Abstract
Fundo
In vitro
experimentos de cultura de células com células primárias têm relatado que a proliferação celular é retardada na presença de ambiente em comparação com O fisiológico
2 níveis. O cancro é principalmente uma doença de proliferação celular aberrante, por conseguinte, do estudo das células cancerígenas cultivadas sob condições ambientes O
2 pode ser indesejável. Para entender melhor o impacto de O
2 na propagação das células cancerosas
in vitro
, comparou o potencial de crescimento de um painel de linhas celulares de cancro do ovário em condições ambientais (21%) ou fisiológico (3% ) o
2.
principais conclusões
Nossas observações demonstram que semelhantes às células primárias, muitas células cancerosas manter uma sensibilidade inerente ao o
2, mas alguns insensibilidade exibição para mudanças em O
2 concentração. Uma análise posterior revelou uma associação entre G2 com defeito regulação /M do ciclo celular de transição e O
2 resultante insensibilidade da superexpressão de 14-3-3 σ. Segmentação superexpressão 14-3-3 σ com RNAi restaurado O
2 sensibilidade nestas linhas celulares. Além disso, verificou-se que os tumores ovarianos metastáticos frequentemente sobre-expressar 14-3-3 σ, que em conjunto com RB fosforilada, resulta em mau prognóstico.
Conclusões
As células cancerosas mostrar diferencial sensibilidade proliferativa a mudanças em O
2 concentração. Embora uma ligação direta entre O
2 insensibilidade e metástase não foi determinada, esta investigação mostrou que um O
2 fenótipo insensível em células cancerosas para se correlacionam com a progressão do tumor metastático
Citation:. Ravi D, Chen Y, Karia B, Brown A, Gu TT, Li J, et al. (2011) 14-3-3 σ Efeitos Expressão G2 /M Resposta ao oxigênio e se correlaciona com cancro do ovário metástase. PLoS ONE 6 (1): e15864. doi: 10.1371 /journal.pone.0015864
editor: Janine Santos, da Universidade de Medicina e Odontologia de New Jersey, Estados Unidos da América
Recebido: 26 de agosto de 2010; Aceito: 25 de novembro de 2010; Publicação: 10 de janeiro de 2011
Direitos de autor: © 2011 Ravi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo NIEHS (K22-ES12264) e um Prêmio Fundo Voelcker Young Investigator do Fundo Voelcker Max e Minnie Tomerlin para AJR Bispo. Kleberg Centro de Marcadores Moleculares do Centro de Câncer MD Anderson, O Programa Cientista MD Anderson Cancer Center Médico, o Programa Scholars McNair apoiado pela Fundação Robert e Janice McNair e um American Society of Clinical Oncology (ASCO) Cancer Foundation Award de Desenvolvimento de Carreira (CDA ), Fundação do Câncer e pela Fundação da Ciência Irlanda (SFI) /Health Research Board (HRB (Irlanda)) Translational Research Award (TRA), tudo para BT Hennessy. B. Karia é suportada pelo mama DOD CDRMP Award Cancer Research Programa Predoctoral Estágio (BC093931). A. Brown é suportada pelo NIA bolsa de formação T32 (T32AG021890). Y. Chen é suportado pelo NIH /NCI subvenção centro de câncer (P30 CA054174-17) e Grant NIH /NCRR CTSA (1UL1RR025767). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
linhas celulares derivadas de doentes com cancro proporcionar um sistema modelo experimental que facilita manipulável investigações sobre a biologia do cancro e da sua terapia. O potencial de proliferação ilimitada de células de cancro é um importante característica da malignidade, no entanto, a utilização de protocolos de cultura de tecidos padrão frequentemente restringe a proliferação das células, tal como observado com as linhas celulares primárias [1], [2], [3], [4]. Embora o uso de condições fisiológicas, é conhecido para impacto
In vitro
proliferação de células cancerosas [5], [6], [7] e as células primárias são conhecidos para propagar melhor na fisiológico O
2, o impacto da fisiológica O
2 no
in vitro
proliferação de células cancerosas é relativamente inexplorado. No entanto, foi relatado que concentrações alteradas de O
2 resulta em diferenças claras na proliferação celular e na resposta ao tratamento com drogas nas células cancerosas [8], [9], [10].
Oxigénio , em adição aos nutrientes e factores de crescimento, é vital para o crescimento celular adequado e sua disponibilidade tem um impacto directo sobre o metabolismo celular, vias de sinalização, proliferação, diferenciação e sobrevivência [3], [11], [12], [13]. Muitos
in vitro
investigações demonstraram as vantagens de O fisiológico
2 para cultura de tecidos. Por exemplo, o comportamento biológico de culturas de células primárias com uma concentração fisiológica de O
2 (2,7-5,3%) é muito superior em comparação com a prática padrão de células em crescimento em “ambiente” atmosférica ou O
2 concentração ( 21% O
2) [4]. Na verdade, estas duas condições de crescimento são conhecidas por resultar em metabólica distinta e características moleculares [13].
A importância de se considerar O
2 tensão na biologia do cancro está bem estabelecida. Por exemplo, o facto de existirem diversos cancros em estado ‘hipóxico’ conduziu ao desenvolvimento de terapia direcionada por hipoxia [14], [15]. Em geral, a concentração hipóxica de O
2 é 1% para a maioria dos tumores sólidos, no entanto, a concentração hipóxico pode variar de acordo com os tipos de células e o estado de perfusão normal [16] e, adicionalmente, hipoxia tende a inibir a proliferação celular [ ,,,0],17]. Physiological O
2 tensão varia 2,7-5,3% no espaço intersticial [18], em que muitos tumores primários residem, para 14,7% na circulação arterial e os pulmões, onde a migração de células cancerosas e potencialmente metastáticos são frequentemente encontrados. Portanto, estudos de câncer que só são realizados em ambiente (21%) O
2 pode perder observações biológicas pertinentes. Isto pode ser particularmente importante quando a tentativa para estudar a progressão do cancro para doença metastática, o que é um evento significativo na etiologia do cancro e está associado com prognóstico pobre [19]. Considerando-se as diferenças em O
2 tensão em diferentes compartimentos do corpo, uma compreensão do efeito de O
2 concentração sobre a proliferação de células de cancro poderia fornecer informações úteis sobre os mecanismos envolvidos na progressão patológica de câncer
As células cancerosas que tenham adquirido mutações tanto em oncogenes ou genes supressores de tumor exibir uma proliferação descontrolada fenótipo característico [20]. Por exemplo, supressores de tumor, tais como p53 ou RB ato como “porteiros moleculares” que se sabe afectarem a progressão do ciclo celular. A mutação de tais factores facilita a proliferação ilimitada em células cancerosas [20]. a progressão do ciclo celular envolve uma série sequencial de eventos catalisada por ciclinas e quinases dependentes de ciclina (CDKs) [21], e em células normais é um processo fortemente regulado. O p53 supressor de tumores é o principal regulador dos símbolos G1 /S e de transição de fase G2 /M no ciclo celular [22] e é conhecida por ter um papel importante na resposta a concentração de oxigénio, particularmente a hipoxia ( 1% de O
2) [23] ou hiperoxia (95% O
2) [24]. Embora examinar o efeito de extremos O
2 condições é importante e revelador, deve notar-se que estes estudos anteriores não investigaram a resposta da p53 a fisiológica (3%) O
2 e do ambiente (21%) O
2. p21 e 14-3-3 σ são alvos transcricionais de p53 que estão envolvidos na regulação G1 /S e G2 /M transições do ciclo celular por segmentação CDK2 e CDC2 (também conhecido como CDK1), respectivamente [22], [25] . O CDKs, por sua vez, regulam a função da proteína RB, para mediar a progressão do ciclo celular através de G1 /S e G2 /M [26]. Por conseguinte, a ruptura da função de RB pode ter impacto sobre o controle da progressão do ciclo celular [26]. Considerando que as diferenças em O resultado
2 concentração na progressão do ciclo celular alterada em células primárias, mas as células cancerosas frequentemente mostrar defeitos controle do ciclo celular, há claramente o potencial que esses defeitos podem afetar o modo como as células cancerosas responder a O alterados
2 níveis de uma forma que poderia ter uma profunda influência sobre a progressão do câncer.
Aqui nós examinamos o comportamento biológico das células de câncer de ovário sob fisiológica e ambiente o
2. Curiosamente, algumas das linhas celulares de cancro do ovário que teve uma resposta normal a O
2 de concentração, (
ie
reduziu a proliferação celular aumentada com O
2 de concentração) enquanto a proliferação de outras linhas celulares de cancro do ovário não foi afetada por este O
2 aumento. Além disso, as nossas investigações revelaram que 14-3-3 σ e o seu papel no ciclo celular influenciam a resposta proliferativa a ó alterada
2 níveis. Considerando a variação da pressão parcial de oxigénio em todo o corpo e a importância potencial que este contexto pode ter na progressão do cancro, que é fundamental para compreender o efeito de O
2 concentração sobre a proliferação de células de cancro e progressão do cancro. Nós fornecemos evidências de que a aquisição de O
2 insensibilidade pode ser um componente na progressão do cancro e uma característica da doença metastática bem sucedido.
Resultados
Resultados de oxigênio fisiológicos em aumento da proliferação celular em câncer de ovário células
Em nossos estudos iniciais que compararam o efeito do fisiológico (3% o
2) e ambiente (21% o
2) concentração de oxigênio, utilizando células de cancro do ovário A2780 e observaram que 12 dias de cultura de células nestas condições resultou numa supressão do crescimento de 2,6 vezes menos de 21% de O
2 (Figura 1). Portanto, nós examinamos o efeito de O
concentração 2 sobre o potencial de crescimento das seis linhas celulares de cancro do ovário usando fisiológica (3% O
2) e um ambiente concentrações de oxigênio (21% O
2). Uma vez que o soro presente no meio de cultura de células pode também ter uma influência sobre o crescimento dominante, também testaram o efeito de várias concentrações de soro. Independentemente da quantidade de presente no soro no meio de crescimento, a cultura em 21% de O
2 geralmente resultou numa diminuição significativa na proliferação das células para quatro das linhas de células do cancro do ovário (A2780, OVCAR5, OVCAR8 e HOC8) em comparação com três % S
2 (Figura 2). A única excepção foi observada com células HOC8 na presença da concentração mais elevada de soro (10% v /v), onde foi observado um efeito de crescimento
2-dependente insignificante S (Figura 2). Presumivelmente, a falta de resposta no Hoc8 resulta de uma influência dominante de soro, o que não foi observado com A2780, OVCAR5 e OVCAR8. Em contraste, não houve nenhum efeito significativo sobre o crescimento das linhas de células SKOV3 e HeyA8 aumentando o O
2 a 21% de concentração, independentemente da concentração sérica (Figura 2). A exceção foi observada HeyA8 cultivadas em soro de 2%, o que mostrou diminuição da proliferação celular em 21% O
2 em comparação com 3% de O
2 (
p Art 0,001). Em contraste com o efeito de ó
sub níveis, aumentando a concentração de soro resultou em um aumento proporcional no crescimento do cancro do ovário linhas celulares A2780, OVCAR5 e OVCAR8 (
P
10
– 5, Figura 2). A concentração de soro tinha uma influência moderada do crescimento em células SKOV3 e HeyA8 (Figura 2); uma concentração sérica entre 2 e 6% tiveram um efeito significativo (
p Art 10
-5) em SKOV3, enquanto a concentração sérica HeyA8 entre o soro 2 e 10% teve o maior efeito em 3% O
2 (
p Art 10
-5) (Figura 2). O aumento da concentração no soro de 6% a 10% teve pouco efeito sobre o crescimento de HeyA8, SKOV3 e HOC8 (Figura 2). Juntos, verifica-se que ambos os níveis de oxigénio e concentração de soro de afectar o crescimento destas linhas de células do cancro do ovário, mas de uma maneira independente. Como esperado a partir de trabalho por outros com células primárias [4], observou-se que a maioria das células de cancro do ovário indicadas decréscimo da proliferação celular, em O ambiente
2 em comparação com a concentração fisiológica O
2 concentração. No entanto, duas linhas de células não pareceu ter proliferação celular inibida pelo valor mais elevado (ambiente) O
2 níveis. Por conseguinte, os categorizados linhas celulares de cancro do ovário com base nestas diferenças, sendo quer O
2 sensível (A2780, OVCAR5, OVCAR8 e HOC8) ou insensível (SKOV3 e HeyA8) (Figura 2). Em geral, estas diferenças sugerem heterogeneidade no crescimento respostas regulamento aos sinais fisiológicos de O
2 níveis nestas linhas de células cultivadas.
número igual de células de cancro do ovário A2780 foram semeadas numa placa de petri cm 10 e foram rotineiramente mantida sob 3% O
2 (fisiológica) ou 21% O
2 (ambiente). O aumento no número de células foi determinado pela contagem manualmente uma vez em três dias, e os números de células totais foram estimados e plotados usando a escala linear (no Gráfico A) e escala (no Gráfico B) log.
linhagens de células de câncer de ovário foram cultivadas sob 3% ou 21% o
2 e a extensão da proliferação foi determinada após 3 dias de crescimento (ver secção Materiais e Métodos). Para cada linha celular, a percentagem de proliferação das células em 3% O
2 (luz sombreada bares) e com diferentes concentrações de soro foi comparado com a proliferação em condições padrão de cultura de tecidos que consistem em 21% (ambiente) O
2 (barras sombreadas) e 10% de FBS. As barras de erro representam os desvios padrão da média e estatisticamente significativa (pelo teste t de Student) diferenças na proliferação entre 3% e 21% de O
2 para cada concentração de soro é indicado por um asterisco [(*)
P Art 0,05, (**)
p Art 0,001 e (***)
p
. 0,0001]
é possível que a aparente S
2 insensibilidade e diferenças na proliferação resultaram de variações no tempo de duplicação de cada linha de células. Por exemplo, se SKOV3 e HeyA8 (o O
2 linhas de células insensíveis) proliferam mais lentamente, O
2 mudanças proliferação dependentes podem ser demasiado trivial para medir. Portanto, foi medido o tempo de duplicação celular para todas as linhas de células de cancro do ovário. Os nossos resultados mostraram que, em condições de cultura de tecidos padrão (soro a 10% e 21% de O
2) o tempo de duplicação para todas as linhas de células de cancro do ovário, foi um pouco semelhante ( 24 horas), excepto para HOC8, que teve um tempo de duplicação estendida de cerca de 45,5 ± 4,9 horas (Tabela S1 e ver Métodos S1). Portanto, a maior parte das linhas celulares de cancro do ovário, foi dividindo a uma taxa aproximadamente igual, e a diferença no tempo de duplicação bruto é pouco provável que seja um factor de as diferenças observadas entre proliferação linhas de células sob condições diferentes.
correlatos sensibilidade Oxigénio com mudanças dinâmicas no S e fases G2 do ciclo celular
Tendo em conta as diferenças na proliferação observados para linhas de células de cancro do ovário cultivadas sob a 3% ou 21% o
2, examinamos se o
2 concentração altera o perfil de ciclo de células de cada linha celular. Independentemente da concentração de soro, comparando 3% O
2 a 21% O
2 resultou num decréscimo significativo na percentagem de células que estavam na fase de G1 do ciclo celular e um aumento significativo na percentagem de células em fase S (Tabela 1), o que era esperado com base em observações anteriores, feitas com células primárias [27]. Além disso, em três dos O
2 linhas de células sensíveis (A2780, OVCAR5 e OVCAR8), a percentagem da população de células em fase G2 foi aumentada significativamente em 21% de O
2. No entanto, um aumento significativo no G2 não foi observado na quarta O
2 linha celular sensível, HOC8 (Tabela 1). Semelhante a HOC8, o O
2 linhas de células insensíveis, SKOV3 e HeyA8, não exibir uma alteração significativa na proporção de células na fase G2 do ciclo celular quando cultivadas sob 3% O
2 ou 21% O
2 (Tabela 1). Considerando que os O
2 linhas de células sensíveis proliferaram mais lentamente em 21% O
2 em comparação com 3% de O
2, apesar de ter menores proporções de sua população de células em G1 e um aumento das proporções em S e G2, conclui-se que essas células devem estar a progredir mais lentamente através do ciclo celular. No entanto, para o
2 linhas O insensíveis celulares e HOC8 (com o tempo de duplicação significativamente prolongada), não observamos um aumento significativo da percentagem de células em G2 quando o O
2 níveis foram aumentados. Estes resultados sugerem que, embora os G1 e S fases do ciclo celular estão a responder de forma semelhante às mudanças em O
2 concentração em ambos O
2 linhas de células sensíveis e insensíveis, é a fase G2 do ciclo celular que é não responde a o
2 concentração nas o
2 linhas de células insensíveis. Portanto, a diferença na resposta do ciclo celular observada com estas linhas de células do cancro do ovário pode ser ao nível da regulação durante a progressão do ciclo celular de G2 para fase M. É também possível que as alterações observadas com G2 e S
2 sensibilidade nestas linhas celulares de cancro é reflectida no componente mitótica do ciclo celular. Nossa observação das células mitóticas presentes no O
2 linhas de células sensíveis e insensíveis cultivadas em 3% e 21% de O
2 suporta esta conclusão; o O
2 linhas de células sensíveis mostram uma diminuição proporcional na população de células mitóticas observado em 21% de O
2 em comparação com 3% O
2, (Figura 3), o que corresponde a uma acumulação de células em G2 a 21% de O
2 (Tabela 1). Da mesma forma, nos
2 linhas celulares O insensíveis (HeyA8 e SKOV3) a proporção de células mitóticas permaneceu inalterada independentemente de O
2 concentrações (Figura 3). Isto é esperado porque, como observado anteriormente (Tabela 1), a percentagem de células em G2 em o O
2 linhas de células insensíveis também não foram afectadas por O
2 concentração. Conclui-se que a maioria das células cancerosas retêm a capacidade de regular o ciclo celular em resposta a mudanças no O
2 concentração comparável com as células de tipo selvagem [27]. No entanto, algumas células cancerosas podem perder O
2 concentração de controlo dependente de ciclo celular (tal como no S
2 linhas celulares de cancro insensíveis), resultando em um fenótipo distinto.
Índice mitótico no ovário linhas celulares de cancro que foram cultivadas sob 3% ou 21% de o
2 para 3 dias foram determinados por contagem dos núcleos com cromossomas condensados, entre um mínimo de 1000 células presentes em cada experiência. A significância estatística foi determinada por ANOVA e a diferença significativa no índice mitótico entre 3% e 21% de O
2 é indicado por um asterisco [(*)
P
0,05, (***)
p Art 0,0001]
Oxygen insensibilidade correlaciona com componentes G2 alterada /M
até agora temos demonstrado que O
2. resposta do ciclo celular sensível na transição G2 /M que falta aos
2 linhas de células insensíveis S. Nós, portanto, passou a caracterizar essa observação ainda por determinar o componente de G2 /M regulação é deficiente nas células O
2-insensitive câncer. A principal efector de transição G2 /M é CDC2 [22], [28]. CDC2 forma um complexo com ciclina B [29], [30], que fosforila várias proteínas estruturais resultantes no colapso da membrana nuclear, condensação e segregação de cromossomas [30], [31] e inactivação de outro ciclo celular proteínas reguladoras tais como Wee1, RB e cdc25C [30], [32]. Nas células normais, os níveis totais de proteína CDC2 são mantidas constantes durante todo o ciclo celular [33] e são reguladas por modificação pós-traducional [33] e a localização celular [30], [31]. Uma vez que o resíduo Tyr15 em CDC2 é desfosforilado por cdc25C, CDC2 activado forma um complexo com ciclina B, acumula-se no núcleo, e promove a transição G2 M /[30], [33], [34]. Isto ocorre de uma forma passo a passo através de quantidades crescentes de proteína CDC2 nuclear [30]. O nosso exame de proteína CDC2 total e proteína CDC2 fosforilada revelou que ambos são consideravelmente mais baixos nos
Linhas de O 2-insensíveis celulares (HeyA8 e SKOV3) em comparação com as linhas de células
2-sensíveis O (Figura 4A). Embora os níveis de CDC2 eram relativamente alto no O
2 de minúsculas linhas celulares (A2780, OVCAR5 e OVCAR8) (Figura 2), observou-se uma diminuição da Tyr15 estado de fosforilação independentemente de O
2 de concentração para A2780, OVCAR5 e OVCAR8 com o aumento dos níveis no soro (Figura 4A). Isto correlaciona-se com a observação de que a concentração crescente causas soro aumento da proliferação celular e resulta numa redução concomitante na proporção de células em G2 /M (comparar com a Tabela 1). No entanto, não é evidente S
alteração 2-dependente em qualquer ciclina B ou cdc25C, total ou fosforilado foi observada no O
2 linhas de células sensíveis (A2780, OVCAR5, OVCAR8 e HOC8) em comparação com O
2 insensível linhas celulares (HeyA8 e SKOV3) (Figura 4A). Por conseguinte, afigura-se que a diminuição observada na população de células em G2 em 21% de O
2 não pode ser dependente de inactivação mediada por fosforilação de CDC2. Deve notar-se que estas experiências foram realizadas em células em crescimento de forma assíncrona, e, portanto, é possível que as diferenças transitórios no estado de CDC2 foram perdidas. Interessantemente, os níveis de CDC2, ciclina B e cdc25C (o regulador negativo da CDC2) foram consideravelmente mais baixos em O
2 linhas de células insensíveis (HeyA8 e SKOV3) em comparação com O
2 linhas de células sensíveis (A2780, OVCAR5, OVCAR8 e HOC8) (Figura 4A). Estas observações sugerem uma deficiência inerente dos componentes principais envolvidos na progressão G2 /M no O
2 linhas de células insensíveis.
lisados de proteína preparada a partir das linhas celulares do cancro do ovário mantidas em meio de crescimento consistindo de aumentar As concentrações de soro e 21% ou 3% O
2 foram analisados por Western blot. (A) Em comparação com o
2 linhas de células sensíveis, a expressão dos componentes de núcleo envolvidos em G2 /M do ciclo celular progressão CDC2 /complexo B1 ciclina diminuiu e a sua Cdc25C activador é observado no O
2 linhas de células insensíveis ( indicadas por um asterisco e em itálico), enquanto a expressão de 14-3-3 σ, uma proteína que inibe a CDC2 está elevada no o
2 linhas de células insensíveis. (B) A fosforilação de Rb e Wee1 foram monitorizados como um indicador para a função de RB CDC2 porque ambos são conhecidos e Wee1 alvos para a fosforilação pela CDC2. O carregamento igual de extractos de proteína foram monitorizados por sondagem das transferências de Western descascado com o anticorpo primário por β-actina.
p53, p21 e 14-3-3 σ são factores que têm a capacidade de influência negativamente CDC2 e actividade transição G2 /M [22]. entendimento atual é que ciclo celular p53 e p21 influência na hipóxica e condições hiperóxidos [23], [24], [35], [36]. Considerando os níveis reduzidos de CDC2 e do G2, aparentemente com defeito /M checkpoint no O
2 linhas de células insensíveis (HeyA8 e SKOV3), que explorou a possibilidade que o prejuízo foi devido a um defeito em qualquer desses reguladores moleculares. análise de Western blot encontrados p53 e p21 a ser sobre-expresso em um O
2-insensitive linha de células (HeyA8). No entanto, ambos estavam ausentes no outro O
2-insensitive linha de células (SKOV3), e o padrão de expressão para estas proteínas permaneceu inalterado independentemente das alterações em O
2 ou concentração sérica (Figura S1), sugerindo que nem p53 nem p21 é relevante para a função de CDC2 em o
2 sensibilidade. Curiosamente, foi observada uma elevação considerável na expressão de 14-3-3 σ (Figura 4A) na ó
sub linhas de células insensíveis (HeyA8 e SKOV3) em comparação com as linhas celulares O
2-sensível. Embora, o nível de expressão de 14-3-3 σ era consideravelmente mais baixa em todas as O
2 linhas celulares sensíveis em comparação com HeyA8 e SKOV3, que foi observado um aumento na expressão de 14-3-3 σ a 21% O
2 com A2780 (Figura 4A). Embora contraditório ao papel inibitório conhecido de 14-3-3 σ na actividade CDC2, concluiu-se que níveis elevados de 14-3-3 σ combinadas com os níveis reduzidos de CDC2 em uma célula de cancro proliferação pode indicar uma falta de controlo de G2 /progressão M em resposta a o
2 níveis.
para esclarecer a consequência dos baixos níveis de proteína CDC2 observados nas linhas de células S
2-insensíveis, determinou-se a actividade funcional dos restantes CDC2 examinando a fosforilação de dois dos seus substratos, RB e Wee1. Fosforilação de RB no 807 resíduo Ser é mediada por CDC2 [32], e observou-se esta fosforilação independentemente dos níveis de CDC2 ou O
2 níveis, com 10% de soro para todas as linhas de células, exceto HOC8 (Figura 4B), indicando CDC2 unimpaired actividade nestas linhas celulares. Uma redução na RB fosforilada correlacionada com a redução da concentração de soro (Figura 4B) e correlacionado com o aumento da acumulação de RB total no O
2-sensível linhas celulares (A2780, OVCAR5 e OVCAR8), mas não em HOC8 (Figura 4B) . RB total foi de quase indetectável nos sub
linhas de células insensíveis 2-O (HeyA8 e SKOV3) (Figura 4B), com a excepção de soro a 2% a 3% O
2 condição na linha celular HeyA8. Curiosamente, uma comparação entre o padrão de expressão RB (Figura 4B) e a proliferação de células (Figura 2) revelou que as células HOC8, HeyA8 e SKOV3 crescem melhor em meio de cultura de células com uma baixa concentração de soro (2%) em comparação com A2780, OVCAR5 e OVCAR8. Assim, parece que a resposta total nível de proteína RB permanece intacto em O
2 linhas de células sensíveis e que essa resposta é provavelmente mais relevante para as concentrações séricas do que O
2 níveis. O outro alvo para a inactivação mediada por CDC2 por fosforilação é Wee1, que também podem inibir a função CDC2 mutuamente por fosforilação [37]. Observamos aumento fosforilação de Wee1 no O
2 linhas de células sensíveis (A2780, OVCAR5 e OVCAR8), mal níveis detectáveis em HOC8, (Figura 4B) e uma completa ausência nas linhas de O
celulares 2-insensitive ( HeyA8 e SKOV3, Figura 4B). Este padrão foi amplamente recapitulou para níveis de proteína Wee1 totais (Figura 4B). Portanto, a ausência de fosfo-Wee1 nas sub
linhas de células de 2-insensíveis ó não indica uma ausência de actividade de CDC2, mas em vez de uma ausência de substrato Wee1. A partir desses resultados, concluímos que, apesar das quantidades reduzidas de CDC2 no O linhas celulares
2-insensíveis, CDC2 é funcionalmente ativo e desinibida pelo aumento dos níveis de 14-3-3 σ. Deve notar-se que Rb e CDC2 ato uns sobre os outros para regular cada função de outros [38], e estado de fosforilação de RB [26] ou CDC2 [39] poderia influenciar a expressão de E2F mediada de ciclinas que são essenciais para a progressão do ciclo celular. Portanto, considerando essa relação complexa entre RB e CDC2, o padrão de fosforilação de RB é insuficiente para predizer G2 /M progressão.
Em resumo, o O
2 de minúsculas linhas celulares (A2780, OVCAR5 e HOC8 ) mostraram um aumento da expressão de CDC2 e ciclina B combinada com baixo nível de expressão de 14-3-3 σ. Isto sugere que os componentes do ciclo celular necessários para uma resposta proliferativa dinâmica a diferenças na
2 concentração de O está presente nessas linhas celulares. No entanto, no ó linhas celulares
2-insensíveis que expressam elevados níveis de 14-3-3 σ e baixos níveis de CDC2 e cdc25C tal resposta dinâmica do ciclo celular a alterações em O
2 concentração poderia ser prejudicada. Por isso, prosseguiu a possibilidade de que essa correlação inversa entre 14-3-3 σ e CDC2 pode ser importante para o O regulamento
2-sensível do G2 transição /M.
14-3-3 σ e progressão mitótico na sensibilidade de oxigênio
As nossas observações anteriores sugerem uma associação entre o nível elevado de 14-3-3 σ e o
2-insensibilidade que precisa ser confirmada. Por isso, queríamos confirmar que 14-3-3 σ realmente afeta O proliferação
2-dependente. Para esta parte do estudo, restringimos nossa análise a duas linhas de células com p53 do tipo selvagem: o O A2780
2-sensíveis [40], e O
2-insensíveis linhas celulares HeyA8 [41]. Até agora temos usado análise de Western blot para monitorar os níveis de expressão globais de 14-3-3 σ e CDC2 (Figura 4A). No entanto, uma vez que as respostas funcionais destas proteínas são dependentes da sua localização celular, utilizou-se imunofluorescência para determinar a sua localização celular sob 3% O
2 e 21% de O
2. No ó
2-sensível linha de células A2780, a localização de 14-3-3 σ foi restringida para o citoplasma sob 3% O
2 (Figura 5A), mas foi encontrado tanto no núcleo e citoplasma em 21% O
2 (Figura 5A). CDC2 foi distribuído em toda a célula e a sua localização não foi afectada por O
2 concentração. Por conseguinte, parece que a exclusão nuclear de 14-3-3 σ correlaciona com uma diminuição da fracção de células na fase G2 /M e uma progressão do ciclo celular não inibido quando A2780 é cultivada a 3% O
2, tal como referido antes (Tabela 1). Em contraste, o O
2-insensível linha celular HeyA8 mostrou elevados níveis de 14-3-3 σ e baixos níveis de CDC2 (Figura 4A), com uma quantidade considerável de 14-3-3 σ no citoplasma (Figura 5A). Além disso, 14-3-3 σ ficou excluída do núcleo, mesmo a 21% de O
2 no HeyA8 células (Figura 5A). Estas observações foram adicionalmente verificada por análise de transferência de Western de fracções de células nucleares e citosólicos obtidos a partir destas células (Figura 5B). Finalmente, para confirmar o efeito sobre a transição G2 /M, determinou-se a proporção das células na fase M por S diferente
2 concentrações usando o marcador de fosfo-histona H3 específica mitose. Nas células O
2-sensitive A2780, menos de 21% de O
2, observou-se uma diminuição no índice mitótico (P 0,001), em comparação com 3% de O
2 (Figura 5C). No such O
mudar 2 dependente do índice mitótico foi observado para as células O
2-insensíveis HeyA8 (Figura 5C). Estes resultados suportam nossa conclusão inicial, de que os O
2-insensíveis células linhas têm uma deficiência na regulação da progressão do ciclo celular em G2 /M em resposta ao aumento O
2 níveis (Figura 2).
(a) a localização celular por imunofluorescência mostra que 14-3-3 σ (verde) está localizada no citoplasma e CDC2 (vermelho) está presente no núcleo (azul). Em comparação com O
2 células A2780 sensíveis, o nível de 14-3-3 σ é maior e CDC2 é baixa nas O
2 células HeyA8 insensíveis. No ó
A2780 2 sensível, 14-3-3 σ está localizado tanto no núcleo e citoplasma em 21% O
2. (A linha amarela pontilhada, esboça um núcleo representativo para indicar a localização relativa de 14-3-3 σ e CDC2 nestas células). (B) Análise de transferência de Western de fracções nucleares e citoplasmáticos mostram baixos níveis de 14-3-3 σ no núcleo para o citoplasma em comparação, com o aumento da quantidade de 14-3-3 σ estar presente no citoplasma do S
2 células HeyA8 insensíveis. O nível de CDC2 é superior tanto no núcleo e no citoplasma do S
A2780 2 sensível, mas presente numa quantidade inferior apenas no núcleo de O
2 HeyA8 células insensíveis. A histona H1 e β-actina foram utilizados como controlos de carga, para as fracções nucleares e citoplasmáticos, respectivamente. (C) As células mitóticas foram determinados por contagem das células que coraram positivamente para um marcador específico mitose, fosfo-Histona H3 da população celular total. (C). As experiências foram realizadas em triplicado.