Abstract
A segmentação de «condutor» oncogênico quinases com inibidores de pequenas moléculas provou ser uma estratégia terapêutica altamente eficaz em pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) selecionado. No entanto, a resistência adquirida a terapias específicas, invariavelmente surge e é uma grande limitação para o atendimento ao paciente. proteínas de fusão ROS1 são uma classe recentemente descrita de motorista oncogênicos, e pacientes com NSCLC que expressam estas fusões geralmente respondem bem à terapia ROS1-alvo. Neste estudo, buscou-se determinar os mecanismos de resistência adquirida à inibição ROS1. Para alcançar este objetivo, analisamos amostras de tumor de um paciente que inicialmente responderam ao crizotinib inibidor ROS1 mas eventualmente desenvolveu a resistência adquirida. Além disso, geramos um derivado de inibição resistente ROS1 do inicialmente sensíveis NSCLC linha de células HCC78. Anteriormente mecanismos de resistência adquirida descrito para inibidores da tirosina cinase incluindo mutação alvo quinase-domínio, o ganho de número de cópias do alvo, a transição epitelial-mesenquimal, e a conversão para histologia do cancro do pulmão de células verificou-se não pela resistência na amostra do paciente ou linhagem de células resistentes. No entanto, conseguimos observar um interruptor no controle do crescimento e sobrevivência vias de sinalização de ROS1 para EGFR na linha de células resistentes. Como resultado deste interruptor, células HCC78 inibição resistente ROS1 tornou-se sensíveis à inibição de EGFR, um efeito que foi aumentada por co-tratamento com um inibidor ROS1. Nossos resultados sugerem que a co-inibição da ROS1 e EGFR pode ser uma estratégia eficaz para combater a resistência à terapia-alvo em alguns pacientes com NSCLC de fusão positivo ROS1
Citation:. Davies KD, Mahale S, Astling DP, Aisner DL , Le AT, Hinz TK, et al. (2013) Resistência à ROS1 inibição mediada pelo EGFR via de ativação em Non-Small Cell Lung Cancer. PLoS ONE 8 (12): e82236. doi: 10.1371 /journal.pone.0082236
editor: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Estados Unidos da América
Recebido: 17 de junho de 2013; Aceito: 22 de outubro de 2013; Publicação: 13 de dezembro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Davies et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo financiamento da investigação da Liga do Câncer do Colorado para KD Davies, o Prêmio Biomedical Research Foundation Boettcher Webb-Waring para R.C. Doebele, e da Universidade de concessão Colorado Lung Cancer SPORE (P50CA058187) para M. Varella-Garcia e R.C. Doebele. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados ou análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:. D. L. Aisner recebeu honorários da Abbott Molecular. P.A. Bunn Jr. recebeu honorários de consultoria da Pfizer, Novartis, Genentech /Roche, AstraZeneca, Boehringer Ingelheim, Astellas, e GlaxoSmithKline. D. R. Camidge recebeu honorários do conselho consultivo da Pfizer. R.C. Doebele recebeu financiamento da investigação, honorários de consultoria e honorários do conselho consultivo da Pfizer, honorários da Abbott Molecular, honorários de consultoria e honorários do conselho consultivo da Boehringer Ingelheim, financiamento de pesquisa da ImClone e financiamento para pesquisa da Eli Lilly. Não há patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.
Introdução
O cancro do pulmão, dos quais cerca de 80-85% podem ser classificados como não-pequenas cancro do pulmão de células (NSCLC), é a principal causa de mortalidade relacionada com o cancro no mundo [1]. Recentemente, tornou-se claro que a NSCLC é uma doença heterogénea, que pode ser em grande parte subdivididas de acordo com alterações genéticas que criam oncogenes dominantes do controlador [2]. As células tumorais são frequentemente NSCLC “viciado” para estes oncogenes activados, de tal modo que a inibição de seus blocos actividade proliferativa e sinalização celular pró-sobrevivência, em última análise conduzindo à paragem do crescimento e /ou a morte celular. Mais importante, muitos dos controladores descobertos até à data oncogénicos são quinases que podem ser visados pelos inibidores de moléculas pequenas activado. Gefitinib e erlotinib tratamento de pacientes com NSCLC ancorando
EGFR
mutações ativadoras e crizotinib tratamento de pacientes com NSCLC abrigar ativando
ALK
rearranjos são exemplos de sucesso dessa estratégia [3], [4]. O tratamento com estes fármacos inibidores quinase resulta na melhoria da eficácia e tem efeitos secundários mais toleráveis em comparação com quimioterapias convencionais em pacientes que são pré-pesquisadas quanto à alterações genéticas de activação [5], [6], [7].
apesar da eficácia inicial de gefitinib, erlotinib, e em doentes com NSCLC crizotinibe seleccionados, invariavelmente, a resistência adquirida surge, tipicamente em menos de um ano. Ao nível celular, esta resistência ocorre por vários mecanismos. O primeiro destes é a mutação do domínio quinase alvo que reduz a capacidade do fármaco para inibir a quinase. Por exemplo, a mutação T790M, denominada mutação ‘gatekeeper’, reduz a capacidade de inibidores de EGFR para outcompete ATP de ligação a EGFR [8]. Esta mutação (juntamente com outras mutações associadas à resistência muito menos frequentes) encontra-se em modelos de linhas celulares de resistência e em aproximadamente 50% dos doentes que desenvolvem adquiriram resistência a inibidores de EGFR [9], [10], [11]. A possibilidade de controlar análoga em ALK, L1196, encontra-se de forma semelhante a ser mutado no cancro do pulmão de fusão-positivos de ALK, no momento de resistência à Crizotinibe e em modelos de linhas celulares resistentes, assim como vários outros aminoácidos para os quais mutação também reduz a capacidade de o medicamento para inibir a quinase [12], [13], [14], [15], [16]. O segundo mecanismo de resistência é a amplificação do alvo quinase. Em teoria, um aumento na quantidade de quinase que é expresso pela célula pode reduzir a capacidade do fármaco para saturar o alvo. A amplificação do
ALK
fusões foi demonstrada em células resistentes e pacientes que desenvolveram resistência [13], [14], [16]. Além disso, a amplificação de
EGFR
tem sido correlacionado com a resistência em
EGFR mutante
cancro do pulmão, embora na maioria dos casos, o alelo amplificado abriga a mutação T790M [17], [18]. Outra importante mecanismo de resistência é a activação dos componentes de sinalização alternativos. Neste caso, as proteínas que estão a jusante ou a partir de que a função em paralelo com a quinase alvo tornar-se activado e subverter a dependência da quinase alvo para estimular exclusivamente proliferativa e pró-sobrevivência de sinalização. TEM, PI3K, BRAF, IGF-1R, FGFR1, MEK e ERK1 2 activação /têm sido observados em inibidores resistente
EGFR mutante
doença e /ou modelos de linhas celulares de EGFR [18], [19] , [20], [21], [22], [23], [24]. Activação ou amplificação de EGFR, KRAS, e KIT têm sido igualmente observado em crizotinib resistente
ALK
pacientes rearranjados e linhas celulares [14], [15], [16], [25]. Além disso, um estudo recente demonstrou que a exposição a factores de crescimento comum é suficiente para induzir a resistência a terapias específicas em linhas de células de cancro a partir de uma variedade de origens genéticas, e este efeito correlacionada com um resgate de AKT induzida por droga e ERK inactivação [26]. Finalmente, as alterações histológicas e morfológicas foram demonstrou estar correlacionada com a resistência. Especificamente, a conversão para histologia do cancro do pulmão de pequenas células e de transição epitelial-mesenquimal (EMT) foram observados em
EGFR mutantes
pacientes e linhas de células resistentes a inibidores de EGFR [11], [18]. As bases mecanicistas por trás dessas mudanças não são completamente compreendidos.
ROS1
é um receptor tirosina quinase que está intimamente relacionado com
ALK
, e, como
ALK
, que sofre rearranjo genómico que cria proteínas de fusão em NSCLC e outros cancros [27]. Está bem estabelecido que estas proteínas de fusão actuam como condutores oncogénicos e que a inibição é ROS1 anti-proliferativa em células que expressam as fusões ROS1 [28]. Além disso, crizotinib, que tem atividade contra ROS1, está demonstrando eficácia no
ROS1
pacientes com NSCLC de fusão positivo em um ensaio de fase I [29]. Assim, considerando o sucesso do crizotinib em
ALK
fusão positivo NSCLC, parece que ROS1 terapia-alvo provavelmente vai em breve ser o padrão de tratamento para esta população de pacientes. No entanto, com base nas experiências com outros inibidores de cinase em cancro do pulmão, é totalmente esperado que a resistência adquirida à inibição ROS1 irá ocorrer, e isto irá limitar as opções de tratamento para estes pacientes. Em apoio a isso, um estudo recente relatou um caso clínico de um paciente
ROS1
rearranjo-positivos que desenvolveram resistência a Crizotinibe na sequência de uma resposta inicial [30]. O paciente foi encontrado para ter sofrido uma mutação no
ROS1
domínio quinase que interferiu com a droga vinculativo [30]. Neste estudo, buscou-se determinar os mecanismos de resistência à inibição ROS1. Isto foi realizado utilizando amostras clínicas de um paciente que se tornou resistente a Crizotinibe e um derivado de inibição resistente ROS1 do
ROS1
reorganizados linha celular NSCLC HCC78.
Resultados
relatado anteriormente a identificação de um paciente NSCLC que expressou o
SDC4-ROS1
de fusão e o sucesso do tratamento deste paciente com crizotinib [28]. O doente apresentou 57% de encolhimento do tumor após dois ciclos de tratamento de 28 dias. No entanto, apesar da terapia contínua, evidência de progressão da doença foi descoberto aproximadamente 18 semanas após o início do tratamento. Neste momento, uma biópsia de excisão do tumor foi feita progredir. sequenciamento alvo desta amostra de biópsia resistentes revelou que, à semelhança da biópsia pré-tratamento, toda a
ROS1
domínio quinase foi do tipo selvagem (WT), significado que
ROS1
mutação domínio quinase foi não o mecanismo de resistência (Tabela 1). análise SNaPshot também indicou estado de WT de resíduos comumente mutado em vários outros oncogenes conhecidos (incluindo
EGFR
,
KRAS
, e
BRAF
), tanto no pré-tratamento e pós -resistência amostras (Tabela 1). Em seguida, examinou ganho número de cópias do gene de fusão
ROS1
como um mecanismo potencial de resistência. Isto foi conseguido usando fluorescência
hibridação in situ
(FISH) com sondas para ambas as regiões 5 ‘e 3’ do gene. O sinal de média única 3 ‘(representante do gene de fusão) número por célula tumoral foi de 1,7 na amostra pré-tratamento e 1,82 na amostra de pós-resistência, uma diferença não significativa (Figura 1A). Esta constatação sugeriu que o ganho de número de cópias não era o mecanismo de resistência no tumor desse paciente. A amostra de pós-resistência revelou uma perda de sinal único 5 ‘; No entanto, este não deverá ser funcionalmente significativa (Figura 1A). Verificou-se que o gene de fusão foi a ser expresso no momento de resistência, e que a proporção de tempo (
SDC4
exão 2 fundido com
ROS1
exão 32 (SD2; R32)) para curto (
SDC4
exão 2 fundido com
ROS1
exão 34 (SD2; R34)) variantes foi semelhante à amostra pré-tratamento (Figura 1B). exame morfológico das amostras tomadas a resistência demonstrou células epitelióides gordas com uma grande proporção nuclear para citoplasmático, nucléolos proeminentes e citoplasma eosinófilo, semelhante à biópsia pré-tratamento (Figura 1C). Estes achados sugerem que a transformação de pequenas células não tivesse ocorrido. Finalmente, nenhuma evidência morfológica de EMT, tais como alongando celular, foi observada, e a biópsia tomada na resistência coloração imuno-histoquímica demonstrou negativo para vimentina, um marcador de EMT (Figura S1). A falta de provas para estes mecanismos de resistência comuns foi sugestivo de regulação positiva de sinalização alterative como o mecanismo subjacente de resistência à Crizotinibe neste paciente.
(a) pré-tratamento e pós-resistência amostras de pacientes analisados por break- ensaio de FISH para além de
ROS1
. sondas vermelhas são a “região de ROS1 e sondas verdes para 3 ‘a 5 região. Os valores representam a média do número de sinais por célula. O único sinal 3 ‘(valores sublinhados) é indicativo da
ROS1
número de cópias do gene de fusão. (B) RT-PCR, utilizando iniciadores para
SDC4
e
ROS1
que abrangem o ponto de fusão, realizada em pré-tratamento e amostras de tumores pós-resistência. SD2; R32 é a variante ‘long’ (fusão de
SDC4
exão 2 a
ROS1
exão 32) e SD2; R34 é o “curto” variante (fusão de
SDC4
exão 2 a
ROS1
exão 34). (C) hematoxilina e eosina de pré-tratamento e pós-resistência amostras de pacientes.
A fim de criar um modelo de linha de células de resistência à inibição ROS1, nós tratados cronicamente o
SLC34A2-ROS1
expressar NSCLC linha de células HCC78 com concentrações crescentes do TAE684 inibidor ROS1. Este método tem sido utilizado anteriormente para criar modelos resistentes para ambos os inibidores de EGFR em
EGFR
células mutantes e crizotinib em
ALK
células rearranjados e os mecanismos observadas nesses modelos têm correlacionado com o que é observado em pacientes [13], [15], [19]. Nós escolhemos usar TAE684 (um composto não-clínica) sobre crizotinib (uma droga com atividade clínica contra ROS1) porque crizotinib tem um relativamente elevado IC
50 em HCC78 células e apenas a muito estreitas janelas saídas entre o IC
50 e para fora do alvo actividades da droga [28], [31]. Em outras palavras, através da utilização TAE684 para tornar as células resistentes à inibição ROS1 em vez de crizotinibe, fomos capazes de garantir uma inibição mais completa da proteína de fusão ROS1 em doses que não exibem efeitos fora do alvo anti-proliferativas. Após cerca de quatro meses de cultura em concentrações crescentes, o derivado resistente da linha HCC78, que denominado HCC78-TR, era capaz de proliferar normalmente em 500 nM TAE684. Tentativas iniciais para aumentar a dose de cultura ainda não tiveram sucesso, por isso foi considerado de 500 nM de um máximo e as células foram cultivadas continuamente em esta concentração de droga. Quando a sensibilidade destas células à TAE684 foi analisada em ensaios de proliferação, determinou-se que o IC
50 de TAE684 era superior a 1 uM (Figura 2A). Isso é semelhante a outras linhas celulares de NSCLC que não contêm ALK ou fusões ROS1 (H322 e HCC4006), sugerindo que os efeitos anti-proliferativos nesta gama são provavelmente devido a actividades fora do alvo. células HCC78-TR foram também menos sensível a Crizotinibe, e mais uma vez, o nível de sensibilidade era mais semelhante às células que não expressam ALK ou fusões ROS1 (Figura 2B). No entanto, a dessensibilização específica foi a inibição ROS1, como as células HCC78-TR retiveram a sua sensibilidade ao pemetrexed, uma quimioterapia aprovado pela FDA para o cancro do pulmão de não-escamosa (Figura 2C). A resistência à inibição ROS1 não era dependente da cultura contínua, na presença de 500 nM TAE684, porque as células que foram retiradas de droga permaneceu resistente até 6 meses e 47 passagens (Figura S2).
Células foram tratados com TAE684 (a), crizotinibe (B), ou pemetrexed (C), como agentes únicos-durante 3 dias e depois analisadas por ensaio de MTS. Os valores representam a média ± SEM (n = 3-7). Calculado CI
50 valores para TAE684: HCC78 parental = 0,14 uM, HCC78-TR = 1,09 uM, H322 = 1,42 uM e 1,15 uM HCC4006 =. IC calculado
50 valores para crizotinibe: HCC78 parental = 0,79 uM, HCC78-TR = 1,95 uM, 4,13 uM H322 =, e HCC4006 = 3,03 uM. Calculado IC
50 valores para pemetrexed: HCC78 parental = 11 nM e HCC78-TR = 14 nM. células HCC78-TR foram significativamente menos sensíveis do que as células HCC78 parentais para TAE684 (p 0,000005) e crizotinibe (p 0,05), mas não pemetrexed (p 0,05)., tal como determinado pelo teste t de Student pareado
a sequenciação do HCC78 parental e as células HCC78-TR indicou que o domínio de cinase do
ROS1
foi WT para ambas as linhas, sugerindo que
ROS1
mutação não foi responsável pela resistência à inibição ROS1 (Tabela 1).
EGFR
,
KRAS
, e
BRAF
também foram encontrados para ser WT em ambas as linhas de células (Tabela 1). análise FISH demonstrado que as células HCC78-TR perdido uma cópia do gene de fusão
ROS1
, em comparação com a linha parental (uma cópia vs 2 cópias, respectivamente), sugerindo que o aumento de número de cópias do gene de fusão era não o mecanismo de resistência (Figura 3A). Como resultado da perda de uma cópia genómica do gene de fusão, menos
SLC34A2-ROS1
ARNm foi expressa nas células HCC78-tr (Figura S3). Embora o significado da expressão do gene de fusão reduzida é claro, forçado a expressão de uma proteína de fusão ROS1 activado (SDC4-ROS1) nas células HCC78-TR não re-sensibilizar para TAE684 (Figura S4). Aproximadamente 40% das células HCC78-TR apresentado um aumento do número de cópias da região 5 ‘de
ROS1
(a partir de 2 a 4 cópias de cópias), embora este não se espera que seja funcionalmente significativo como o a região 5 ‘não apresentam actividade de quinase (Figura 3A). Além disso, a morfologia das células HCC78-TR não visualmente diferente do que a linha de HCC78 parental, sugerindo que a conversão para uma morfologia do cancro do pulmão de pequenas células não ocorrer (Figura 3B). Por quantificação de ARNm,
CDH1
níveis foram semelhantes entre as duas linhas de células e
VIM
níveis foram reduzidos de 3 vezes na linha HCC78-TR (Figura S5). Estes resultados sugerem que a EMT não era o mecanismo de resistência. Finalmente, não se observou um aumento significativo na expressão de mRNA de qualquer um dos de ligação a ATP a família de genes da cassete do transportador no células HCC78-TR, sugerindo que o efluxo de fármaco melhorada provavelmente não conta para a resistência à inibição ROS1 (Tabela S1). células
(a) HCC78 parental e HCC78-TR analisados por ensaio FISH quebra-apart para
ROS1
. sondas vermelhas são a “região de ROS1 e sondas verdes para 3 ‘a 5 região. Os valores representam o número de sinais por célula. O único sinal 3 ‘(valores sublinhados) é indicativo da
ROS1
número de cópias do gene de fusão. Na linha HCC78-TR, existiam duas populações que diferiam com base no número de 5 ‘sinais detectados. (B) representativos imagens de campo claro de HCC78 parental e as células HCC78-TR.
Em seguida, perguntou se a resistência à inibição ROS1 poderia ser devido a mudanças na sinalização celular a jusante. células HCC78-TR HCC78 parental e foram tratados com uma dose-gama de TAE684 durante 4 horas e, em seguida os lisados celulares foram analisados por Western blot. À semelhança do que já relatado anteriormente, o tratamento TAE684 reduzida ROS1 autofosforilação e ativação de fosforilação da SHP-2, AKT e ERK1 /2 nas células HCC78 parentais (Figura 4A) [28]. Como previsto a partir da perda genómico número de cópias do
ROS1
gene de fusão e a expressão de ARNm reduzida, as células HCC78-TR expressos menos da proteína de fusão do que a linha parental e ROS1 autofosforilação não pôde ser detectado. A redução na quantidade de proteína de fusão ROS1 correlacionada com a redução da fosforilação basal de SHP-2. No entanto, apesar da perda de proteína de fusão, os níveis basais de ERK1 /2 foram semelhantes para a linha parental e níveis basais de AKT fosforilado foram maiores do que na linha parental. Mais importante, o tratamento TAE684 não resultou em DE-fosforilação de AKT ou de ERK1 /2 em células resistentes. Resultados semelhantes foram observados com o tratamento crizotinibe (Figura 4B).
As células foram tratadas com TAE684 (A) ou crizotinibe (B) durante 4 horas. Os lisados das células foram então analisadas por transferência de Western utilizando os anticorpos indicados.
A redução na quantidade da proteína de fusão expressa ROS1, a persistência de AKT basal e ERK1 /2 de activação, e a falta de inibição de AKT e ERK1 /2 por os inibidores ROS1 sugeriu que uma via de sinalização alternativa estava a ser activado nas células HCC78-TR. Na tentativa de identificar as componentes da via regulada positivamente, foram realizadas duas experiências de matriz fosfo-proteína: um que examinou tirosina-quinases receptoras (RTKs) e um que analisou quinases a jusante (entre outras proteínas). Como observamos anteriormente, a linha HCC78 parental expressa EGFR fosforilada e MET quando examinado com a matriz de fosfo-RTK (Figura 5A) [28]. A linha HCC78-TR ainda expressa EGFR fosforilado, mas fosfo-MET foi significativamente reduzida (Figura 5A). Não foram observadas outras tirosina-quinases receptoras significativamente fosforiladas. Como previsto a partir da análise de Western Blot, fosfo-AKT S473 foi aumentada nas células HCC78-TR, em comparação com as células parentais, assim como os vários locais de fosforilação de p53 sobre (Figura 5A). Estas foram as únicas diferenças observadas pela matriz fosfo-proteínas.
(A) Phospho-RTK (topo) e fosfo-quinase (parte inferior) matriz análises realizadas em HCC78 parental não tratada e as células HCC78-TR. As proteínas de interesse são rotulados. manchas não marcados nos cantos de ambos os conjuntos de matrizes são o controlo positivo. células HCC78-TR (B) HCC78 parental e foram tratados com TAE684, gefitinib, ou uma combinação de ambos, durante 4 horas. Os lisados das células foram então analisadas por transferência de Western utilizando os anticorpos indicados. células (C) HCC78 parental (P) e HCC78-TR (T) foram deixados sem tratamento, tratou-se com 1 uM de gefitinib durante 4 horas, ou tratados com 100 ng /ml de EGF durante 10 minutos. Os lisados das células foram então analisadas por transferência de Western utilizando os anticorpos indicados.
Demonstrámos anteriormente que a sinalização do EGFR é parcialmente activa na linha HCC78 parental, tal como um efeito anti-proliferativo de TAE684 potente poderia só pode ser conseguido com o co-tratamento com o inibidor de EGFR gefitinib [28]. Devido às observações que o EGFR foi a RTK única significativamente fosforilada na linha HCC78-TR, e que a AKT, que é normalmente activada a jusante de EGFR, foi mais fortemente fosforilada na linha HCC78-TR, a hipótese de que, talvez, a sinalização do EGFR tinha sido ainda mais envolvida nas células resistentes. Para testar esta hipótese, foram tratados HCC78 parental e células HCC78-TR com 200 nM TAE684, 1 uM gefitinib, ou uma combinação de ambos, durante 4 horas. Mais uma vez, fosfo-AKT e fosfo-ERK1 /2 foram sensíveis ao tratamento TAE684 na linha parental, mas não a linha HCC78-TR (Figura 5B). No entanto, a situação foi revertida em que estas linhas foram tratados com gefitinib, com sinalização a jusante ser sensível na linha HCC78-TR, mas não a linha parental (Figura 5B). Efeitos similares foram observados com o quimicamente distinto inibidores de EGFR erlotinib, lapatinib, e afatinib, sugerindo que os efeitos foram devidos à inibição do EGFR em-alvo (Figura S6). Assim, WT EGFR tinha-se tornado o condutor dominante do crescimento e sobrevivência vias de sinalização nas células HCC78-TR. Esta mudança na sinalização celular associado com um modesto aumento nos níveis totais de EGFR nas células HCC78-TR, em comparação com as células parentais HCC78 (Figura 5C). A autofosforilação do EGFR, como determinado por transferência de Western utilizando um cocktail de anticorpos específicos do local de fosforilação, era relativamente baixa em ambas as linhas celulares. No entanto, por estimulação com o ligando EGF do EGFR, a autofosforilação foi aumentada e foi mais elevada nas células HCC78-tr (Figura 5C). ARNm de quantificação revelou que a maioria dos ligandos de EGFR não foram significativamente mais expressa nas células HCC78-TR, com a excepção de NRG1 que apresentaram um aumento de 4 vezes nos níveis de ARNm (Figura S7).
Devido ao comutador em controlo do crescimento e sobrevivência de vias de sinalização ROS1 a EGFR nas células HCC78-TR, a hipótese de que a proliferação destas células seria sensível à inibição de EGFR. Para testar esta hipótese, foram tratados tanto as células HCC78 e HCC78-TR parentais com gefitinib como um agente único em ensaios de proliferação. Como já relatado anteriormente, gefitinib em concentrações até 5 uM não alterou a proliferação de células parentais HCC78 (Figura 6A) [28]. No entanto, a droga modestamente inibiu a proliferação de células HCC78-TR (Figura 6A). Efeitos similares foram observados com erlotinib (dados não mostrados). Em seguida, a hipótese de que, uma vez que as células HCC78-TR ainda expressa alguns, se bem que níveis reduzidos de proteína de fusão ROS1, um efeito anti-proliferativo completo induzida por gefitinib exigiria co-inibição de ROS1. Para testar esta hipótese, as células tratadas HCC78-TR com uma gama de dose de gefitinib em combinação com 500 nM TAE684 (a concentração de droga que estas células foram cultivadas continuamente em). A adição de 500 nM TAE684 não teve qualquer efeito anti-proliferativo em si próprio; No entanto, isso ainda mais as células sensibilizadas para tratamento com gefitinib (Figura 6B). Sob estas condições, as células HCC78-TR não foram tão sensíveis como a linha de células NSCLC HCC827 que é accionado por E746_A750del EGFR. Isto é esperado porque a activação de mutações de EGFR em aumentar a sua afinidade para EGFR inibidores de quinase [32]. No entanto, as células HCC78-TR foram tão ou mais sensíveis do que as que expressam o EGFR WT linhas de NSCLC H358 e H322, respectivamente (Figura 6B). Estas duas linhas de células têm sido relatados para ser altamente sensíveis a gefitinib quando em comparação com outros WT EGFR que expressam linhas de NSCLC [33]. Importante, nas células HCC78-TR, a actividade anti-proliferativa significativa foi observada em doses clinicamente relevantes de gefitinib (~ 1 ^ M) quando combinada com a inibição ROS1 [34].
(A) HCC78 parental e HCC78- TR células foram tratadas com gefitinib como um agente único durante 3 dias e depois analisadas por ensaio de MTS. (B) e células parental HCC78 HCC78-TR foram co-tratadas com 500 nM TAE684 e gefitinib, e HCC827, H322, H358 e as células foram tratadas com o agente único gefitinib durante 3 dias e depois analisadas por ensaio de MTS. Calculado IC
50 valores: HCC78 parental (abaixo de 50% com o agente único TAE684), HCC78-TR = 0,86 mM, HCC827 = 0,04 mM, H322 = 5 mM, e H358 = 1,0 uM. Todos os valores representam a média ± SEM (n = 4).
Como uma prova de conceito que a ativação do EGFR pode de-sensibilizar células-driven fusão ROS1 à inibição ROS1, examinamos o efeito de a activação do receptor induzida por ligando na sensibilidade. Para alcançar este objetivo, foi realizada ensaios de proliferação examinando a sensibilidade à TAE684 na ausência ou na presença do ligando de EGFR EGF. Nós descobrimos que a adição de EGF no início do ensaio insensíveis significativamente as células parentais HCC78 à inibição da ROS1 (Figura 7A). Em contraste, o EGF não teve nenhum efeito sobre a sensibilidade das células HCC78-TR, o que era esperado devido à insensibilidade já máxima desta linha (
CF
Figura 2A). Mecanisticamente, a dessensibilização das células parentais HCC78 correlacionada com um resgate por EGF do induzida por TAE684 de-fosforilação de AKT e ERK1 /2 (Figura 7B).
HCC78 células parental e HCC78-tr (A) foram tratados com TAE684 durante 3 dias com ou sem a adição de 100 ng /ml de EGF e, em seguida, analisados pelo ensaio de MTS. Os valores representam a média ± SEM (n = 3). Calculado IC
50 valores para TAE684: parental + veículo = 0,18 mm, parental + EGF = 0,57 mM, HCC78-TR + veículo = 1,39 mM, e HCC78-TR + EGF = 1,45 mM. EGF insensíveis significativamente HCC78 parental, mas não células HCC78-TR a TAE684 como determinado pelo teste t de Student pareado (p 0,05). (B) Células parentais HCC78 foram tratados com TAE684 durante 4 horas, o EGF durante 10 minutos, ou uma combinação de ambos. Os lisados das células foram então analisadas por transferência de Western utilizando os anticorpos indicados. (C) 2-CUTO células foram tratadas com TAE684 durante 4 dias, com ou sem a adição de 100 ng /ml de EGF e, em seguida, analisados pelo ensaio de MTS. Os valores representam a média ± SEM (n = 3). IC calculado
50 valores para TAE684: + veículo = 0,2 uM e + EGF = 0,81 uM. EGF insensíveis significativamente células Cuto-2 para TAE684 como determinado pelo teste t de Student pareado (p 0,01). (D) As células CUTO-2 foram tratadas com TAE684 durante 4 horas, o EGF durante 10 minutos, ou uma combinação de ambos. Os lisados das células foram então analisadas por transferência de Western utilizando os anticorpos indicados. bandas fosforilada ROS1 estavam abaixo do limite de detecção e, por conseguinte, não foram incluídos.
A linha celular foi derivada a partir da biópsia do que foi feita a partir de tumor resistentes do paciente. Estabelecimento de esta linha de células, que têm denominado Colorado University Oncologia Torácica-2 (CUTO-2), levou cerca de um ano em cultura e foi realizada na ausência de um inibidor de ROS1. Quando as células atingiram número suficiente passagem ( 35 passagens) e taxa de crescimento suficiente para análise experimental, examinamos ROS1 status de fusão do gene, a expressão da proteína de fusão ROS1, e sensibilidade à inibição ROS1. As células CUTO-2 foram verificados para ainda apresentam rearranjo da
ROS1
gene e expressar uma proteína de fusão ROS1 (Figura S8A, B). Em ensaios de proliferação, as células CUTO-2 demonstrou uma sensibilidade semelhante à TAE684 e um ligeiro aumento da sensibilidade à Crizotinibe em comparação com as células parentais HCC78 (Figura 7C e Figura S8C). Curiosamente, tal como as células parentais HCC78, sensibilidade à inibição ROS1 pode ser reduzido por aplicação de EGF e esta dessensibilização correlacionada com resgate de redução induzida por TAE684 de AKT fosforilado e ERK1 /2 (Figura 7 C e D).
discussão
adquirido resistência a terapias-alvo é uma grande limitação para o tratamento de pacientes com câncer de pulmão. No entanto, as abordagens racionais para combater a resistência pode ser desenvolvida uma vez que os mecanismos moleculares e celulares que estão subjacentes são identificados. Neste estudo, foram investigados os mecanismos de resistência a inibição ROS1 em NSCLC. Isto foi realizado usando amostras de tumor de um paciente NSCLC que se tornou resistente a Crizotinibe e uma linha de células NSCLC que fizemos resistente à inibição ROS1 por cultura contínua no TAE684 inibidor ROS1. Idealmente, os estudos realizados para examinar mecanismos de resistência envolvem bancos da amostra de vários pacientes e várias linhas de células diferentes. No entanto, como
ROS1
rearranjos só estão presentes em 1-2% dos pacientes com NSCLC, que só tinha acesso a um paciente que se tornaram resistentes ao tratamento. Além disso, antes da derivação da linha CUTO-2, HCC78 foi a única linha de células NSCLC publicada conhecida para expressar uma proteína de fusão ROS1. Apesar destas limitações, os resultados deste estudo têm implicações importantes para
pacientes ROS1
rearranjo-positivos que se tornam resistentes à Crizotinibe tratamento. Antes do nosso estudo, apenas um relatório publicado identificou um mecanismo de resistência à inibição ROS1. No estudo de Awad et al., A
ROS1
paciente rearranjo positivo que inicialmente respondeu a Crizotinibe mas tornou-se resistente foi encontrada para ter adquirido uma mutação no códon 2032 de um gene de fusão
ROS1
(
CD74-ROS1
). Esta mutação foi demonstrada para interferir com a ligação ao local crizotinibe ROS1 de ligação de ATP [30].