Abstract

O lamellipodium, uma estrutura essencial para a migração celular, desempenha um papel importante na invasão e metástase das células cancerosas. Embora Rac1 reconhecido como um jogador-chave na formação de lamellipodia, os mecanismos moleculares subjacentes motilidade lamellipodial não são totalmente compreendidos. optogenetic tecnologia permitiu controlar a actividade de espaço-temporalmente fotoactivável Rac1 (PA-Rac1) em células vivas. Usando este sistema, que revela o papel de fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) da motilidade lamellipodial Rac1-dependente em células PC-3 de cancro da próstata. Por meio de irradiação laser azul local de células PA-Rac1-expressando, motilidade lamellipodial foi reversível induzida. Em primeiro lugar, foi observado para o exterior de uma extensão lamellipodium paralelo ao substrato. O lamellipodium estendida em seguida, mostrou despenteando atividade na periferia. Notavelmente, PI (3,4,5) P

3 e WAVE2 foram localizadas na lamellipodium estendendo-se numa forma dependente da PI3K. Confirmou-se que a inibição da actividade de PI3K suprimiu grandemente lamellipodial extensão, enquanto que a actividade agitando foi menos afectada. Estes resultados sugerem que induzida por Rac1 motilidade lamellipodial consiste em duas atividades distintas, a extensão para fora dependente de PI3K e ruffling independente de PI3K

Citation:. Kato T, Kawai K, Egami Y, Kakehi Y, Araki N (2014 ) Rac1-Dependent Lamellipodial Motilidade no câncer de próstata PC-3 células Revelado pelo Controle de optogenética de Rac1 Atividade. PLoS ONE 9 (5): e97749. doi: 10.1371 /journal.pone.0097749

editor: Daotai Nie, Faculdade de Medicina da Universidade de Southern Illinois, Estados Unidos da América

Recebido: 08 de janeiro de 2014; Aceito: 24 de abril de 2014; Publicado em: 21 de maio de 2014

Direitos de autor: © 2014 Kato et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada pela Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (JSPS) KAKENHI (https://www.jsps.go.jp/english/e-grants/index.html) 25861427 para TK; 24659087 e 23390039 para NA; 26860136 e 24890154 para KK; 25860142 a YE; 24390369 para YK. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a migração celular desempenha um papel importante na organogénese embrionária; cicatrização de feridas e respostas imunitárias; e a patogénese de várias doenças, incluindo a invasão e metástases de cancro [1], [2]. Portanto, uma compreensão da migração celular subjacente mecanismos moleculares é importante para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para prevenção da invasão tumoral e metástase. A migração celular envolve os processos de saliência celular polarizada e adesão na direcção do movimento, a contracção celular, a desmontagem de focos adesivas, e de retracção na periferia do bordo de fuga da célula [1]. Durante a migração de células de tumor que está associado com a metástase e invasão do cancro, as células metastáticas exibem alterações drásticas na forma. Esta deformação é causada por remodelação do citoesqueleto de actina, que é regulada por GTPases da família Rho como Cdc42 e Rac1. GTPases da família Rho comportam-se como interruptores moleculares, ciclismo entre as formas ligada a GTP activa e formas ligada a GDP inativos. GTPases da família Rho são activadas por factores de troca de nucleótidos de guanina (GEFs) e inactivada por activadora de GTPase (GAP proteínas) [3]. Rac1, um membro da família das GTPases Rho, leva à produção de saliências em forma de folha referidos como lamellipodia ou membrana plissados, enquanto Cdc42, outro membro da família Rho, cria saliências spike-like chamados filopios [3]. Rac1 é hyperactivated em células de câncer de próstata metastático [4]. Além disso, a inibição de actividade de blocos Rac1 a migração e a invasão de células de cancro da próstata [5]. Estes estudos sugerem que a formação lamellipodial Rac1 mediada joga um papel importante na metástase do cancro da próstata.

Até à data, a expressão de mutantes Rac1, tais como o constitutivamente activo (CA) e a Rac1Q61L negativo dominante (DN) tem Rac1T17N sido amplamente utilizados para investigar o envolvimento de Rac1 na formação lamellipodial agitando e [6]. No entanto, os dados fenótipo celular obtidos com mutantes Rac1 devem ser interpretados com cautela. Devido aos efeitos de expressão irreversível, estável e global nas células, é difícil dizer que os fenótipos de células que expressam mutantes Rac1 reflectem exactamente a acção da proteína como um interruptor molecular. Para elucidar o papel exacto do espaço-temporal de activação Rac1, Wu et al. [7], [8] desenvolvido recentemente um Rac1 foto-activável sistema (PA-Rac1) por fusão de um-oxigénio-tensão luz (LOV) de domínio e uma extensão helicoidal (Jα) sequência carboxi-terminal para o terminal amino de um constitutivamente Rac1 ativa. LOV é um domínio interruptor de luz de proteína

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phototropin 1. No escuro, o domínio de ligação a LOV flavina interage com Jα e bloqueia o local de ligação do efector de PA-Rac1, configurando no seu conformação fechada. A irradiação com luz, a luz de 400-500 nm induz a dissociação do domínio LOV e Jα hélice, e conduz à activação Rac1. Esta ativação induzida por foto é reversível. Usando este sistema, activação localizada Rac1 mostrou ser suficiente para induzir motilidade celular e determinar a direcção do movimento celular [7], [8].

A relação entre Rac1 e fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) no a formação de lamellipodia é complicado porque funções PI3K a montante ea jusante da Rac1 [9]. Fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato (PI (3,4,5) P

3) é conhecido por ser ligam Rac GEFs e depois acelerar a polimerização da actina, através da activação Rac1 [10]. Além disso, um feedback positivo foi relatado entre PI (3,4,5) P

3 e Rac de polaridade celular durante a quimiotaxia eucarióticas [11], [12]. No entanto, na regulação da saliência celular e polaridade, os relatórios relativos a função de PI3K a jusante de Rac1 são misturados [13], [14]. Assim, o papel preciso da PI3K a jusante da Rac1 continua a ser um assunto controverso.

Para esclarecer a relevância da PI3K a motilidade lamellipodial Rac1-dependente, foi aplicado o sistema de PA-Rac1 às células cancerosas da próstata. Photomanipulation da actividade PA-Rac1 usando um laser azul nos permitiu distinguir dois processos motilidade lamellipodial em células vivas: extensão lamellipodial e ruffling periférica. Notavelmente, verificou-se que os inibidores de PI3K suprimiu a iniciação de extensão lamellipodial mas teve pouco efeito sobre ruffling periférica. O presente estudo revelou que os processos de motilidade lamellipodial Rac1-dependentes consistem em duas atividades dissociáveis:. Extensão para fora e independente de PI3K ruffling periférica lamellipodial dependentes de PI3K

Materiais e Métodos

Reagentes e cDNA Construções

de soro fetal de bovino (FBS) e meio RPMI-1640 foram obtidos a partir da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). O X-tremeGENE ADN HP Transfection Reagent foi adquirida a partir de Roche Diagnostic Systems (Basileia, Suiça). Os outros reagentes foram adquiridos a partir de Wako Pure Chemicals (Osaka, Japão) ou ‘Nacalai Tesque’ (Kyoto, Japão), a menos que indicado de outra forma.

pTriEx /mCherry-PA-Rac1Q61L (plasmídeo # 22027) e pTriEx /mCherry- PA-Rac1 T17N (plasmídeo # 22029) foram obtidos a partir de Addgene (Cambridge, MA). Dr. Joel A. Swanson (Universidade de Michigan) gentilmente cedido o domínio de homologia-pmCitrine-AKT plecstrina (PH) e pmCitrine-Rac1Q61L. As construções pEGFP-N1-wave2 foram generosas doações de Dr. Tadaomi Takenawa (Universidade de Kobe).

Cultura de Células e Transfecção

PC-3 células cancerosas humanas da próstata foram adquiridos a partir da American Type Culture Colecção (Rockville, MD) e foram mantidas em meio RPMI contendo 10% de FBS, penicilina 100 U /ml inactivado por calor, e 100 ug /ml de estreptomicina. As células foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 incubadora. Para imagem ao vivo de células, as células foram semeadas em lamelas de 25 mm em 35 mm pratos a uma densidade de 2,0 x 10

4 células /placa e foram incubadas durante a noite antes da transfecção.

O X-tremeGENE HP ADN Transfection Reagent foi utilizado para a transfecção de plasmídeo de acordo com as instruções do fabricante. pTriEx /mCherry-PA-Rac1Q61L foi adicionado às placas de 35 mm. Nos tratamentos de co-transfecção, 0,01-0,5 ug dos plasmídeos adequados foi adicionado às placas de 35 mm juntamente com 0,3 ug do plasmídeo-PA Rac1.

tratamentos com drogas

Para determinar a papel de PI3K na motilidade celular induzida por Rac1, as células foram tratadas com os inibidores de PI3K durante a irradiação. Utilizou-se 50 pM LY294002 (Sigma), 100 nM de wortmanina (Sigma), e 1 (Activo Biochemicals) uM ZSTK474 como inibidores de PI3K. LY294002 e wortmanina, que são inibidores pan-PI3K, são amplamente utilizados como ferramentas para investigar a diversos processos de transdução de sinal que envolvem PI3K. ZSTK474 também inibe todas as quatro isoformas de PI3K, mas não inibe cinases relacionadas com PI3K, tais como mTOR e proteína-quinase dependente de ADN. Estes inibidores foram dissolvidos em sulfóxido de dimetilo (DMSO), armazenada a -20 ° C, e aplicada às células, nas concentrações finais indicadas. Estes inibidores foram geralmente adicionados às células 30 minutos antes da fotoactivação, mas em algumas experiências, que foram adicionados durante a fotoactivação. Para os tratamentos de controlo, DMSO a 0,1% foi aplicado às células.

A fotoactivação e processamento de imagem de células vivas,

12-24 horas após a transfecção, o meio de cultura foi substituído com tampão de Ringer (RB ) que consiste de NaCl 155 mM, KCl 5 mM, CaCl 2 mM de

, MgCl2 1 mM de

2, Na 2 mM de

2HPO

4, 10 mM de glucose, 10 mM de HEPES pH 7,2, e 0,5 mg /ml de albumina de soro bovino. As lamelas de 25 mm foram colocados em uma câmara cheia de RB em um C estágio 37 ° controlada pelo thermo (Tokai Hit INU-ONI, Shizuoka, Japão). A fotoactivação de PA-Rac1 e processamento de imagem de células vivas foram realizadas utilizando um microscópio invertido axio Observador Z1 equipado com uma unidade de varrimento a laser (LSM700, Zeiss), como previamente descrito [15]. Para fotoativação PA-Rac1, a área indicada das células cancerosas da próstata expressando mCherry-PA-Rac1 foi repetidamente irradiados usando um laser nm 5 mW 445 com potência de 0,2% para os períodos indicados em um modo de fotodegradação. imagens ao vivo de células foram adquiridos através de um 63x Plan-Apochromat /N. A. 1.4 lente a cada 15 segundos usando um laser de 10 mW 555 nm a 0,5% de energia -2,0% para obter fluorescência e de campo claro de contraste de fase imagens mCherry. Para visualizar PI (3,4,5) P

3 ou WAVE2, as células foram co-transfectadas com pmCherry-PA-Rac1 e o domínio pmCitrine-AKT-PH ou pEGFP-WAVE2, respectivamente. EGFP ou mCitrine imagens de fluorescência foram adquiridos apenas no primeiro e últimos pontos de tempo para evitar a fotoactivação não intencional por o laser de 488 nm, como comprimento de onda de excitação esta sobrepondo-se ligeiramente com o espectro de fotoactivação [8]. Nós ajustamos o poder de 488 a laser nm o mais baixo possível, de modo que a aquisição do primeiro quadro pelo laser não teria impacto atividade PA-Rac1.

imagens de lapso de tempo por meio de microscopia de contraste de fase e fluorescência foram tomadas a intervalos de 15 seg e montadas em filmes QuickTime usando 2009 software Zen (Carl Zeiss). análises quimógrafo foram realizadas utilizando o software de imagem Metamorph (Molecular Devices). Os dados de imagem aqui apresentados são representativos dos resultados de pelo menos três experiências independentes.

Imagem Análise Quantitativa

Para a análise de imagem quantitativa da extensão lamellipodial devido a PA-Rac1 fotoactivação ou na ausência presença de inibidores de PI3K, tomamos medidas da área da célula aumenta subtraindo as áreas das células antes fotoativação daqueles após fotoativação usando software de imagem Metamorph.

Para a análise quantitativa de mCitrine-AKT-PH e EGFP-WAVW2 recrutamento a domínios fotoactivados, as intensidades de fluorescência das regiões de interesse foram medidas usando o software de imagiologia MetaMorph. As intensidades de fluorescência de EGFP mCitrine e após 5 min de fotoactivação foram comparadas com as intensidades de fluorescência em que a área correspondente antes da fotoactivação, utilizando pelo menos 16 células.

Para quantificar os efeitos de inibidores de PI3K em lamelip�ios estendida e agitando actividade células mCitrine-Rac1Q61L-expressar, as células foram fixadas com paraformaldeído a 4% em 30 min após a adição dos inibidores de PI3K (50 uM LY294002, wortmanina 100 nM ou 1 fiM ZSTK474) ou o veículo só (0,1% DMSO). Usando o sistema de imagiologia MetaMorph, os diâmetros máximos das células que expressam Rac1Q61L foram medidos antes e depois dos tratamentos com drogas para avaliar o efeito de inibição de PI3K na lamellipodial estendida. Da mesma forma, os plissados ​​periféricas por célula foram contadas utilizando um microscópio de fluorescência para avaliar o impacto de inibição de PI3K em agitando actividade. Trinta células de cada grupo foram submetidos a análise de imagem quantitativa.

Os dados são apresentados como médias ± erro padrão (SE) para o número de células indicadas no texto. A análise estatística foi realizada utilizando o recurso de teste t de Wilcoxon de Excel 2012. As diferenças entre as amostras analisadas foram consideradas significativas para p . 0,05

Resultados

Ativação local da PA-Rac1 reversível Induz Lamellipodial extensão e despenteando

Para elucidar a relação entre a ativação Rac1 e dinâmica lamellipodial, introduzimos mCherry-fundido PA-Rac1 em células PC-3. Depois de confirmar a expressão de mCherry-PA-Rac1 com base no sinal mCherry, que irradiado uma região periférica das células utilizando um laser de 445 nm, durante os intervalos de aquisição de imagem e as imagens adquiridas de contraste de fase das células vivas a cada 15 s por confocal microscopia. Tipicamente, após 1-4 minutos de irradiação com o laser de 445 nm, uma saliência semelhante a uma folha fina (isto é, um lamellipodium) que se estende paralelamente ao substrato foi observado no local periférico de células que foi irradiada pelo laser 445 nm. O lamellipodium atingiu o seu tamanho máximo depois de 5-6 min de activação PA-Rac1. Naquela época, na sequência da extensão para fora, o lamellipodium totalmente estendida enrolado sua borda frontal mostrar um movimento ruffling periférica. Os movimentos ruffling continuou durante a duração da irradiação. Após a irradiação ter cessado, a extensão tanto lamellipodial e o periférico Ruffling prontamente diminuído (Fig. 1 e do filme S1). Em nosso estudo anterior, dorsal despenteando foi induzida em RAW 264 macrófagos pela ativação PA-Rac1 [15], [16], mas dorsal despenteando não era proeminente em células PC-3.

PC-3 células foram transitoriamente transfectadas com pTriEx /mCherry-PA-Rac1 e submetido a fotoativação local do PA-Rac1 (área retangular esboçada pelos pontos azuis). imagens de lapso de tempo de uma célula PC-3 expressando mCherry-PA-Rac1 foram adquiridas durante fotoativação utilizando irradiação com laser de 445 nm. Os painéis superior e médio mostrar imagens de contraste de fase e mCherry de fluorescência, respectivamente. tempos decorridos após o início da fotoativação são mostrados no topo. No painel inferior, os contornos da forma da célula para os tempos decorridos indicados são desenhadas em azul (0 min, original), (3,5 min, fase de extensão) (fase 6 min, agitando) amarelo e vermelho. Os perfis pretas indicam os babados de membrana. Barra de escala, 10