Abstract

O butirato, um produto de fermentação da fibra no cólon, age como um inibidor da histona deacetilase (HDACi) e induz apoptose em câncer de cólon (CC) células

in vitro

. Nós relataram que os efeitos apoptóticos de butirato são dependentes da hiperactivação da via Wnt /beta-catenina. No entanto, a exposição prolongada das células a concentrações crescentes de CC de resultados de butirato na aquisição de resistência a /beta-catenin- Wnt e efeitos indutores de apoptose de este agente, bem como uma resistência cruzada aos estruturalmente diferentes HDACis. Aqui nós relatamos que um mecanismo pelo qual a resistência HDACi se coloca é através do aumento da sinalização beta-catenina-independente (não-canônico) Wnt. Em comparação com células HCT-116 CC HDACi-sensíveis, as células HCT-R resistentes-HDACi exibem níveis mais elevados de sobrevivência celular AKT /PKB sinalização, que é, em parte, por genes WNT5A induzido e do seu receptor ROR2. A indução da sinalização de Akt por HDACis também é detectada em outras linhas de células de CC, embora em menor grau do que em células HCT-R resistentes aos medicamentos. As observações sugerem que o efeito apoptótico de butirato e outros HDACis em células de CC pode ser aumentada pelos inibidores de pAKT. De acordo com a hipótese, a combinação de MK2206, um inibidor de pAKT, e um HDACi (butirato ou LBH589) induziram maior apoptose em células de CC em comparação com cada um dos agentes isoladamente. A exposição a ambos os agentes também re-sensibilizados a células HCT-R para a apoptose. Finalmente, o conceito de induzir simultaneamente actividade Wnt canónica e suprimindo sinalização AKT foi traduzido para uma combinação de agentes derivados de dieta. Dieta derivado inibidores PAKT (éster phethyl ácido caféico, o sulforafano, dilallyl trisulfide) suprimiu os níveis induzida pelo butirato de pAKT, e aumentou os efeitos apoptóticos de butirato em células CC tanto de drogas sensíveis e resistentes aos medicamentos.

nossas descobertas pode ser traduzida em (a) a terapia CC empregando combinações de HDACis sintéticos e inibidores de pAKT, bem como (b) prevenção de CC com base em dietas que resultam em quantidades suficientes de inibidores à base de butirato e pAKT.

Citation : Bordonaro M, Tewari S, Cicco CE, Atamna W, Lazarova DL (2011) a Chave da Canonical para não-canônicos Wnt Signaling medeia resistência a drogas em células cancerígenas do cólon. PLoS ONE 6 (11): e27308. doi: 10.1371 /journal.pone.0027308

editor: Cara Gottardi, Northwestern University Feinberg School of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 05 de julho de 2011; Aceito: 13 de outubro de 2011; Publicação: 03 de novembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Bordonaro et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Darina Lazarova é suportado pelo NIH /NCI conceder # 1R15CA152852-01 e fundos institucionais da Commonwealth Medical College (Scratnon, PA). Michael Bordonaro é suportada pelo AICR concessão # 09A002, NIH /NCI-NIDDK # 1R15CA149589-01 e fundos institucionais da Commonwealth Medical College (Scratnon, PA). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Beta-catenina – sinalização Wnt dependente (canónica) é iniciada pela ligação de Wnt ligandos aos seus receptores de superfície celular, e esta ligação desencadeia uma cascata de acontecimentos intracelulares que conduzem à acumulação de Ser-37 /Thr- 41 desfosforilado beta-catenina. O beta-catenina é desfosforilado transcricionalmente activo, e que forma complexos com proteínas LEF /TCF para controlar a expressão de genes de centenas de [1] – [3]. A activação constitutiva de sinalização Wnt devido a mutações nos seus componentes, a APC e /ou beta-catenina, promove a tumorigénese no cólon [4] – [7], e tais mutações são característicos da maior parte dos cancros do cólon (CC). Observou-se que células de CC com mutações em componentes da via Wnt canónica sinalização hiper-induzir esta via, na presença de inibidores de histona-desacetilase (HDACIs), tais como butirato de etilo (um produto de fermentação da fibra no cólon), SAHA, MS275, e tricostatina A [8], [9]. Estes HDACis induzir apoptose em células de CC, e os níveis apoptóticos são dependentes da mudança vezes na actividade de Wnt canónica: células CC que exibem baixa indução da sinalização de Wnt /catenina na presença de HDACis são relativamente resistentes aos efeitos apoptóticos de agentes; No entanto, as células que sofrem activação significativa da via de sinalização Wnt canónica são altamente sensíveis a apoptose [8]. Nós estabelecemos que o aumento na actividade /catenina Wnt em células CC tratadas com butirato precede o evento de apoptose uma vez que (a) a inibição da apoptose por um inibidor geral de caspases não anula o aumento na actividade de Wnt /catenina (dados não publicados), e (b) fluxo de frações celulares citometria-ordenadas com alta de sinalização Wnt canônica consistem em ambos os vivos e células em apoptose; No entanto, se a apoptose era um pré-requisito para a indução de actividade de Wnt, todas as células com elevada actividade de Wnt deveria ter sido apoptótica [8]. A relação directa entre a indução vezes da actividade de Wnt /catenina e o grau de apoptose foi observada nas análises de dez linhas celulares CC humanas expostas ao butirato, e esta relação é causador já que: (a) as células que expressam induzivel dominante TCF4 negativo, o que suprime sinalização de Wnt /catenina, exibem diminuição da apoptose na presença de butirato de [8], e (b) fluxo de fracções de células por citometria-ordenadas com elevada actividade de Wnt canónica tem uma maior proporção de apoptose de células do que as fracções de células com níveis baixos de Wnt canónica viver actividade [8]. A constatação de que a hiper-activação de Wnt /beta-catenina resultados de sinalização em níveis elevados de apoptose [8], [9] é consistente com os relatórios que se dobram alterações em vias de sinalização, em vez de os níveis absolutos de sinalização, de eliciar a resposta fisiológica significativa a partir de células [10] – [12]

Através de análises de dez linhas celulares CC humanos, descobrimos que as células HCT-116 responder a butirato e outras HDACis com hiper-indução de níveis /sinalização catenina e altas Wnt. de apoptose [8]. No entanto, em caso de exposição gradual de células HCT-116 a concentrações crescentes de butirato, que derivada de células HCT-R butirato-resistente. Estas células crescem na presença de butirato 5 mM, uma concentração que induz níveis elevados de apoptose nas células HCT-116 parentais [9]. As células HCT-R são também uma resistência cruzada ao estruturalmente diferentes, tais como HDACis TSA, MS-275, SAHA, e LBH589 [9]. Uma vez que estabelecemos que (1) o resultado de apoptose em células de CC é dependente da indução da actividade de Wnt canónica [8], e (2) a hiper-activação da via de sinalização Wnt canónica em células CC tratadas com butirato é, em parte, iniciado em o nível de ligando-receptor [9], que postulado que as células CC resistentes à droga a droga-sensível e diferem na expressão dos ligandos, receptores, e ou moduladores WNT /positivos e negativos da sinalização de Wnt /catenina, no nível de ligando-receptor [8], [9]. No presente relatório nós investigamos essas possibilidades, e descobriram que as células CC sobreviver à exposição ao butirato ou outros HDACis, diminuindo a sinalização de Wnt canônica e aumentando a beta-catenin -. Sinalização independente (não-canônico) Wnt

Resultados

a expressão aumentada de mediadores de sinalização de Wnt não-canônico em células resistentes HDACi CC

Descrevemos previamente que o fenótipo resistente HDACi de células HCT-R não é devido a uma diminuição da acetilação de proteínas histona, mas em vez à incapacidade das células para hiper-induzir a sinalização de Wnt canónica para a mesma extensão que as células HCT-116 HDACi-sensíveis parentais [9]. Os nossos resultados sugerem que a supressão da actividade /catenina em células de Wnt-resistentes HDACi é devido à expressão alterada de ligandos Wnt, os seus receptores, e /ou moduladores da via de sinalização Wnt ao nível do receptor de ligando [9]. Para investigar esta possibilidade, foram analisados ​​os perfis de mock- e tratado com butirato de HCT-116 (HDACi-sensitive) e HCT-R (resistente HDACi) células por matrizes de PCR Wnt-específicas (SA Biosciences) de expressão. As análises revelaram que, por exposição ao butirato 5 mM, as células HCT-116 e HCT-R aumentou significativamente a expressão de

genes WNT5A

e

WNT11

ARNm (dados não mostrados), e que confirmaram esta mudança na expressão ao nível da proteína (Fig. 1A). Em comparação com células HCT-116, células HCT-R expressa níveis mais elevados de ambos os ligandos, e a presença de genes WNT5A segregada e WNT11 em meios de cultura de tecidos condicionado por células CC foi confirmada (Fig. 1A)

(A) western blot de células representativas analisa CC e dos seus meios condicionados, após a exposição a um tratamento simulado (H) ou butirato 5 mM (B) durante 19 horas. (B e C). Silenciamento de

genes WNT5A

e

ROR2

expressão aumenta Wnt atividade transcricional /catenina de células HCT-R (C) HCT-116 (B) e. As células (50.000 /poço) foram co-transfectadas com os repórteres para actividade de transcrição /catenina Wnt (TopFlash ou FopFlash, 50 ng /poço), pRL-TK como um controlo para a eficiência de transfecção, e de controlo,

ROR2

, ou

WNT5A

siRNAs (10 pmol /poço). Os ácidos nucleicos foram introduzidos nas células por meio de um protocolo de transfecção com lipofectamina 2000 reversa em placas de 96 poços. Em 31 horas após a transfecção, as células foram expostas durante 20 horas a zombar (m) ou tratamento de butirato 5 mM (b). Wnt actividade de transcrição foi calculada como a razão entre a actividade de TopFlash (com locais de ligação de tipo selvagem Lef /Tcf) e FopFlash (com locais de ligação mutantes Lef /Tcf). Cada transfecção foi efectuada em poços em duplicado; dados representam a média de resultados de três experiências. (D). A sobre-expressão de genes WNT5A suprimir a actividade transcricional de Wnt canónica de células HCT-116. A co-transfecção de células HCT-116 (50000 /cavidade) com o Wnt repórteres actividade TopFlash ou FopFlash (50 ng por poço), e pcDNANeo3.1 ou genes WNT5A que expressam a construção (150 ng por poço) foram realizados por meio de um inversa transfecção com lipofectamina (0,7 uL /​​poço) em placas de 96 poços. Pós-transfecção, as células foram expostas a tratamento simulado (m) ou butirato 5 mM (b) durante 20 horas. Cada transfecção foi efectuada em poços em duplicado; dados representam a média dos resultados de pelo menos três experiências. (E) Repressão de

ROR

dois expressão aumenta a sensibilidade das células resistentes HCT-HDACi-R para o efeito supressivo do crescimento da-butirato. As células HCT-R (10

6) foram nucleofected com 175 pmol de

ROR2

(Invitrogen) ou ARNsi de controlo, e 500.000 células foram plaqueadas por cavidade de uma placa de 6 poços. Às 24 horas, as células foram expostas a tratamento simulado (m) ou butirato 5 mM (b) durante 17 horas. Às 48 horas pós-Nucleofection, as células foram plaqueadas a 100 ou 200 por po em triplicado. crescimento clonal percentual foi calculada como o número de colónias que surgiram a partir de uma suspensão de células única de 100 células. A experiência foi repetida três vezes e os resultados são a média dos dados dos três experiências. diferenças estatisticamente significativas estão marcadas em estrelas

Dependendo do contexto receptor, genes WNT5A e WNT11 induzir tanto canônicos ou não-canônico Wnt sinalização [13] – [17].. Uma vez que induz a actividade de Wnt genes WNT5A não-canônico na presença do receptor ROR2, analisou-se a expressão de ROR2 nas duas linhas de células de CC. As análises Western blot revelaram que ambos os tipos de células expressaram ROR2; No entanto, as células HCT-R exibiram níveis mais elevados de células do que os ROR2 HDACi-sensíveis HCT-116 (Fig. 1A). Portanto, é possível que as funções WNT5A como um ligando não-canônico nas células tratadas com butirato, e que as células HCT-R exibir níveis mais elevados de sinalização Wnt não-canônico do que as células HCT-116.

Para determinar os efeitos de genes WNT5A e ROR2 sobre a atividade do Wnt, nós células HCT-116 e HCT-R co-transfectadas com os repórteres de transcrição para a sinalização Wnt /beta-catenina (TopFlash ou FopFlash) e siRNAs para

genes WNT5A

ou

ROR2

. A diminuição da expressão de genes WNT5A e ROR2 em células HCT-116 aumentou a actividade de transcrição de Wnt /beta-catenina de uma forma estatisticamente significativa (Fig. 1B). HCT-116 células tratadas com butirato com suprimida

ROR2

e

genes WNT5A

expressão aumentaram seus níveis de atividade de Wnt /catenina canônica para 233,0 ± 19,8 e 161,0 ± 32,0 em comparação com as células transfectadas de controle ( 94,8 ± 10,8), P 0,05, em células HCT-R falsamente tratados, a supressão de

ROR2

e

genes WNT5A

expressão não alterou significativamente os níveis de transcrição de Wnt em comparação com aqueles em células transfectadas com ARNsi de controlo (17,4 ± 4,6 e 12,8 ± 1,8, em comparação com 15,3 ± 3,7 em células de controlo, P 0,05) (Fig 1C.). No entanto, em células HCT-R tratados com butirato, a supressão de

ROR2

e

genes WNT5A

expressão resultou em níveis significativamente mais elevados de actividade de transcrição canónica Wnt, em comparação com células transfectadas com ARNsi de controlo (60,2 ± 12,5 e 53,1 ± 8,4 em comparação com 31,2 ± 7,9 em células de controlo, P . 0,05) (Fig 1C). Portanto, genes WNT5A e o seu receptor ROR2 neutralizar a indução da actividade /beta-catenina Wnt em células HCT-116 e HCT-R tratados com butirato.

Esta conclusão foi suportada pelos resultados de a sobre-expressão de genes WNT5A em HCT -116 células. As células HCT-116, que expressam os níveis mais baixos de genes WNT5A do que as células HCT-R (Fig. 1A), foram co-transfectadas com os repórteres de Wnt /beta-catenina e um vector vazio, ou um vector de expressão de genes WNT5A. As células co-transfectadas com um vector vazio aumentou a sua actividade /beta-catenina Wnt (TopFlash /FopFlash) de 5,2 ± 1,1-62,2 ± 9,3; Considerando que, as células que superexpressam genes WNT5A aumentaram sua atividade /beta-catenina Wnt de 3,7 ± 0,1-13,2 ± 0,3 (Fig. 1D). A diferença na actividade transcricional Wnt /beta-catenina entre as células Control e transfectadas-WNT5A na presença de butirato foi estatisticamente significativa (P 0,05).

Uma vez que o silenciamento de

ROR Página 2 expressão em células HCT-R resultou em níveis mais elevados de sinalização de Wnt /beta-catenina, e já anteriormente observado que a maior indução de Wnt /beta-catenina em células de CC corresponde a uma maior sensibilidade das células aos efeitos de butirato [8 ], analisamos o crescimento clonal de células HCT-R nucleofected com controle de siRNA ou

ROR

2 siRNA. Na ausência de butirato, o controlo siRNA- e

ROR

2 células transfectadas com ARNsi exibiu um ligeiro, mas estatisticamente significativo, a diferença de crescimento clonal (75,3 ± 1,4% versus 67,6 ± 3,4%, P 0,05) . Na presença de butirato, a diferença de capacidade de crescimento clonal foi mais pronunciado; As células HCT-R de controlo-nucleofected apresentaram crescimento clonal de 71,3 ± 3,8% e

ROR

2 células siRNA-nucleofected exibiu 51,4 ± 5,5% de crescimento clonal (Fig. 1E).

Indução de o percurso de sobrevivência AKT /PKB por genes WNT5A e ROR2 em células CC

o aumento na expressão de genes WNT5A em células HCT-116 e HCT-R tratados com butirato levou a uma busca de efectores a jusante do ligando. Várias vias induzida por WNT5A noncanonical foram identificados, e, pelo menos, dois destes são ROR2-dependente: a fosfatidilinositol-3-quinase (PI3-K) /sinalização AKT desencadeada pela fosforilação de AKT-quinase [18] – [20], e a via de sinalização JNK, [21] – [23]. Consistente com estes relatórios, observou-se que a AKT Serine473-fosforilada (pAKT) é expresso em níveis mais elevados em células HCT-R resistentes-HDACi comparação com HCT-116 células, e em ambas as linhas de células, a exposição ao butirato aumentou os níveis de pAKT ( Fig. 2A).

() resistentes HDACi células A HCT-R expressam níveis mais elevados de pAKT do que as células HDACi sensíveis HCT-116. As células foram plaqueadas em placas de 6 cavidades a 450.000 células por cavidade, e às 24 horas foram expostas a tratamento zombar butirato 5 mM (B) (H) ou durante 17 horas. Os lisados ​​de proteína total foram analisados ​​por análise de Western blot, e os níveis de AKT Ser473 fosforilada (pAKT), AKT total (AKT), e actina foram detectadas tal como descrito em Materiais e Métodos. células (B) HCT-R são mais resistentes a 5-fluorouracil (5-FU) induziu apoptose de células HCT-116 HDACi-sensíveis parentais. As células foram expostas a 1,5 mM de 5-FU durante 24 horas, e ensaios de apoptose foram efectuados como descrito em Materiais e Métodos. Percentagem de células vivas foi calculada dividindo o número de células vivas pelo número total de células analisadas. (C) O silenciamento de expressão ROR2 em células HCT-R diminui os níveis de AKT Ser473 fosforilada. Um milhão de células foram nucleofected com controlo ou

ROR

2 ARNsi (175 pmol, Invitrogen), e colocadas em placas a 500.000 por poço em placas de 6 poços. Às 24 horas pós-transfecção, as células foram expostas a zombar (H) ou butirato 5 mM (B) durante 19 horas. Os lisados ​​celulares totais foram analisados ​​por Western blot; um western blot representativo é mostrado. O gráfico de barras sob a imagem de western blot representa a quantificação dos níveis de pAKT em três experiências independentes por densitometria, a diferença entre as células tratadas com butirato são estatisticamente significativas (P 0,05), (D) .Overexpression de genes WNT5A recombinante em HCT-116 células resulta em níveis aumentados de pAkt. As células HCT-116 foram transfectadas com um vector vazio ou um vector de expressão de genes WNT5A, e seleccionada para a expressão estável de estas construções. Amostras em duplicado foram analisadas para os níveis de genes WNT5A e pAKT de expressão como descrito acima; um western blot representativo é mostrado. O gráfico de barras sob a western blot representa a quantificação de pAKT em três experiências independentes por densitometria, P 0,05. (E) Análise de Western blot de células representativas CC humano SW620 e células que crescem em SW620R butirato de 3 mm. As duas linhas de células foram expostas a zombar (m) ou butirato 5 mM (b) o tratamento durante 17 horas e analisado como no Fig.2a. (F). As células SW620 que expressam genes WNT5A indução exógena suprimiu exposição de Wnt transcrição /beta-catenina por butirato, P 0,05. A transfecção e análise foram realizadas como descrito na Fig. 1D.

Desde AKT /PKB é um percurso de sobrevivência celular, nós concluímos que os níveis elevados de pAkt em células HCT-R podem proteger as células não só contra a apoptose induzida por HDACis, mas também contra outros estímulos apoptóticos . Para avaliar esta possibilidade, comparou-se a resposta das células HCT-R e os seus homólogos HDACi-sensíveis, as células HCT-116, a 5-fluorouracil (5-FU), um agente quimioterapêutico utilizada para CC. A concentração de 5-FU necessária para 50% de inibição de crescimento tem sido relatado para células HCT-116, e linhas de células resistentes a drogas derivadas de células HCT-116, e está na gama de 0,09 mM a 2,4 mM [24]; Portanto, foi analisada a resposta das células HCT-116 e HCT-R de 1,5 mM de 5-FU (Fig. 2B). O tratamento de células HCT-116 com 5-FU resultou em um decréscimo significativo no número de células vivas a partir de 86,7 ± 8,3-48,1 ± 8,0 (P 0,05); Considerando que, a mesma exposição de células HCT-R não alterou significativamente o número de células vivas. Assim, as células falsamente tratados exibiram 95,8 ± 2,1% de células vivas, e 5-FU – células tratadas exibiram 91,6 ± 4,2% de células vivas, a P . 0,05 (Fig. 2B)

A possibilidade de uma relação causal entre os níveis aumentados de pAKT e a expressão de genes WNT5A ROR2 e foi testado por meio de silenciamento de genes e as experiências sobre-expressão do gene. Silenciamento de

expressão ROR2

em células HCT-R por siRNA resultou em uma diminuição moderada em níveis PAKT, ea diferença nos níveis de PAKT foi estatisticamente significativa apenas entre as células tratadas com butirato (Fig. 2C), a sobre-expressão de genes WNT5A em células HCT-116 conduziu a um aumento dos níveis de pAKT, e também a diferença foi estatisticamente significativa (Fig. 2D).

estudos adicionais com células de cancro do cólon humano SW620, e a derivados dos mesmos células SW620R, que crescem em butirato de 3 mM, indicaram que estas células não expressam níveis detectáveis ​​de ROR2 (dados não mostrados); No entanto, elas expressam genes WNT5A, e exposição a butirato aumenta os níveis de pAKT (Fig. 2E). Curiosamente, a expressão exógena de genes WNT5A em células SW620 suprimida a transcrição dependente de Wnt /beta-catenina, mesmo na ausência de expressão ROR2 detectável: na presença de butirato os níveis de actividade de Wnt em células SW620 que expressam WNT5A foram 271 ± 32, e a estes em As células transfectadas de controlo foram 389 ± 35 (Fig. 2F). Portanto, em adição a ROR2, outros receptores podem mediar o sinal de genes WNT5A, e a activação a jusante de quinase AKT.

supressão dos níveis de pAkt aumenta a resposta apoptótica de células de CC para HDACis

Desde AKT sinalização é uma via importante de sobrevivência celular, nós concluímos que a sua supressão em células expostas a CC HDACis iria aumentar os efeitos apoptóticos destes agentes. Utilizamos MK2206, o qual é um inibidor alostérico de AKT [25], e determinaram que a 5 uM do agente suprime os níveis de pAkt em ambas as células HCT-R (Fig. 3a) e HCT-116. Para determinar a sinalização de Wnt /beta-catenina é afectada pelo inibidor de AKT cinase MK2206 sozinho ou em combinação com um HDACi (butirato ou LBH589), foram analisados ​​os níveis de transcricionalmente activo (desfosforilado) de beta-catenina em HCT-116 células tratadas durante 8 ou 17 horas (Fig. 3B). células a 8 horas, HDACi-sensível HCT-116 não exibem sinais de apoptose, tal como determinado por citometria de fluxo análises com Anexina V (dados não apresentados); No entanto, a apoptose 17 horas já é detectado e beta-catenina é clivado no seu N- e C-terminal por caspases (ver a seta no segundo painel da Fig. 3B). Por conseguinte, as análises dos níveis de beta-catenina transcricionalmente activos foram realizadas a 8 horas em células HCT-R (Figs. 3B e 3C) e HCT-116. Em ambas as linhas celulares, MK2206 não resultaram em mudanças significativas nos níveis de beta-catenina activo em comparação com as amostras tratadas apenas com um HDACi; No entanto, os níveis de pAKT foram suprimidos por MK2206 em todos os tratamentos (Fig. 3D).

(A), a supressão dos níveis de pAkt em células por centímetro cúbico a MK2206 inibidor alostérico. western blot representativo de células CC expostas durante 17 horas para zombar (M), butirato 5 mM (B), butirato e 1? M MK2206 (MK1B), ou butirato e 5? M MK2206 (MK5B). (B) Os níveis de estado estacionário de beta-catenin transcricionalmente ativa não estão diminuídos em HCT-116 células por tratamento combinado com um HDACi e MK2206. As células foram expostas durante 8 ou 17 horas para tratamento de simulação (M), butirato 5 mM (B), o butirato e 5 uM MK2206 (BMK), 100 nm LBH589 (L), ou 100 LBH589 nm e 5 uM MK2206 (LMK). lisados ​​celulares totais foram analisadas para níveis de estado estacionário de total e Ser37 /Thr41 desfosforilado beta-catenina. western blot representativo é mostrado. (C) os níveis de beta-catenina ativos nas células HCT-R expostas durante 8 horas para zombar (M), butirato 5 mM (B), butirato e 5? M MK2206 (BMK), 100 nm LBH589 (L), ou LBH589 100 nm e 5? M MK2206 (LMK). níveis em células CC expostas durante 17 horas a zombar (M) (D) A análise Western blot representativas de AKT Ser473 fosforilada (pAKT) e AKT total (AKT), butirato 5 mM (B), o butirato e 5 uM MK2206 (BMK) , 100 nm LBH589 (L), ou 100 nm e LBH589 MK2206 5 uM (LMK). (E) A indução de actividade de transcrição /catenina dependente de Wnt-(TopFlash /FopFlash) em células CC por um HDACi (butirato ou LBH589) não é suprimida por um inibidor de pAKT. As células foram nucleofected em um milhão, com 1 ug de plasmídeo (ou TopFlash FopFlash) e pRL-TK, diluída, e colocadas em placas a 30.500 células por poço em placas de 96 poços. Às 24 horas pós-Nucleofection, as células foram tratadas durante 8 horas com simulação (M), butirato 5 mM (B), butirato e 5 um MK2206 (BMK), 100 nm LBH589 (L), ou 100 LBH589 nm e 5 MK2206 uM (LMK). Os dados representam a média dos resultados de pelo menos três experiências. Diferenças estatisticamente significativas estão marcadas por uma estrela. níveis (F) apoptóticas em células HCT-R HCT-116 e expostas a HDACis e um inibidor de pAKT. As células foram expostas durante 28 horas para: tratamento de simulação (M), butirato 5 mM (B), o butirato e 5 uM MK2206 (BMK), 100 nm LBH589 (L), ou 100 LBH589 nm e 5 uM MK2206 (LMK). Percentagem apoptose e necrose foi calculada dividindo o número de células apoptóticas e necróticas pelo número total de células analisadas. Cada experimento teve três amostras por tratamento; dados representam a média de três experiências. Diferenças estatisticamente significativas estão marcadas por uma estrela. células humanas CC (G, H) SW48 com KRAS tipo selvagem são tão sensíveis quanto HCT-116 células com KRAS mutante para o tratamento combinado com um HDACi e um inibidor pAKT. células SW48 foram tratados e analisados ​​como descrito em Figs.3D e 3F. Western blots representativos e apoptóticos de dados, que representam a média de três experiências, são mostrados. diferenças estatisticamente significativas estão marcadas por uma estrela.

Para medir diretamente Wnt transcrição /beta-catenina em células expostas a um inibidor pAKT e /ou HDACis, nós células transfectadas com um repórter de Wnt /beta actividade catenina (TopFlash) ou com um repórter controlo (FopFlash) (Fig. 3E). A /catenina actividade transcricional de Wnt (TopFlash /FopFlash) em células HCT-116 expostos para simulada ou tratamento MK2206 foi de 3,9 ± 0,4 e 2,8 ± 0,8, respectivamente (P 0,05). Em HCT-116 células expostas ao butirato, ou butirato e MK2206, a actividade aumentou para 8,73 ± 2,9 e 12,8 ± 1,3 (em ambos os tratamentos, P 0,05). Finalmente, quando as células HCT-116 foram expostas a LBH589 ou LBH589 e MK2206, a actividade /beta-catenina Wnt aumentada para 7,1 ± 0,6 e 11,3 ± 2,1, respectivamente, (P 0,05). Em células HCT-R, a exposição a zombar, MK2206, butirato, butirato e MK2206, LBH589, ou LBH589 e MK2206 resultou em atividade /beta-catenina Wnt de 6,1 ± 0,9, 4,6 ± 1,2, 11,7 ± 2,8, 16,0 ± 2,9, 15,2 ± 0,5, e 17,2 ± 1,2, respectivamente, (P 0,05 para tratamentos em comparação com tratamentos combinatórias com um HDACi sozinho). Assim, MK2206 não suprime a supra-regulação da actividade de transcrição de Wnt por HDACis.

O efeito combinado de HDACis MK2206 e sobre a apoptose foi medida através de análise citometria de fluxo. Embora tenha havido nenhuma diferença estatisticamente significativa entre os níveis de apoptose em células pseudo-tratados e MK2206, a adição de MK2206 butirato ou LBH589 resultou num aumento estatisticamente significativo na apoptose em comparação com o tratamento com cada HDACi sozinho (Fig. 3F). Assim, HCT-116 células expostas a simulada ou MK2206 exibiram níveis apoptóticos de 12,8 ± 2,2% e 14,3 ± 3,5%, respectivamente, (P 0,05). O tratamento de células HCT-116 com butirato, ou butirato e MK2206 resultou em 44,2 ± 1,5% e 64,2 ± 4,4% de apoptose, respectivamente (P 0,05). Na presença de LBH589 ou LBH589 e MK2206, HCT-116 células exibiram 55,7 ± 6,9% e 73,5 ± 4,7% de apoptose, respectivamente (P 0,05). Em, células HCT-R, a exposição a simulada ou tratamento MK2206 resultou em 11,4 ± 3,6% e 11,0 ± 4,0% de apoptose, respectivamente (P 0,05); exposição a butirato, ou butirato e MK2206 resultou em 14,4 ± 3,6% e 25,2 ± 4,1% de apoptose (P 0,05), e a exposição a LBH589, ou a combinação de LBH589 e MK2206 conduziu a 31,6 ± 5,3 e 45,7 ± 4,4% de apoptose ( P . 0,05)

Atualmente, o inibidor pAKT MK2206 é em um ensaio clínico para cancros do cólon com KRAS tipo selvagem; No entanto, a combinação de um HDACi e um inibidor de cinase de pAKT foi altamente eficaz em induzir apoptose na linha celular HCT-116, que é

KRAS

-mutant, e re-sensibilizar as células HCT-R para o apoptótica efeitos de HDACis. Para comparar a eficácia da combinação de fármacos em células de CC com o tipo selvagem KRAS, foi analisada a resposta apoptótica de células de cancro do cólon humanos células SW48. células SW48 respondeu à combinação de um HDACi e MK2206 com o aumento estatisticamente significativo na apoptose (Fig. 3G): simulada e tratamentos MK2206 resultou em 16,6 ± 0,7% e 16,9 ± 0,7% de apoptose, respectivamente (P 0,05). O tratamento de células SW48 com butirato, ou butirato e MK2206 resultou em 49,7 ± 4,4 e 75,6 ± 1,2% de apoptose, respectivamente (P 0,05), e a exposição a LBH589, ou LBH589 e MK2206 resultou em 56,1 ± 6,3% e 78,3 ± 3,7% apoptose, respectivamente (P 0,05). A análise Western blot confirmou que MK2206 suprimida de forma fiável os níveis induzidos HDACi de pAKT em células SW48 CC (Fig. 3H).

Dieta agentes derivados que imitam os efeitos da HDACis sintéticos e pAKT inibidores

Considerando que a combinação de inibidores HDACis e pAKT sintética pode ser aplicada na terapêutica ou na prevenção de CC para os pacientes com maior risco de CC (por exemplo, pacientes com CC ressecado e /ou DII crónica), regimes alimentares que incluam metabolitos com HDAC- e pAKT funções -inhibitory poderia tornar-se uma abordagem de prevenção CC para a população em geral. Desde que o butirato é HDACi os derivados de dieta mais potentes produzidos no cólon [26], uma dieta CC-preventivo deve conter níveis suficientes de fibras fermentáveis. Para encontrar um inibidor pAKT que podem ser derivados da dieta, foi realizada uma busca na literatura e encontrou publicações sobre o sulforafano, sphingadienes naturais, derivados do alho diallyl trisulfide (DATS), éster fenetil do ácido caféico (CAPE, de própolis de abelhas), a curcumina, e o resveratrol, os quais inibem os níveis de pAkt em tipos de células diferentes [27] – [33]. Foram testados alguns desses compostos para a sua capacidade para suprimir os níveis de pAKT induzida pelo butirato em células de CC, e descobriram que CABO, DATS, e sulforafano suprimiu o aumento dos níveis de pAKT quinase no HCT-116 células tratadas com butirato, e apenas CABO e DATS eram activos em células HCT-R (Fig. 4a). Dos três compostos testados, CAPE foi mais potente em suprimir os níveis de butirato induzida pela de pAKT em ambos os tipos de células; No entanto, não induziu a apoptose em qualquer uma destas células, por si só (Fig. 4B). Assim, no HCT-116 células, a exposição simulada e o tratamento com 4 mg por ml CAPE resultou em 12,2 ± 3,1% e 11,9 ± 0,8% apoptose, respectivamente; exposição a butirato ou a combinação de butirato e Cabo resultou em 44,8 ± 1,8% e 78,4 ± 6,5% de apoptose, respectivamente (P 0,05). Em células HCT-R, exposição simulada, o tratamento com butirato, e o tratamento com CABO sozinho resultou em 8,9 ± 1,2%, 12,6 ± 1,7% e 10,9 ± 3,0% de apoptose, respectivamente (P 0,05). No entanto, quando as células HCT-R foram expostos à combinação de capa e butirato, os níveis de apoptose aumentou quase três vezes, para 30,6 ± 3,6% (P 0,05) (Figura 4B.). As análises subsequentes revelaram que, em células HCT-R tratados com butirato, CABO suprime os níveis de fosforilada a subunidade p55 de fosfatidil-inositol-3-quinase (PI3K), um importante activador a montante da quinase AKT (Fig. 4C). No entanto, o passo exacto em que esta supressão ocorre não é conhecido, e é um foco de pesquisas futuras. Nós não detectar a supressão consistente dos níveis de fosfo-p55 de PI3K em HCT-116 células expostas a CAPE e butirato (dados não mostrados).

compostos (A) Dieta derivados de suprimir os níveis PAKT induzida pelo butirato em CC células. Western blot representativas de células expostas durante 14 horas a tratamento simulado (m), butirato 5 mM (B), butirato 5 mM e 4 ug /Cape ml (BC), butirato 5 mM e 20 uM sulforafano (BS), butirato 5 mM e 40 um DATS (BD). Detecção de pAKT, AKT total (AKT), e actina foi realizada com lisados ​​de células totais. 2B].