Abstract

O câncer de bexiga é o quinto câncer mais comum nos Estados Unidos, e identificar marcadores genéticos que podem predizer a susceptibilidade in população de alto risco é sempre necessária. O objetivo do nosso estudo é determinar se as variações genéticas no fator-beta (TGF-β) via de crescimento transformador estão associados com risco de câncer de bexiga. Foram identificados 356 polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) em 37 genes importantes deste percurso e avaliou sua associação com o risco de câncer em 801 casos e 801 controles. Quarenta e um SNPs foram significativamente associados com o risco de câncer, e após o ajuste para múltiplas comparações, 9 permaneceu significativa (

Q

-valor ≤0.1). análise de haplótipos revelou ainda três haplótipos dentro

VEGFC Comprar e dois haplótipos em

EGFR

foram significativamente associados com risco aumentado de cancro da bexiga em comparação com o haplótipo mais comum. Classificação e análise de árvore de regressão revelou ainda potenciais interações gene-gene de alta ordem, com

VEGFC:

rs3775194 sendo a divisão inicial, o que sugere que esta variante é responsável pela maior parte da variação no risco. Os indivíduos portadores do genótipo comum para

VEGFC

: rs3775194 e

EGFR: rs7799627 eo genótipo variante para

VEGFR

: rs4557213 tiveram um aumento de 4,22 vezes no risco, um tanto maior a magnitude do efeito do que o conferido pelo genótipo comum para

VEGFR

: rs4557213. Nosso estudo fornece a primeira evidência epidemiológica suportar uma conexão entre as variantes via TGF-beta e risco de cancro da bexiga

Citation:. Wei H, Kamat AM, Aldousari S, Ye Y, Huang M, Dinney CP, et al. (2012) variações genéticas no fator transformador de crescimento beta Pathway como preditores de cancro de bexiga de Risco. PLoS ONE 7 (12): e51758. doi: 10.1371 /journal.pone.0051758

editor: Yan Gong, Faculdade de Farmácia da Universidade da Flórida, Estados Unidos da América

Recebido: 09 de maio de 2012; Aceito: 05 de novembro de 2012; Publicação: 12 de dezembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Wei et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por bolsas de Institutos Nacionais de Saúde (U01 CA 127.615, R01 CA 74880, P50 CA 91846, e R01 CA 131335) (www.NIH.org). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de bexiga comumente afeta os idosos e os homens, com uma estimativa de 73,510 novos casos e 14.880 mortes nos Estados Unidos em 2012 [1]. fatores de risco para o câncer de bexiga incluem sexo masculino, idade avançada, tabagismo e exposição ocupacional a aminas aromáticas [2]. É cada vez mais reconhecido que a susceptibilidade genética pode contribuir para a carcinogênese cancro da bexiga [3]. Portanto, a identificação de indivíduos suscetíveis ao câncer com a ajuda de marcadores genéticos podem reduzir os custos de saúde, aumentar o custo-benefício de triagem e vigilância, e melhorar o tratamento e sobrevivência de pacientes com câncer.

O fator de crescimento transformante beta (TGF-β) via tem sido estabelecido que joga um papel importante em diferentes tipos de cancro e implicada na tumorigénese do carcinoma de células de transição da bexiga. Muitos estudos têm indicado que a sinalização de TGF-β contribui transição epitelial-mesenquimal, angiogénese, migração, e metástases em muitos tipos de tumores malignos [4] [5], [6]. Em células normais, o TGF-β regula o crescimento celular, diferenciação, produção da matriz, e a apoptose [7]. TGF-β apoptose induzida é frequentemente mediada pela via dependente de Smad, mas também pode ocorrer através de ambos os mecanismos dependentes de p53 e independentes de p53 [8], [9], e envolve a activação de caspase, supra-regulação dos factores pró-apoptóticos (ou seja, Bax) , e /ou a regulação negativa de factores anti-apoptóticos (ou seja, a Bcl-2 e Bcl-xL) [10] – [12]. Estes factores são todos parte integrante do sistema imunitário humano. O TGF-β receptor de uma variante rs11466445 (TGFBR1 * 6A) tem sido associada a um risco aumentado de cancro da mama e cancro do ovário mas não colorrectal ou cancro da bexiga [13] – [16]. No entanto, outro estudo sobre os efeitos dos 7 diferentes variantes genéticas em dois membros-chave da via TGF-β (

TGFB1

e

TGFBR1

) eo desfecho clínico do músculo invasivo cancro da bexiga indicou que

TGFBR1:

rs868, localizado na região 3 ‘não traduzida, foi significativamente associada com mortalidade específica da doença [17]. Também é relatado que variantes genéticas em

RUNX3

, um supressor de tumor da via β TGF-, podem modular o risco de cancro da bexiga [18].

Uma vez que a via de TGF-β desempenha um papel essencial papel nos processos celulares, temos a hipótese de que os polimorfismos de genes da via de TGF-β pode modular o risco de cancro da bexiga. Para testar esta hipótese, foi realizado um grande estudo de caso-controle para avaliar os efeitos de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) em genes importantes deste percurso. Para o nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a explorar a associação entre um painel abrangente de polimorfismos nos genes da via TGF-β e cancro da bexiga risco e identificar subgrupos que seriam mais propensos a ter maior risco de câncer.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

consentimentos informados por escrito foram obtidas de todos os pacientes antes da inscrição no estudo. O estudo foi aprovado pelo Institutional Review Boards no MD Anderson Cancer Center, Baylor College of Medicine, e Kelsey-Seybold Clinic.

População do Estudo e Coleta de Dados

Este estudo de caso-controle começaram a paciente recrutamento em 1999 e está actualmente em curso. doentes com cancro da bexiga foram recrutados a partir da Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center e Baylor College of Medicine. Os casos eram pacientes com diagnóstico recente, confirmado histologicamente câncer de bexiga. Nenhum dos pacientes havia sido submetido a quimioterapia ou radioterapia antes da participação no estudo. Não houve restrições para a idade, sexo ou estágio da doença no recrutamento. Os indivíduos do grupo controle eram indivíduos saudáveis, sem história prévia de câncer (exceto câncer de pele não melanoma). Eles foram recrutados no ambulatório de Kelsey-Seybold, o maior grupo prática multispecialty privada na área metropolitana de Houston. Casos e controles foram pareados em termos de idade (± 5 anos), sexo e etnia. Todos os participantes do estudo assinaram documento de consentimento informado e completou a 45 minutos de entrevista em pessoa por entrevistadores pessoal MD Anderson treinados. Após cada entrevista, a 40 ml de amostra de sangue periférico foi elaborado em tubos codificados e heparinizados para isolamento de DNA e posterior análise. Os indivíduos que fumaram menos de 100 cigarros em sua vida foram definidos como nunca fumaram, os indivíduos que fumaram mais de 100 cigarros, mas tinham parado mais de um ano antes do diagnóstico ou entrevista foram definidos como ex-fumantes e pessoas que estavam a fumar ou tinha parado menos de 1 ano anterior foram definidos como fumantes atuais. Neste estudo, antigos e atuais fumantes foram definidos como nunca fumantes. Uma vez que mais de 90% dos nossos casos recrutados eram carcinoma de células transicionais pura, só incluiu esta histologia no estudo. Uma vez que mais de 90% da nossa população do estudo foi auto-relatado não-hispânicos caucasianos com base na data questionário, restringimos a análise aos caucasianos para limitar o efeito de confusão da estratificação da população, mantendo a maior parte do poder estatístico.

SNP Selecção e genotipagem

Um painel de 356 SNPs em 37 genes (Tabela S1) foi seleccionado com base nos seguintes critérios. Resumidamente, utilizamos software Ingenuity Sistema de Análise de Caminho (https://www.ingenuity.com) e Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCBI) PubMed (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) para identificar uma lista de TGF-beta genes relacionados à via. Para cada gene, foi selecionado SNPs marcação pelo algoritmo de criação de faixas de software LDSelect (https://droog.gs.washington.edu/ldSelect.pl, versão 1.0) (R

2 0,8, MAF 0,05) dentro 10 kb a montante do sítio de iniciação da transcrição ou 10 kb a jusante do local de terminação da transcrição. dados de frequência e LD SNP foram com base no banco de dados International HapMap Project, Release 22, de construção genoma humano 36. Também incluído SNPs potencialmente funcionais com menor frequência alélica (MAF) maior do que 0,01 na codificação (sinónimo e não sinónima SNPs) e regiões reguladoras (promotor, local de splicing, região 5 ‘não traduzida e região 3’ não traduzida). A genotipagem foi realizada utilizando iSelect matriz SNP costume da Illumina (Illumina, San Diego, CA). Genótipos foram analisados ​​e exportados usando o software Illumina BeadStudio. Quaisquer SNPs com uma taxa de chamada de 95% foi excluído da análise posterior

Análise Estatística

Laboratório e dados epidemiológicos foram fundidos e a maioria das análises foram realizadas usando STATA 10.0 (Stata Corporation, College Station. , TX) e HelixTree (dourado Helix, Bozeman, MT) software. As distribuições de características em casos e controles foram avaliados pelo χ

2 de teste (para variáveis ​​categóricas) ou teste t de Student (para variáveis ​​contínuas). Para cada SNP, testamos Hardy-Weinberg usando o χ

2 teste goodness-of-fit para comparar o observado com a frequência esperada de genótipos em indivíduos controle. Os efeitos de genótipos de SNPs sobre o risco de cancro da bexiga foram estimados como odds ratio e intervalos de confiança de 95% (IC 95%) usando regressão logística não condicional multivariada sob os modelos dominantes, recessivos e aditivos de herança ajustados para idade, sexo e tabagismo , onde apropriado. O modelo mais apropriado foi a que apresentou a menor

valor P

entre os três modelos. A

Q

-valor foi calculada para ter em conta as comparações múltiplas. O

Q

-valor mediram a proporção de (taxa de detecção falsa) falso positivo incorrido quando um SNP mostrado significativo. reamostragem de bootstrap foi executada 100 vezes para validar os resultados internamente [19]. A análise dos efeitos combinados de genótipos desfavoráveis ​​envolve uma soma de todos os genótipos de risco desses SNPs mostrando significância estatística na análise principal (

P Art 0,05) com igual contribuição de cada variante. análise de haplótipos foi realizado usando o algoritmo de maximização implementado no software HelixTree. interações gene-gene de ordem superior foram avaliados por meio de análise de classificação e regressão de árvore (CART) implementado no software HelixTree. Todas as análises estatísticas foram bilaterais.

Resultados

Características da População do Estudo

Como mostrado na Tabela 1, 801 casos caucasianos e 801 controlos caucasianos foram incluídos neste estudo . Não houve diferenças significativas no risco de cancro da bexiga devido a sexo (

P

= 1) ou a idade (

P

= 0,051). Como previsto, os casos relatou um No. mais elevado de cigarros /dia do que os controles (25,6 contra 22,5,

P Art 0,001). Entre os fumantes, os casos relatados maços-anos mais elevados de fumar do que os controles (43,0 contra 29,9,

P Art 0,001). Houve uma diferença significativa entre casos e controles pelo tabagismo (

P Art 0,001), com uma percentagem mais elevada de fumantes atuais, nos casos e maior percentual de pessoas que nunca fumaram nos controles (

P 0,001)

SNPs individual e global Sobrevivência

A associação de todos os SNPs significativa com o risco foi resumida na Tabela 2 (

P

. 0,05). Entre os 356 SNPs analisados, 41 SNPs foram significativamente associados com o risco de câncer (

P Art 0,05), e após o ajuste para múltiplas comparações, 9 permaneceu significativa, com um

Q

-valor ≤ 0.1. Estes SNPs foram localizados em três genes na via de TGF-β, incluindo

VEGFC

, gene do receptor do factor de crescimento epidérmico (

EGFR

), e

Smad3

.

para validar internamente estes resultados, o próximo realizada amostragem de inicialização aleatória das SNPs significativas para 100 iterações e listou o número de vezes que o

P

valor foi 0,05. Oito desses nove SNPs top teve resultados muito consistentes, com inicialização

P

valores 0,05 para mais de 90% das amostragens (Tabela 2)

efeitos cumulativos de múltiplos genótipos desfavoráveis ​​diante. Câncer Risco

Porque sinalização anormal TGF-β pode resultar na activação de múltiplos genes a jusante e 9 SNPs atingiu significância estatística após comparações múltiplas na análise principal efeito, utilizou combinada análise para determinar se vários genótipos desfavoráveis ​​no via de TGF-β tem um efeito aditivo sobre o risco de cancro da bexiga. Houve uma tendência dose-resposta significativa de aumento do risco de cancro da bexiga com o aumento do número de genótipos desfavoráveis. Comparado com o grupo de referência constituído por indivíduos com 0~2 genótipos desfavoráveis, os grupos com 3 ou 4 genótipos desfavoráveis ​​tinha significativamente elevados riscos com as RUP de 1,73 (95% CI, 1,28-2,33,

P 0,001) ou 2,15 (95% CI, 1,59-2,91,

P Art 0,001), respectivamente, enquanto que o grupo de alto risco com 5~9 genótipos desfavoráveis ​​tiveram um risco significativamente elevadas com o OR de 2,57 (IC 95%, 1,92-3,43,

P Art 0,001). (

P

tendência = 1,07 × 10

-10) (Tabela 3)

análise de haplótipos de VEGFC e EGFR SNPs

Como vários SNPs no

VEGFC

e

EGFR

genes mostraram associações significativas, nós próxima realizados análise de haplótipos para 8 SNPs top nesses genes na população estudada. Observamos três haplótipos significativamente associados com o risco de câncer de bexiga (Tabela 4). Haplótipo H7 era composto de SNPs rs1485762-rs6828869-rs17697515-rs3775194-rs4557213, e assuntos que transportam wildtype rs1485762, a variante rs6828869, wildtype rs17697515, variante rs3775194, e alelos de tipo selvagem rs4557213 mostraram um aumento significativo de 78% no risco (OR, 1,78; 95% CI, 1,13-2,82;

P =

1,4 × 10

-2) em comparação com aqueles que transportam haplótipo H0. Haplótipos H11 andH15 também alcançou associações significativas com o risco de câncer de bexiga com OR de 1,63 (IC 95%, 1,09-2,43;

P

= 1,6 × 10

-2) e OR de CI 1,78 (95%, 1,23-2,57;

P

= 2,0 × 10

-3), respectivamente (Tabela 4). Desde três SNPs no

gene EGFR

mostrou associações significativas após comparações múltiplas (

Q

≤0.1, Tabela 2), também realizada análise de haplótipos para estes três SNPs em

EGFR

na população total e identificados dois haplótipos significativos (

P Art 0,05) (Tabela 5). Haplótipo H3 foi composta de SNPs rs11238349- rs6593205 rs7799627- e temas que transportam wildtype rs11238349, variante rs7799627, e alelos variantes rs6593205 mostraram uma diminuição significativa de 25% no risco (OR, 0,75; IC 95%, 0,56-1,00;

P

= 0,05) em comparação com haplótipo H0. Haplótipo H4 alcançou também uma associação significativa com o risco de cancro da bexiga com um OR de 1,41. (IC 95%, 1,09-1,83;

P

= 1,0 × 10

-2) (Tabela 5)

de ordem superior interações entre genes e dos genes

a seguir exploradas interações gene-gene de ordem superior para determinar se ou não interações complexas entre esses SNPs significativas poderia modular ainda mais o risco de cancro da bexiga. A estrutura de árvore final identificadas várias interacções potenciais entre as nove SNPs topo (Figura 1).

VEGFC

: rs3775194 foi identificada como a divisão inicial, o que sugere seu importante papel na interação gene-gene eo potencial para prever o risco de câncer. A estrutura em árvore final também identificados quatro nós terminais com risco significativamente mais elevado do que o perfil genético de baixo risco de nó 1 (Figura 1). Em particular, o nó 5 tiveram um risco significativamente elevado com o OR de 3,28 (95% CI, 1,88-5,72), enquanto o nó 6 tiveram um risco ainda mais elevado significativamente elevados com o OR de 4,22 (IC 95%, 1,46-12,17).

Nota: Cada nó denota número e percentagem de casos e OR com 95% de intervalo de confiança entre parênteses. * Significativo no

P

. 0,05

Discussão

O câncer de bexiga continua a ser uma doença difícil devido à alta taxa de recorrência ea acompanhada alta médica custos. Usando marcadores genéticos para determinar o risco pode ajudar a identificar a população de alto risco para o rastreio precoce, diagnóstico e terapia, o que pode melhorar o resultado clínico. Este é o primeiro estudo a explorar a associação entre um painel abrangente de polimorfismos dos genes da via TGF-beta e risco de câncer de bexiga e para identificar subgrupos que seria mais provável que têm maior risco de câncer. Foram identificadas e avaliadas 356 SNPs em 37 genes-chave da via de TGF-β por suas associações com o risco de cancro da bexiga. Nossos resultados identificados 41 SNPs significativamente associados com a suscetibilidade ao câncer de bexiga, e nove deles permaneceu significativa após ajuste para comparações múltiplas (

Q

≤0.1). Em particular, SNPs em

VEGFC

mostraram as associações mais significativas no único SNP e análises de haplótipos. análise CART revelou ainda potenciais interações gene-gene de alta ordem e assuntos categorizados em diferentes grupos de risco de acordo com as suas assinaturas polimórficos específicos. Nosso estudo fornece a primeira evidência epidemiológica apoiar uma ligação entre um abrangente SNPs da via TGF-β e risco de câncer de bexiga.

Cinco dos nove maiores SNPs significativas foram em

VEGFC

, que é conhecido por têm funções importantes que contribuem para o risco de cancro da bexiga (Tabela 2). VEGFC é um membro do factor de crescimento derivado de plaquetas fator /de crescimento endotelial vascular (PDGF /VEGF) da família. Estas funções de genes em angiogénese, linfangiogénese, o crescimento celular endotelial e a sobrevivência, afecta a permeabilidade dos vasos sanguíneos, e também facilita a metástase nodal. Vários estudos têm relacionado a expressão de VEGF elevada com recorrência da doença ou progressão, muitas vezes como um preditor independente na análise multivariada. Existe uma correlação positiva entre o

VEGF-C

invasão expressão e linfática em pacientes com câncer de mama, gástrico e câncer cervical [20] – [22]. a expressão de VEGF-C foi encontrada no citoplasma de células de carcinoma de transição e foi associada com o nó de linfa de metástase do cancro da bexiga [23] – [24] e também foi encontrada uma correlação com os parâmetros clínicos tais como o tamanho do tumor, estádio patológico, grau patológico , envolvimento linfático-venosa, e pélvica linfonodos metástases em pacientes com câncer de bexiga [23]. análise de haplótipos ainda identificou três haplótipos significativos de

VEGFC

, o que sugere que a análise baseada em haplótipo pode ser mais informativa do que a análise SNP única e resequencing amostras de DNA que transportam os de alto risco e de baixo risco haplótipos podem ser capazes de melhorar avaliação de risco. Os cinco mais significativo (

Q Restaurant 0,1)

VEGFC

SNPs foram identificados estão todos localizados na região do intrão, o que pode contribuir para alterações na expressão gênica ou splicing. Alternativamente, também é possível que esses SNPs estão ligados a outras variantes causais no

VEGFC

.

Três das nove SNPs mais significativos foram em

EGFR

(Tabela 2) . O EGFR é um receptor transmembranar da tirosina quinase na família erb de receptores expressos na superfície de células epiteliais [25]. EGFR regula processos importantes na carcinogénese, incluindo a sobrevivência celular, invasão tumoral, e a angiogénese e está envolvido em muitas doenças malignas, incluindo cancro da bexiga [26]. EGFR superexpressão é frequentemente observada em tumores e lesões pré-cancerosas e induz a formação de tumores em estudos com animais. expressão do EGFR no cancro da bexiga prediz independentemente a progressão da doença e mortalidade, e ambos VEGF e EGFR estão a emergir como alvos importantes para o tratamento de cancro da bexiga metastático [25]. . É possível que estes EGFR SNPs podem afetar a transcrição do gene, alterando assim o nível de proteína, ou podem estar ligados a outras variantes causais em

EGFR

Além disso, também identificamos

Smad3

: rs12324036 significativamente associada com o risco de câncer. É sabido que o TGF-β /Activina sinalização /nodal é transduzida por Smad2 e Smad3, e aumento do nível de TGF-β1 pode reverter o fenótipo maligno de um fenótipo menos agressivo em linha de células de rato carcinoma da bexiga sem TGF-β1 [27]. Nosso estudo anterior também identificou

Smad3

: rs11632964 sendo significativamente associada com a sobrevivência do cancro do pulmão geral [28], que também destaca o importante papel da Smad3 no câncer. É possível que o alelo variante de

Smad3:

rs12324036 podem afectar a transcrição do gene, assim, alterando o nível de proteína. Alternativamente, pode ser ligada a outras variantes causais em

Smad3

. No geral, nosso estudo destaca a associação de

EGFR VEGFC

, e

Smad3

polimorfismos com risco de câncer de bexiga.

A seguir, aplicou uma abordagem baseada em via de avaliar exaustivamente o efeito dos nove SNPs significativas (

Q Restaurant 0,1) sobre o risco de cancro da bexiga. Nós identificamos um efeito gene-dosagem para os nove SNPs que foram significativos após o ajuste de comparação múltipla. Aqueles com 5~9 genótipos de risco tiveram o maior risco de cancro da bexiga, sugerindo variações adicionais dentro desta via key foi prejudicial e teve um efeito maior do que qualquer única variante. Além disso, a magnitude de cada SNP indivíduo era modesto, mas o risco para indivíduos com 5-9 desses genótipos de risco foi mais do que duplicou. Isso também enfatiza a importância de incluir vários SNPs dentro de um caminho compartilhado para examinar efeitos conjuntos na avaliação de risco.

No âmbito de uma via, a hipótese de que interações gene-gene seria ainda mais modular o risco de cancro da bexiga . Foram observadas interações gene-gene potenciais entre três variantes, com

VEGFC:

rs3775194 sendo o desdobramento inicial em nossa análise CART, sugerindo sua importância na determinação da maior parte da variação no risco. Os indivíduos portadores do genótipo comum para

VEGFC

: rs3775194 e

EGFR: rs7799627 eo genótipo variante para

VEGFR

: rs4557213 tiveram um aumento de 4,22 vezes no risco, um tanto maior a magnitude do efeito do que o conferido pelo genótipo comum para

VEGFR

:. rs4557213

Em resumo, temos realizado uma análise baseada em via de genes da via TGF-beta e risco de câncer de bexiga. Estes dados fornecem informações genéticas importantes para a previsão de indivíduos em risco de cancro da bexiga e identificar tumores numa fase inicial, curável. Além disso, nossa consulta relativamente abrangente de polimorfismos da via TGF-beta e nossa grande população com informações detalhadas de risco fornecem evidências substanciais para o envolvimento de SNPs como preditores ou moduladores de risco de cancro da bexiga. No entanto, existem algumas limitações em nosso estudo. Por exemplo, mais de mapeamento fino e ensaios funcionais são necessárias para revelar os mecanismos moleculares potenciais desses SNPs ou outros polimorfismos causais ligados. Além disso, somente os caucasianos foram incluídos neste estudo. Seria interessante para exame desses SNPs em populações minoritárias. Finalmente, embora os nossos dados são validados em grande parte, internamente, são necessários estudos de replicação futuras em populações independentes para validar alguns dos resultados.

Informações de Apoio

Tabela S1.

genes da via TGF-β selecionados para este estudo

doi:. 10.1371 /journal.pone.0051758.s001

(DOC)