Online

Um teste de Wilcoxon foi aplicada a coorte 1 dados de perfil urinas de indivíduos com BCa atual para urinas a partir de três grupos de controlo distintos: 1) indivíduos que apresentaram hematúria; 2) indivíduos com uma história de BCa mas nenhuma doença atual ou 3) indivíduos normais, sem histórico de BCa. Além disso, um teste de Wilcoxon foi aplicado comparando urinas BCa a um grupo controle, composto por todos urinas não BCa combinados. Um mapa de calor e estatísticas para todos os metabólitos medidos para as 4 diferentes comparações está contido em S1 Table. Combinados, 290 diferenças estatisticamente significativas nos níveis de metabólitos nomeados foram identificados entre analisa a 3 separada BCa /comparador, com 135 metabólitos que apresentam diferenças estatisticamente significativas entre os três BCa para comparações negativas de controle (hematúria, história, normal; S1 tabela). Para reduzir o número total de diferenças de metabolitos para baixo para um conjunto mais gerenciável de “melhores candidatos biomarcadores”, foram aplicados vários critérios de filtragem. Filtros incluíram: 1) metabolitos com BCa para controlar níveis que eram estatisticamente significativo em pelo menos 3 dos 4 BCa para controlar comparações entre os grupos; 2) diferenças de metabólitos que apresentam o menor valor de p (todo p≤0,05); 3) maiores diferenças vezes entre BCa e controles; 4) medido em 50% das amostras de urina; 5) associação fenótipo de câncer; 6) a cobertura de várias vias metabólicas; 7) Apenas compostos nomeados; 8) a exclusão de compostos exógenos (por exemplo, drogas) xenobióticos. Aplicando os critérios de selecção que designado um painel de 25 candidatos a biomarcadores para análise posterior. O conjunto de 25 marcadores candidatos é mostrado no mapa de calor da fig. 3, juntamente com o desempenho estatística em cada um dos 3 BCa possíveis para controlar comparações entre os grupos. Também mostrado na Fig. 3 é uma análise de subgrupo câncer de bexiga comparando único não-músculo cancros da bexiga invasivo ao grupo controle história. Ao comparar todas as amostras BCa para cada um dos grupos de controlo, todos os compostos bioquímicos com a excepção de a ácidos de cadeia ramificada (BCAA) leucina, isoleucina e valina exibida p≤0.05 significância estatística em todas as comparações entre os grupos de controlo 3. 3-hidroxibutirato e gluconato foram as mais altamente elevadas em amostras de urina bca, enquanto anserina e 3-hidroxifenilacetato de metilo e pyridoxate foram mais reduzida em BCa vs urinas de controlo. A maioria dos candidatos a biomarcadores que alcançaram significância estatística quando todas as amostras BCa foram comparados com os controlos de história também exibida diferenças estatisticamente significativas quando apenas as amostras NMBIC foram comparados com os controlos históricos. Diferenciação de cânceres NMBIC é importante porque eles vão ser mais prevalente em pacientes sob vigilância ativa. Os 25 candidatos a biomarcadores seleccionados a partir de dados da coorte 1 foram utilizados em uma análise de agrupamento hierárquico de coorte 1 amostras. foi observada agregação de amostras BCa e controle, indicando que os níveis diferenciais dos 25 bioquímicos oferecer algum grau de estratificação da amostra de urina com base no diagnóstico (Fig. 4).

Red preencher células indicam metabólitos com os níveis médios mais elevados em BCA urinas do que nos controles não-BCa no significado ap≤0.05. células verdes indicam níveis mais baixos em relação ao controlo BCa urinas a uma significância p £ 0,05. q-valores estatísticos e resultados de perfis para todos os outros compostos nomeados medidos em coorte 1 amostras são apresentados inn S1 Table.

diagnóstico BCa Assunto (pós coleta de urina) é indicado na barra inferior. Clustering foi realizada utilizando ligação completa e de correlação de Pearson como a semelhança métrica.

biomarcadores Coorte 1 candidatos que melhor diferenciam coorte 2 amostras

Uma análise floresta aleatório foi realizado usando o 25 coorte 1 candidatos biomarcadores para estratificar o conjunto de amostras de coorte 2 em seus grupos cancerosas e não-cancerosas adequadas. Floresta aleatória é um método conjunto baseado em árvores de classificação e que o erro fora-de-saco dá uma estimativa de quão bem podemos esperar para prever uma amostra futuro. A análise Floresta aleatória fornece uma “importância” hierarquização de produtos bioquímicos. A importância relativa de cada um dos metabolitos 25 é mostrado na Fig. 5, com esfingomielina palmitoil exibindo o maior poder discriminatório (maior redução média do valor da precisão). Os 6 principais metabolitos discriminatórias na análise floresta aleatório constituído 3 metabolitos que foram maiores nas urinas BCa e 3 que foram menores em amostras BCa. A comparação dos níveis relativos de estes 6 metabolitos em todas as urinas de câncer, contra todos os controles não-cancerosas nas duas coortes é apresentada na Fig. 6. As diferenças nos níveis relativos de cada um dos 6 metabolitos foi estatisticamente significativa (p £ 0,05) em ambos os grupos, com excepção do succinato que alcançou um valor de p de 0,053 no grupo de comparação 2. Além disso, o subconjunto de amostras NMIBC BCA foi comparada com todas as amostras de controlo e 4 dos 6 metabolitos continuou para alcançar significância estatística, a um nível de p £ 0,05, com fosfocolina e succinato sendo a excepção (Fig. 6). Fosfocolina e succinato foram estatisticamente significativas a um nível p≤0.1.

Os metabólitos são, pela sua média diminuir a pontuação de precisão ordenou-rank. A maior média de diminuir o valor da precisão indica uma maior valor preditivo. Os 6 pontos de dados em caixas representam melhor desempenho metabólitos resumidos na Fig. 6.

As comparações são para todas as urinas positivas BCA contra combinar BCA controles negativos. células vermelhas e verdes escuras escuras representam diferenças vezes com um p ≤ 0,05. células verde-claro com texto azul representa p≤0.1. BLQ: abaixo do limite de quantificação; NA:. Não aplicável

candidatos biomarcadores adicionais observadas em amostras de urina de coorte 2

Caracterização metabólica de amostras de urina de coorte 2 foi realizada utilizando uma massa accurate- MS-plataforma mais sensível, que é capaz de medir metabolitos na urina presentes em concentrações mais baixas. A heatmap contendo todos os metabolitos nomeados medidos em coorte 2 amostras são apresentadas em S2 Table. Araquidonato, espermidina, espermina e citosina, não foram medidos em coorte 1 urinas, mas foram elevados em coorte 2 urinas BCa em p≤0.05 (Fig. 6). Araquidonato também foi elevado na urinas tumorais NMIBC a um nível estatisticamente significativo, quando as amostras foram segregados NMIBC e analisados ​​separadamente das urinas tumorais MIBC (Fig. 6). A espermina, espermidina e citosina foram elevados em urinas NMIBC bem, mas não a níveis estatisticamente significativos. Estes quatro metabolitos podem também ser considerados candidatos a biomarcadores, mas exigiria uma confirmação coorte independente, que tinha também sido perfilado no instrumento preciso em massa.

desempenho do algoritmo de múltiplos analitos utilizando um conjunto de biomarcadores 6

Como um exemplo de teste de desempenho potencial biomarcador em um algoritmo de múltiplos analitos, esfingomielina palmitoil, lactato, gluconato, adenosina, 2-methylbutyrylglycine e guandinoacetate foram escolhidos para o treinamento algoritmo usando o conjunto de dados de coorte-1. Estes biomarcadores candidatos foram escolhidos com base em suas diferenças dobrar e p-valores, tanto de coorte-1 e coorte-2. O algoritmo derivado de formação sobre o conjunto de dados de coorte-1 foi testado em conjunto de dados de coorte-2. AUCs e ROC curvas, tanto para a análise de treinamento e conjunto de teste são apresentados na Fig. 7. AUC comparáveis ​​foram obtidos para ambos os grupos, com AUC = 0,81 para coorte-1 e 0,78 para coorte-2. Os valores de especificidade manteve-se elevado, até um corte de sensibilidade em torno de 0,5, em ambos os grupos. O desempenho observado utilizando este algoritmo não inferir futuro valor preditivo, uma vez que os biomarcadores utilizados no algoritmo foram pré-seleccionados com base na sua capacidade de diferenciação tumoral em ambos os grupos. Este exemplo ilustra que é possível derivar um algoritmo que segrega do tumor a partir de urinas de controlo em ambos os grupos específicos.

Um algoritmo, utilizando o biomarcadores candidatos palmitoil esfingomielina, lactato, gluconato, adenosina, 2-e methylbutyrylglycine guanidinoacetato foi treinado usando o conjunto de dados de coorte-1 e, em seguida, testado no conjunto de dados de coorte-2. Curvas ROC com AUC são exibidos para o conjunto de treinamento (A.) e do conjunto de teste (B.).

Discussão

O câncer de bexiga é uma importante causa de morbidade e mortalidade com uma alta taxa de recorrência e necessidade de vigilância de acompanhamento frequente. Atualmente, o monitoramento de recorrência requer cistoscopia em uma base semi-rotina, normalmente até um extenso período livre de doença tem acontecido. A metodologia de diagnóstico mais fácil, menos invasivo seria vantajoso para o doente e pode aumentar o acompanhamento cumprimento de vigilância. Medição de metabolitos na urina pode fornecer um método de diagnóstico companheiro que poderia facilitar o acompanhamento de recorrência do câncer de bexiga e, talvez, também contribuem para o diagnóstico primário.

estudos metabolômica recentes têm provado valioso na identificação de biomarcadores de câncer e em busca de insights sobre o papel de reprogramação metabólica na iniciação e progressão de doenças malignas. reprogramação metabólica em células tumorais é um fenómeno comum e é agora reconhecido como uma característica emergente de cancro [28]. Alterações nos níveis de metabolitos resultantes da reprogramação metabólica do tumor pode oferecer oportunidades únicas para a descoberta de biomarcadores. Por exemplo, 2-hidroxiglutarato é aumentada em gliomas, mieloma múltiplo e o cancro do cólon [29] e sarcosina elevada é associada com cancro colo-rectal e da próstata [30], [31]. Os metabolitos associados com células de tumor de reprogramação metabólica ou talvez tumor-estromal interacções pode ser antecipada para exibir uma alteração nos níveis não só no próprio tecido tumoral, mas também em matrizes, tais como sangue ou urina, que suportam a absorção ou excreção de compostos bioquímicos relacionados com o crescimento tumoral ou invasão. Várias investigações têm relatado sobre a utilidade de biomarcadores de metabólitos de diagnosticar, estratificar e monitorar pacientes com câncer [31] – [34].

O presente estudo perfilado 430 amostras de urina de dois grupos de sujeitos, com conhecida positivo ou negativo diagnósticos BCA e, como tal, representa a triagem mais abrangente para câncer de bexiga biomarcadores metabólito urinário até à data. Estudos anteriores medido um número limitado de metabolitos na urina (tipicamente menos do que 25). A /espectrometria de plataforma de tecnologia não-alvo UPLC massa com base empregue neste estudo facilita a identificação e quantificação relativa de 500 compostos químicos, em amostras de urina, aumentando muito o número de potenciais candidatos de biomarcadores mais dos anteriormente descritos. 25 metabólitos foram selecionados a partir de coorte 1 para a avaliação do conjunto de dados independente coorte 2. Os 25 compostos bioquímicos identificados como candidatos a biomarcadores abrangidos uma ampla gama de vias metabólicas. Enquanto o conjunto de biomarcadores 25 candidato continha tanto o aumento e diminuição metabólitos – escolhidos para melhores explorar múltiplos analitos algoritmos de previsão – hipóteses para o aumento metabolitos na urina em BCa são mais facilmente gerado de hipóteses para níveis de metabólitos diminuiu. Aumento metabolitos pode derivar a partir de metabolitos de tumor secretadas para a urina ou a partir de avaria ou alteração do tecido não maligno causados ​​pela invasão do tumor através da parede do epitélio. As respostas inflamatórias resultantes da presença de tumor também pode resultar em aumento dos níveis de metabólitos. Declínios nos metabolitos pode ser causado uma menor taxa de eliminação de metabolito por células tumorais em relação ao epitélio normal ou por uma absorção de metabolitos da urina para o tumor ou o tecido adjacente. Alterações no metabolismo sistémico causado por fatores liberados por tumores de bexiga ou tecidos adjacentes remodelado e excreção urinária posterior, também pode causar alterações nos níveis de metabolitos na urina, ambos os aumentos e diminuições. 25 metabólitos foram selecionados como candidatos biomarcadores do conjunto de dados de coorte 1 com base em vários critérios. A análise Floresta aleatória testando os 25 metabólitos contra o conjunto de dados de coorte 2 ilustrado que um subconjunto dos 25 destacou-se como melhor desempenho. esfingomielina palmitoílo, lactato, succinato de adenosina e teve o maior valor preditivo, com outros metabolitos que indica um intervalo de valores reduzidos. Uma possível explicação para o desempenho mais fraco de muitos dos candidatos a biomarcadores coorte 1 pode ser que as amostras de urina positivas coorte 1 de cancro da bexiga foram derivadas de uma maior percentagem de indivíduos com tumores de alto estágio /alto grau do que aquelas presentes em indivíduos da coorte 2. também é possível que muitos dos grupos 1 biomarcadores candidatos eram falsos positivos resultantes das características únicas desta população amostra particular

os 25 coorte 1 biomarcadores candidatos representam um conjunto diversificado de vias metabólicas -., em parte, porque a diversidade via era um filtro para selecionar o conjunto de 25 de 200 metabólitos com diferenças estatisticamente significativas comparando coorte 1 BCa urinas positivas do grupo combinado de todos os controlos negativos. Várias vias representados pelos metabolitos candidatos foram de especial interesse. Uma importante característica metabólica do cancro é a mudança de frequência observada de fosforilação oxidativa a uma maior dependência do metabolismo da glicose através da glicólise, mesmo sob condições aeróbicas (metabolismo Warburg) [35]. Enquanto muitos mecanismos diferentes Acredita-se que contribuem para este interruptor na actividade metabólica, os resultados incluem o aumento da absorção e consumo de glicose, o aumento da produção de lactato e de excreção, a produção de citrato elevada, e actividade de aumento da via da pentose fosfato (PPP). Upregulating estas vias fornece energia, de ácidos gordos, a biosíntese dos nucleótidos, e geração de NADPH [36], [37]. O lactato foi significativamente aumentado nas amostras de urina de pacientes com cancro da bexiga em coortes 1 e 2 e pode ser uma indicação de aumento da glicólise em células BCa. Além de lactato, β-hydroxypyruvate, que não tenha sido previamente ligada ao metabolismo do tumor, foi significativamente elevado na urina dos sujeitos de cancro primário da bexiga. β-hydroxypyruvate pode ser ligado a glicólise no entanto a sua formação através da reacção de transaminase de piruvato-serina ou a sua derivação a partir da glicólise intermediário 3-fosfoglicerato [38].

Três metabolitos associados com o metabolismo dos lípidos, esfingomielina palmitoílo, e fosfocolina araquidonato (coorte 2 apenas) foi significativamente alterada na urina de indivíduos BCA. Este foi um pouco surpreendente, pois;