Abstract
p53 e cálcio sinalização são interdependentes e são conhecidos por mostrar tanto efeitos sinérgicos e antagonistas uns sobre os outros no ambiente celular. No entanto, nenhum mecanismo molecular ou via celular é conhecido que mostra regulação directa entre estas moléculas de sinalização celulares importantes. Aqui mostramos que em células de cancro tratados com fármaco anti-neoplásico GAQ
3, p53, há um aumento dos níveis de cálcio intracelulares pela regulação da transcrição de um gene do canal de cálcio TRPC6 romance. p53 se liga directamente a um elemento de resposta de 22 pb no promotor do gene TRPC6 e aumentar o seu ARNm e a expressão da proteína. A sobre-expressão de resultados TRPC6 em morte apoptótica dependente de cálcio e a activação de genes apoptóticos em uma variedade de células cancerosas. Este trabalho mostra que a p53 e a sua actividade de transcrição é crítico na regulação da sinalização de cálcio e um aumento do nível intracelular de cálcio pode ser uma das estratégias anti-cancro para induzir a apoptose em células cancerosas
citação:. Madan E, Gogna R, Keppler B, Pati U (2013) p53 aumenta a liberação de cálcio intracelular pela regulação da transcrição do canal do cálcio de TRPC6 em GAQ células cancerosas
3-tratado. PLoS ONE 8 (8): e71016. doi: 10.1371 /journal.pone.0071016
editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos da América
Recebido: 15 Abril 2013; Aceito: 30 de junho de 2013; Publicação: 16 de agosto de 2013
Direitos de autor: © 2013 Madan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Cancer Swiss League, Josheph Steiner conceder subvenções e Conselho indiano de Mecical Research (ICMR). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
gálio e seus derivados orgânicos têm mostrado alta consistência e eficiência como drogas anti-câncer [1] – [5]. Recentemente, estabeleceu um derivado orgânico romance de gálio “GAQ
3″ [tris (8-quinolinolato) gálio (III)] (KP46) como um fármaco anti-cancro eficaz nas células cancerosas com a WT-p53 ou MT-p53 proteína [6]. Observou-se que GAQ
3 induz a sinalização de cálcio em células cancerosas através do aumento dos níveis de cálcio intracelulares. Aumento do Ca celular
2 + ativa a proteína p53 e aumenta os níveis de p53 celular. GAQ
3-induzida da libertação de cálcio intracelular foi significativamente mais elevada nas células cancerosas com a p53 do tipo selvagem do que nas células cancerosas com a p53 mutante ou com deleção do gene p53 [6]. Curiosamente, verificou-se que o aumento no Ca intracelular
2+ libertação era dependente de p53 e a inibição da actividade de transcrição de p53 utilizando pifithrin-α aboliu o Ca
2+ libertação intracelular. Esta observação sugeriu que a p53 pode transcrição regular intracelular Ca
2 + células cancerosas
3-tratados de liberação e Ca
2 + Sinalização GAQ. p53 e de cálcio são conhecidos para funcionar em sinergia, mas nenhuma relação directa foi estabelecida entre a activação e regulação de p53 dependente de p53 de sinalização de cálcio a nível celular, bioquímica ou molecular. Em determinados relatórios Ca
2 + induzida por sinais como Ca
2 vias + -activated RAF /MEK /ERK mediada apoptose independente de p53 [7]. Também está previsto que o p53 funciona em estreita relação com a sinalização de cálcio celular, uma vez que a libertação de cálcio intracelular desempenham um papel importante na indução de Bcl-2, e de ROS mitocondrial via de apoptose [8]. No entanto, nenhum mecanismo molecular ou via de regulação medited-p53 de libertação de cálcio intracelular é conhecido.
Neste estudo demonstrámos que a sinalização de cálcio celular e libertação de cálcio intracelular são sob o controlo transcricional da proteína p53. transcricionalmente p53 regula um TRPC6 canal de cálcio directamente romance de se ligar a uma 22 pares de bases do p53-RE presentes 400 pares de bases a montante do local de transcrição começar um (TSS) no promotor TRPC6. Observamos que GAQ
3 induz a apoptose através de regulação positiva dependente de p53 do gene TRPC6 em células cancerosas com Wt p53. A sobre-expressão de resultados TRPC6 em apoptose significativa em células cancerosas. Além disso expressão TRPC6 inicia uma regulação dependente de cálcio da expressão de genes envolvidos na apoptose.
Materiais e Métodos
cultura celular
MCF-7, U2OS, HCT, A -431, PC3 e H1299 células foram obtidas a partir de National Center for Cell Science, Pune (India) e foram mantidas em meio DMEM. As células foram cultivadas como monocamadas em meio DMEM suplementado com 10% de soro de bovino (v /v) inactivado pelo calor fetal e antibióticos, e incubou-se a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 95% de ar e 5% de CO
2 Todos as transfecções foram realizadas utilizando o reagente de transfecção Effectene (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. Para o curso de tempo de análise 5 placas de Petri para cada ponto de tempo foram utilizados.
Plasmids e reagentes
promotor de comprimento total p53-TRPC6, p53-TRPC6 promotor mínimo e promotor mínimo mutante p53-TRPC6 foram clonado no pGL3 lucif erase vector. p53 si-RNA também foi usado como descrito anteriormente por [9] – [11].
usando Ensaio para Ca
2 + mobilização
Ca
2 + foi medida a permeável Ca
2 + corante fluorescente fluoroscopia éster sensíveis 3 acetoximetilo celular. Onde indicado, éster acetoximetilo BAPTA (10 uM) foi adicionado ao meio de cultura de células em placas de cultura de tecidos de plástico de 10 cm para um 1-h de exposição anterior ao procedimento de carregamento com éster de acetoximetilo de Fluo-3. O meio foi removido das placas de cultura de tecidos e substituído com 4 uM Fluo-3 éster acetoximetilo diluída em tampão de Krebs-Ringer (KRB) (10 mM de D-glucose, NaCl 120 mM, KCl 4,5 mM, Na2HPO4 0,7 mM, NaH2PO4 1,5 mM e MgCl 2 0,5 mM (pH 7,4 a 37 ° C)) (Sigma) durante 20 min. Os pratos foram lavados uma vez com 5 ml de KRB para remover o corante residual. As células foram recolhidas por tripsinização, lavadas em 5 ml de Ca
2 + livre de PBS a 37 ° C, sedimentadas por centrifugação, re-suspenso em 1 ml de Ca
2 + livre de PBS a 37 ° C, e analisadas imediatamente para Fluo-3 intensidade de fluorescência por citometria de fluxo.
por favor, consulte arquivo S1 para a descrição completa do material e métodos.
Resultados
GAQ
3 induz a expressão do gene TRPC6 em células cancerosas com p53 de tipo selvagem
Nós já havia observado que GAQ
3 induz a liberação elevada de cálcio intracelular seletivamente nas células cancerosas com a proteína p53 do tipo selvagem [6]. O silenciamento do gene p53 utilizando SiRNA p53 e a inibição da actividade de transcrição de p53 utilizando pifithrin-α tanto aboliu o aumento GAQ
3-induzido na libertação de cálcio intracelular [6]. Estes dados sugerem que aumento intracelular dos níveis de cálcio nas células cancerosas foi regulada por p53 e foi dependente da atividade p53 transcrição. No entanto, o mecanismo envolvido na regulação deste fenômeno observado é desconhecida [6]. Desde GAQ
3-induzida aumento significativo na absorção de cálcio, usando qPCR foi analisada a expressão de um grande número de canais de cálcio conhecidas na GAQ
3 tratados com células MCF-7. Observou-se significativamente elevada expressão do gene TRPC6 em GAQ
células 3-tratados. Uma vez que a expressão do canal de cálcio TRPC6 foi alta, que se pediu TRPC6 pode estar envolvida no aumento dos níveis de cálcio celular em células cancerosas
3-tratados GAQ. A expressão de ARNm e proteína TRPC6 foi observada em GAQ
3-tratada MCF-7, células H1299 e PC3 (Figura 1 A). A análise mostra que qPCR TRPC6 ARNm foi significativamente aumentada em GAQ
3-tratada MCF-7 (p53 Wt) células (Figura 1A). O aumento no nível de ARNm de p53 não foi observada em H1299 (p53 nulo) e PC3 (p53 mut) células (barras 3-6; Figura 1A). Do mesmo modo o nível de proteína p53 foi analisada nas células cancerosas e só acima mencionados MCF-7 apresentou um aumento significativo no nível de proteína p53 em cima GAQ
3 tratamento (Figura 1A). Este dados sugerem que a p53 desempenhou um papel importante na regulação positiva GAQ
3-mediada de TRPC6. Além disso, a relação entre a expressão de p53 e a expressão é observada TRPC6. A análise tempo-curso do nível de ARNm TRPC6 (-PCR em tempo real) em GAQ
3-tratada MCF-7, células H1299 e PC3 mostram que TRPC6 ARNm foi significativamente elevado em p53 (+ /+) células MCF-7 ( Figura 1B; linha preta). análise tempo-curso mostra que GAQ
3 induz a expressão de TRPC6 dentro de 6 horas da sua incubação ea expressão TRPC6 aumenta de 6
th a 24
th hr em um padrão semelhante em que aumento na expressão de p53 células
3-tratados GAQ [6] ref é agora colocado. Estes dados sugerem que p53 e TRPC6 mostram relação temporal em seu perfil de expressão de mRNA. O papel directo da p53 na expressão de TRPC6 em GAQ
3-tratados células MCF-7 é observado por silenciamento do gene p53 em GAQ tratados com 3
células MCF-7 (Figura 1C). Os resultados mostram que a expressão da proteína TRPC6 foi significativamente elevado em cima GAQ
3 tratamento (pista 2); aumento no entanto induzida por 3 deste GAQ
em TRPC6 foi completamente revertido após silenciamento p53 (pista 3). Estes dados sugerem que p53 tem um papel importante na regulação do gene TRPC6. Analisou-se ainda mais a eficiência de TRPC6 siRNA e ADNc TRPC6 (2 uM) em células MCF-7.
a) o efeito de GAQ
3 sobre a expressão de ARNm de p53 em TRPC6 (+ /+) MCF-7, p53 (- /-) e H1299 células PC3 p53 (MT /MT) é observada usando qPCR. Os resultados mostram que GAQ
3 pode induzir a sobre-regulação de TRPC6 apenas em células MCF-7 com p53 wt (pista 2). Da mesma forma GAQ
3 pode induzir a expressão de proteína TRPC6 apenas em células MCF-7 (n = 5). B) PCR em tempo real mostra a análise de evolução no tempo da expressão de mRNA TRPC6 in-tratados GaQ3 MCF-7 (linha preta), H1299 (linha verde) e PC3 () células da linha vermelha. Os resultados mostram que TRPC6 ARNm é regulada apenas nas células MCF-7 e não em células H1299 e PC3. Além disso, o aumento em ARNm TRPC6 é observada no 6
th h de incubação GaQ3. O aumento do mRNA TRPC6 é temporariamente relacionada com o aumento do mRNA p53 em tratados GaQ3 7 MCF-células (* (vermelho) representa a diferença significativa entre os resultados de linha vermelha, verde e preto na 9
th ponto de tempo hr , p 0,028), n = 5, Anova, barras de erro representam DP). C) O papel da p53 na GAQ
3 induzida por regulação positiva de TRPC6 é observado. p53 silenciamento de genes utilizando p53 siARN em GAQ
3-tratados células inverter o aumento do nível de proteína TRPC6 (pista 3) (* (vermelho) representa a diferença significativa nos resultados entre a pista 1 2, p 0,036 e pista 2 3, p 0,042). A eficiência do TRPC6 siRNA e cDNA TRPC6 são mostrados na pista 4 e 5.
p53 transcricionalmente ativa promotor TRPC6
TRPC6 (11q22.1 cromossoma, costa reverso) e p53 mostrou temporais relações em seu perfil de expressão em GAQ células cancerosas
3-tratados, portanto, era de interesse para definir o papel do p53 na regulação da TRPC6. A região promotora TRPC6 foi identificada como sequência de ADN de 650 pb a montante do local de início da transcrição 1, usando jogos de matriz determinadas pelo Inspector Mat (Genomatix). promotor TRPC6 foi fornecido o locus ID GXP_193240 pelo Inspector Mat. Esta região encontra-se entre as regiões 101,374,672-101,375,321 (ponto de ref TSS representado pelo Inspector Mat é 101.374.772) e é representado por ENST00000527240 e AK027769. análise bioinformática do promotor TRPC6 utilizando o módulo Mat Inspector de banco de dados Genomatix mostrou sítio de ligação DNA p53 putativa (sim matriz; pontuação 0,9) (Figura 2A), sugerindo que o p53 pode ser um potencial regulador TRPC6. Para estabelecer isto, um clonado 0,65 kb do promotor putativo TRPC6 que suporta o elemento de resposta p53 (p53RE) num vector básico pGL3 para gerar pTRPC6p-luc1. O pTRPC6p-luc1 foi transfectado em não tratada e GAQ
3-tratada MCF-7, células H1299 e PC3. GAQ
3 tratamento induziu aumento de 5-vezes na actividade de promotor TRPC6 em células MCF-7, em comparação com as células não tratadas (Figura 2B; barra 2 e 3). O aumento na actividade do promotor foi TRPC6 desde aumento silenciamento do gene p53 p53 utilizando siRNA inverteu a GAQ
3-induzida na actividade do promotor TRPC6 dependente de p53. GAQ
tratamento 3 foi incapaz de induzir a atividade do promotor TRPC6 em H1299 e células PC3 (barra 5, 6, 8 9). promotor TRPC6 foi activado em GAQ
3-H1299 tratadas as células que foram transfectadas com cDNA de p53 (barra 7). Estes dados mostraram que TRPC6 foi regulada por p53 em GAQ
células 3-tratados. Para confirmar adicionalmente o papel de p53RE na regulação mediada por p53 de promotor TRPC6, a região entre os pares de bases -74 a -99 (com referência à SEQ TSS (101374772) do promotor TRPC6 transportando o p53RE foram clonados num vector pGL3 para gerar o mínimo pTRPC6p-luc2. este promotor mínimo TRPC6 foi induzida mediante GaQ3-tratamento em células MCF-7 e silenciamento p53 aboliu este aumento na actividade do promotor (Figura 2C, barras 2-4). a fim de estabelecer o papel da recém-identificado p53RE na regulação mediada por p53 do gene TRPC6, a sequência p53RE foi mutado e clonado no vetor PGL3 para gerar o mutante mínima mmpTRPC63p-luc2. transfecção de mmpTRPC63p-luc2 em GAQ
3-tratado MCF-7, PC3 e células H1299 não mostrou nenhum aumento na actividade do promotor TRPC6 (Figura 2D). Estes dados estabelece que a p53 regula transcricionalmente TRPC6 em GAQ
3-tratados células cancerosas.
a) observa-se um sítio de ligação putativo de p53 em o promotor TRPC6 utilizando o módulo Genomatix, MatInspector. TRPC6-p53RE situa-se entre -422 a -400 pb no promotor TRPC6 0,6 kb. A SEQ ADN do promotor TRPC6 juntamente com a localização de p53 RE (mostrado em vermelho) está representada esquematicamente. B) pTRPC6p-luc1 (TRPC6 0,6 kb construção do promotor de luciferase) é transfectado em GAQ
3-tratados células MCF-7 e efeito de p53 sobre a actividade da luciferase é medida. GAQ activação do gene p53
3-induzida induz aumento de 8 vezes na actividade de luciferase pTRPC6p-luc1 (barra 3). p53 silenciamento do gene p53 usando siRNA inverte este efeito e promotor TRPC6 activação é abolida (barra 4). A transfecção de pTRPC6p-luc1 em células H1299 e PC3 na ausência ou presença de GAQ
3 não tem efeito sobre a actividade do promotor TRPC6. Após a adição exógena de ADNc de p53 Wt em GAQ
3-H1299 tratadas células do promotor TRPC6 mostra aumento de 9 vezes na actividade da luciferase (barra 7). Estes dados mostram que a p53 regula promotor TRPC6 transcrição. (C) pTRPC63p-luc2, o p53RE TRPC6-(-422 a -400) clonada no vector de luciferase é transfectado em GAQ
3-tratados células MCF-7. Os resultados mostram que a p53 induz um aumento de 6 vezes na actividade de luciferase TRPC6-p53RE (barra 3). p53 silenciamento do gene p53 utilizando siRNA suprime o aumento da actividade de luciferase (barra 4). O aumento na actividade do promotor TRPC6 está ausente em células H1299 e PC3. Os dados mostram que a p53 regula o promotor TRPC6 através TRPC6-p53RE. (D) A mmpTRPC6p-luc2 construção com a sequência mutada de TRPC6-p53RE é transfectado em GAQ
3 tratados com células MCF-7. Nenhum aumento na actividade da luciferase é observada, demonstrando a especificidade de TRPC6-p53RE. Para figura 2b-2d, (* (vermelho) representa a diferença significativa nos resultados todos os valores de p 0,05), n = 7, Anova, barras de erro representam SD)
WT p53 se liga diretamente para. seu elemento de resposta no promotor TRPC6
a ligação do p53 na região do par do 22 de base no promotor TRPC6 foi analisada sob
in-vitro
condições usando EMSA (Figura 3A). Os dados mostraram ligação da p53 na sequência TRPC6-p53-RE, como uma mudança clara e super-desvio do complexo foi observada (pista 2). A ligação entre p53 e seu elemento de resposta foi perdida na proteína desnaturação de calor p53 (pista 3). A ligação entre a p53 e o seu elemento de resposta foi muito específica uma vez que a mutação da sequência de p53 RE par de base 22 aboliu a ligação entre a p53 e a sua re (pista 5-8). A ligação entre a p53 e o seu elemento de resposta ao elemento 5 ‘do promotor de p21 serve como controlo positivo (pista 9-12). Para definir melhor o papel de TRPC6-p53RE na indução TRPC6 mediada por p53 em
in-vivo
condições, realizamos imunoprecipitação da cromatina (ChIP) ensaios em GAQ
3 tratados com células MCF-7. Consistente com os resultados da luciferase, foi detectada uma produto de PCR específico derivado de TRPC6-p53RE (Figura 3B, painel superior). Entrada serve como controlo, na ausência de GAQ
3 p53 tratamento não mostraram ligação ao p53RE no promotor TRPC6. Após tratamento das células MCF-7 com GAQ
3, p53 mostra a ligação a sua re no promotor TRPC6, PCR com iniciadores mexidos serve como controlo negativo. Por outro lado, nenhuma ligação entre p53 e p53RE no promotor TRPC6 é observada em células H1299 e PC3 (figura 3B, painel inferior). Foi estabelecida a que TRPC6-p53RE foi responsável pela indução mediada por p53 da atividade do promotor TRPC6 e que p53 induz transcrição TRPC6 através promotor obrigatório em GAQ células
3-tratados. Desde GAQ
3 induz um aumento exponencial na libertação de cálcio intracelular em células cancerosas com p53 wt e p53 é agora mostrado ao transcricionalmente regular a TRPC6 canal de cálcio no GAQ
3-tratados células, o papel de TRPC6 na a libertação de cálcio mediada por p53 é observada. análise de fluxo de citometria da liberação de cálcio intracelular mostra que GAQ
3 tratamento induz um aumento exponencial na liberação de cálcio intracelular na 8
th h de sua incubação (Figura 3D, linha vermelha), após o silenciamento do gene TRPC6 TRPC6 utilizando siRNA observou-se que o aumento exponencial 8 h nos níveis de cálcio intracelular foi invertida e o aumento dos níveis de cálcio tornou-se linear como anteriormente observado em p53 nulo (H1299) e de células mutante p53 (PC3). Estes dados mostram que o GAQ
3-induzida e aumento mediado por p53 na libertação de cálcio intracelular é devido à transcrição dependente de p53 sobre-regulação de proteína TRPC6 nas células cancerosas tratadas.
A) EMSA é conduzido para estudar a ligação entre p53 e seu elemento de resposta no promotor TRPC6 sob
in-vitro
condições. Uma mudança e um super-shift da p53, p53AB eo p53-RE são observadas na pista 2. A ligação entre p53 e seu RE é perdido após uma sequência de p53 mutante RE é usado para EMSA, mostrando alta especificidade desta interacção ( pista 6), a ligação entre a p53 e a sua p215’RE conhecida é usada como controlo (pista 9-12). (B) a imunoprecipitação da cromatina é conduzida em GAQ
3-tratados células MCF-7 para confirmar
in vivo
ligação de p53 no promotor p53RE TRPC6. p53 mostra positiva TRPC6-p53RE ligação exclusivamente na GAQ
células 3-tratados. Entrada serve como controlo positivo e mexidos iniciadores para PCR foram usadas como controlo negativo (n = 5). (C) A ligação entre TRPC6 RE e p53 não é observada em células H1299 e PC3, mesmo na presença de GAQ
3 (n = 5). (D) Análise de curso de tempo da libertação de cálcio intracelular é observado na GAQ
3-tratados células tratadas com três células MCF-7 (linha a vermelho) e GAQ
MCF-7, onde gene TRPC6 é silenciados usando TRPC6 siRNA ( linha preta). Os resultados mostram que GAQ
3 induz o aumento acentuado na libertação de cálcio intracelular em p53 (+ /+) células MCF-7 de 6
th h de sua incubação. O silenciamento da TRPC6 abole este 6
th aumento hr na liberação de cálcio intracelular (* (vermelho) representa diferença significativa entre os resultados de linha vermelha e preta no 8
th ponto de tempo hr, p 0,029) , n = 5, Anova, barras de erro representam SD).
TRPC6 induz apoptose dependente de cálcio em células cancerosas
Foram analisados ainda mais a relevância fisiológica deste regulamento dependente de p53 de TRPC6 expressão e os níveis de cálcio intracelulares. Desde p53 é um jogador-chave no governo estratégias apoptóticos celular em células cancerosas. Colocámos a hipótese de que a expressão dependente de p53 de TRPC6 pode ser outra via celular através do qual a p53 pode induzir apoptose em células de cancro. Assim, foi analisado o efeito da expressão TRPC6 na apoptose celular em células do tipo selvagem p53 (MCF-7, U2OS, HCT p53 + /+) (), células de p53 mutantes (A-43, PC3) e p53 nulo células (H1299) . Estas linhas de células foram expressos ectopicamente com TRPC6 ADNc (Figura 4a) e a apoptose celular foi comparada com a coloração de células utilizando anexina-V e a citometria de fluxo de controlo (células transfectadas com un). Os resultados mostraram um aumento significativo na fracção de apoptose das células cancerosas que sobre-expressam TRPC6, independentemente do estado do gene p53. Em seguida observou-se o papel do cálcio intracelular em apoptose mediada por TRPC6 por têmpera da libertação de cálcio intracelular através de TMB-8. Os resultados mostraram que a têmpera da libertação de cálcio intracelular através de TMB-8 aboliu a apoptose mediada por TRPC6 em células cancerosas. Estes dados sugerem que o aumento dependente da TRPC6 na libertação de cálcio intracelular é crucial para a apoptose, assim, o aumento dependente da p53 na expressão TRPC6 em células de cancro pode ser uma estratégia para induzir apoptose através de vias mediadas por cálcio. Esta pode ser uma outra via celular aprovada pela p53 para evocar a resposta apoptótica e a função da molécula como supressor de tumor em células cancerosas privilegiada. Estes dados estabelece TRPC6 como um potencial proteína apoptótica que, no futuro, pode semear potencial para funcionar como uma molécula de gene-terapia anti-cancro. A fim de compreender a apoptose induzida por TRPC6 em detalhes observamos a ativação e supressão de um conjunto de chaves de 84 genes (SA-Bio ciências, PAHS012) envolvidos na indução e inibição da apoptose. A análise destes genes a expressão de ARNm foi realizado em células do tipo selvagem p53 (MCF-7, U2OS, HCT p53 (+ /+)), células de p53 mutantes (A-43, PC3) e células p53 nulo (H1299) (figura 4b). Na montagem experimental estas células foram sobre-expressa com o ADNc TRPC6 apoptótica. Os resultados foram consistentes em todas as linhas de células e mostrou que TRPC6 sobre-expressão resulta na regulação negativa dos genes envolvidos na inibição da apoptose e regulada positivamente dos genes envolvidos na indução da apoptose celular (Figura 4-B (pista 1, 5, 7, 8, 11 12)). Curiosamente, após a expressão ectópica de ADNc TRPC6 em células de cancro, onde o cálcio intracelular foi temperada por meio de TMB-8 de tratamento, o padrão de expressão do gene foi alterado e as expressões dos genes envolvidos na apoptose celular foi consistentemente baixa (Figura 4b (pista 17, 18 , 19, 20, 22 24)). O tratamento com doxorrubicina, utilizado como controlo positivo, resultou na supra-regulação de genes envolvidos na apoptose (Figura 4b (pista 2, 3, 4, 6, 9 10)). células cancerosas não tratados servem como controlos (Figura 4-B (pista 13, 14, 15, 16, 21 23)). Estes dados sugerem que TRPC6 induz apoptose via aumento dos níveis de cálcio intracelulares e por essa via que altera a expressão de genes envolvidos na apoptose, sugerindo que TRPC6 é um candidato potencial para estratégias anti-cancro pró-apoptóticos. Esta via molecular novo através do qual a p53 após activação por GAQ
3 regula a transcrição da expressão do canal de TRPC6 cálcio pró-apoptótica, o que por sua vez inflige a apoptose mediada por cálcio é uma estratégia interessante adoptada pelo p53 funcionar como um supressor do tumor. Além disso, esta via pode ser explorada para obter benefícios anti-cancro no futuro.
a) o efeito de TRPC6 a sobre-expressão é observada mediante a apoptose celular em células do tipo selvagem p53 (MCF-7, U2OS, p53 HCT (+ /+)), as células mutantes de p53 (a-431, PC3) e p53 (células nulas H1299) utilizando coloração com anexina-V e a citometria de fluxo. aumento significativo na fracção apoptótica de TRPC6 sobre-expressando células é visto independentemente do estado de p53-gene. Intracelular de cálcio de têmpera através de TMB-8 suprime a apoptose mediada por TRPC6; células não tratadas serve como controlo negativo, doxorrubicina serve como controlo positivo (* representa a diferença significativa entre as células tratadas com TRPC6 e tratados com TRPC6 e células tratadas com TMB-8; todos os valores de p 0,05, n = 7; D.P., ANOVA). (B) TRPC6 induz a expressão de genes apoptóticos em células cancerosas. conjunto de genes por PCR de genes envolvidos na regulação da apoptose celular é conduzida em cDNA TRPC6 transfectado p53 células do tipo selvagem (MCF-7, U2OS, p53 HCT (+ /+)), células de p53 mutantes (A-431, PC3) e p53 células nulas células (H1299). A sobre-expressão de resultados TRPC6 em infra-regulação de genes que inibem a apoptose e a sobre-regulação de genes pró-apoptóticos (pista 1, 5, 7, 8, 11 12). têmpera de cálcio intracelular em TRPC6 sobre-expressar os resultados de células na inibição da gens apoptóticas e aumento da expressão de genes anti-apoptóticos (pista 17, 18, 19, 20, 22 24). As células não tratadas também servem como controlos (pista 13, 14, 15, 16, 21 23); tratamento com doxorrubicina serve como controlo positivo o que leva a regulação positiva dos genes envolvidos na apoptose (pista 2, 3, 4, 6, 9 10). (n = 10)
Discussão
neste trabalho de pesquisa que têm demonstrado que a libertação de cálcio intracelular está sob o controlo de transcrição do supressor de tumor p53, por meio de regulação da transcrição dependente de p53 do gene TRPC6. Genoma ampla análise de locais de ligação de p53 nas regiões promotoras dos canais de cálcio mostrou a presença de RE no gene p53 TRPC6. Mostrámos que induz a expressão de GaQ3 TRPC6 apenas nas células cancerosas com a p53 de tipo selvagem e o silenciamento do gene p53 reverte o aumento induzido por GaQ3 na expressão TRPC6. Estes dados também estabelece que TRPC6 é um alvo directo da transcrição de p53 e p53 se liga ao seu elemento de resposta no promotor TRPC6. Nós descobrimos que o local de ligação de p53 no promotor do gene de 0,6 kb que se encontra TRPC6 400 pares de bases a montante do sítio do início da transcrição de um. O aumento súbito da libertação de cálcio intracelular e a apoptose celular mediada por cálcio em GAQ
3-tratados células cancerosas é devido à activação da transcrição dependente de p53 do gene TRPC6. Neste trabalho de pesquisa que têm mostrado uma ligação directa entre a capacidade p53 transcricional e sinalização de cálcio.
Compreender a relação entre a sinalização de cálcio e p53 é importante na perspectiva do cancro uma vez que ambos estes fatores regulam crescimento celular, diferenciação, envelhecimento , proliferação, a nível fisiológico, celular e molecular [12], [13]. No passado um Ca
2 + canal TRPC -permeable foi mostrado para participar de uma diversificada gama de funções celulares, regulando Ca intracelular
2 + sinalização [14]. mediada por TRPC6 Ca
2+ sinalização activa genes-proliferação celular como proteína quinase dependente de calmodulina e da proteína quinase activada por mitogénio [15]. O papel da TRPC6 no crescimento e desenvolvimento do cancro não é clara; no entanto múltiplos mecanismos estão envolvidos na ativação do canal TRPC6 e regulação em células cancerosas. Os factores fisiológicos e celulares envolvidos na progressão da doença do cancro são também conhecido por regular a expressão celular TRPC6 [16] – [20]. Os factores celulares como a activação do receptor através da membrana TFN-α e Ca
2+ depleção da loja celular envolvida na progressão do cancro têm sido conhecidos por induzir a expressão TRPC6 [16] – [20]. Recentemente papel importante de uma molécula de sinalização ROS na activação TRPC6 é observado [18]. Desde ROS está envolvido em ambos progressão do cancro e da sua regulação, portanto, é importante para identificar o papel da proteína TRPC6 no desenvolvimento da doença do cancro ou regulamento. Estudos recentes têm mostrado que vários fatores pró-apoptóticos, incluindo membros das proteínas da família Bcl-2 e espécies reactivas de oxigénio (ROS) regular o Ca
2 + sensibilidade de ambos o Ca
2 + canais de libertação no ER e mitocôndrias [21]. Além disso não há dados relacionados com a relação entre o supressor tumoral p53 e regulação do cálcio sinalização regulação da transcrição de genes em células de cancro TRPC6 está disponível. É importante identificar a relação entre p53 e seu controle da liberação de cálcio intracelular e o papel desempenhado pelo gene TRPC6 em GAQ células cancerosas
3-tratados. O p53 e TRPC6 induzida desde alterações nas concentrações citosólicas de Ca
2 + pode induzir vias que regulam uma ampla gama de eventos celulares, incluindo aqueles importante na tumorigênese [21] sinalização.
Além disso uma nova relação entre o Ca intracelular
2 + foi observada liberação e p53, onde Ca
2 + libertação estabilizada a ligação da p53 ao seu p300 co-ativador de transcrição e também estabilizou a ligação do complexo de transcrição p53-p300 à p53-DNA no local de ligação do promotor de p53-mínima [22]. Neste trabalho de pesquisa que elucidaram a presença de um cross-talk celular entre p53 e a sinalização de cálcio, onde activa a sinalização de cálcio p53 transcricionalmente [6] e o p53 activa aumentam a libertação de cálcio intracelular por regulação transcricional do promotor do gene TRPC6. Assim, a apoptose dependente de cálcio pode ser mediada por p53, e a sinalização de cálcio pode desempenhar um papel crucial na apoptose mediada por p53. Recentemente papel crucial gene TRPC6 tem mostrado na hipertrofia cardíaca patológica e remodelação em resposta ao stress [23], [24]. Supressão de TRPC6 impede a remodelação cardíaca exagerada induzida por estresse e superexpressão de TRPC6 desenvolver hipertrofia cardíaca espontânea no modelo de ratos, sugerindo no sentido de uma possível ligação entre a expressão TRPC6 e de morte celular e divisão, uma vez que a remodelação cardíaca envolve ambos os processos. TRPC6 expressão também é conhecida por induzir podócitos remodelação do citoesqueleto [25], a diferenciação dos queratinócitos humanos [26], e a diferenciação neuronal no hipocampo [27]. Um papel importante da TRPC6 Também foi descoberto na cicatrização de feridas em que uma tela de todo o genoma TRPC6 identificado importante para a transformação de miofibroblastos e ratinhos suprimido do gene TRPC6 mostrou dérmico danificado e a cicatrização da ferida após a lesão cardíaca. Os relatórios anteriores sugerem para um elo entre a expressão TRPC6 e regulação da célula-divisão e de morte celular processos relacionados, neste relatório que estamos sugerindo um forte papel da TRPC6 como uma proteína pró-apoptótica regulada por p53 no modelo de cancro. Em conclusão, temos aqui elucidado um novo papel de canal de cálcio TRPC6 funcionar como uma proteína de efector a jusante de p53, que induz a apoptose através da regulação dos níveis de cálcio celular em células cancerosas. Esta via parece ser uma estratégia adoptada pela proteína p53 de utilizar a sinalização de cálcio como um pró-apoptótica eficaz anti-cancro significa transcricionalmente por regulação do canal de cálcio TRPC6, assim usando TRPC6 como um possível mecanismo para funcionar como um supressor do tumor.
Informações de Apoio
arquivo S1.
Material suplementar e métodos
doi:. 10.1371 /journal.pone.0071016.s001
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