Abstract

Objetivos

Polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) em sítios de ligação putativos microRNA (miRSNPs) modular a suscetibilidade ao câncer através afetando miRNA vinculativo. Aqui, procurou-se investigar a associação entre miRSNPs eo risco de câncer cervical.

Métodos

Em primeiro lugar, genotipados 41 miRSNPs de 37 genes relacionados com o cancro em 338 pacientes e 334 controles (Estudo 1), e replicadas as associações significativas em 502 pacientes e 600 controles (Estudo 2). Nós testamos os efeitos da miRSNPs sobre a interação microRNA-mRNA por ensaio repórter luciferase.

Resultados

Cinco SNPs exibido associação notável com o risco de câncer do colo do útero no Estudo 1. Só

IL-16

rs1131445 manteve uma associação significativa com o câncer cervical (CT /CC vs. TT, OR ajustado = 1,51,

P

= 0,001) no Estudo 2. Esta associação foi mais evidente nos dados combinados de dois estudos ( OR ajustado = 1,49,

P

= 0,00007). Nós também descobrimos que imita miR-135b interagiu com

IL-16

3′-UTR para reduzir a expressão do gene e que o rs1131445 T à substituição C dentro do sítio de ligação putativo prejudicada a interação de miR-135b com

IL-16

3′-UTR. Um ELISA indicou que o soro IL-16 de pacientes com câncer cervical foi elevada (comparada controles,

P

= 0,001) e correlacionada com o genótipo rs1131445. Os pacientes que realizaram o alelo rs1131445 C apresentaram maior IL-16 no soro do que os não portadores (

P Art 0,001).

Conclusões

Estes resultados suportam a hipótese de que miRSNPs constituir um fator de susceptibilidade para o cancro do colo do útero. rs1131445 afeta

IL-16

expressão por interferir com a função supressora de miR135b e esta variante é significativamente associada com o risco de câncer cervical

Citation:. Mi Y, Wang L, Zong L, M Pei , Lu Q, Huang P (2014) variantes genéticas em microRNA locais-alvo de 37 genes relacionados com cancro seleccionado e o risco de cancro do colo do útero. PLoS ONE 9 (1): e86061. doi: 10.1371 /journal.pone.0086061

editor: Qing-Yi Wei, Cancer Institute, Duke, Estados Unidos da América

Recebido: 02 de novembro de 2013; Aceito: 09 de dezembro de 2013; Publicação: 22 de janeiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Mi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por Xi’an Ciência e Programa de Pesquisa de Tecnologia (Grants XASTR1125), a Fundação de Pesquisa científica para os Retornados ultramarinos estudiosos chineses (Ministério de Educação do Estado) ‘. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses: Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer cervical, o terceiro tipo de câncer mais comum em mulheres [1], é causada principalmente por vírus do papiloma humano (HPV) [2]. Embora as infecções por HPV são prevalentes em mulheres sexualmente ativas, apenas uma minoria de infecções persistem e se desenvolvem em neoplasia epitelial cervical grau 2/3 (CIN 2/3), ou até mesmo câncer cervical [3]. Vários cofactores afectar a transição da infecção inicial para o cancro cervical por HPV, incluindo o estilo de vida, a resposta imune do hospedeiro, e a susceptibilidade genética [4], [5]. Os papéis importantes de fatores genéticos na patogênese do câncer cervical for solicitado pelas conclusões que exposições de câncer cervical um agrupamento familiar significativo e os parentes de primeiro grau de pacientes têm o dobro de risco de desenvolver câncer [6]. Algumas variantes moduladores de risco para o cancro do colo do útero foram identificados por um estudo de associação de genes candidatos. Os genes que estão associados com a susceptibilidade do cancro do colo do útero está envolvido na reparação do ADN, ciclo celular e apoptose, proliferação e diferenciação celular, o sistema antigénio de leucócitos humanos e as respostas imunitárias [7], [8].

Recentes evidências convincentes indica que polimorfismos em microRNA (miRNA) locais de ligação de genes relacionados ao câncer são uma fonte importante que abriga as variantes genéticas causadoras de câncer [9]. miRNA, muitas vezes 19-25 nucleótidos de comprimento RNA não-codificante, liga-se dentro região 3 ‘não traduzida (UTR) de transcrições de genes-alvo para inibir e até mesmo abolir a sua tradução para a proteína. Estima-se que aproximadamente 30% dos genes humanos são regulados por miARNs [10]. Gene desregulamentação é um dos principais mecanismos pelos quais as células podem progredir para o câncer [11]. miARN pode participar na carcinogénese através da regulação pós-transcricional de vários genes relacionados com o cancro, incluindo oncogenes e genes supressores de tumor. A expressão aberrante de miRNAs contribui para a etiologia de vários tipos de cancro, incluindo o cancro do colo do útero [12]. miRNA análise do perfil de câncer cervical revelou que miRs-9, 21, 135b, 146a, 199, 203 e 205 são frequentemente sobre-expressos em tecidos de câncer ou linhas de células [12]. Além disso, o miR-205 actua como um oncogene para promover a proliferação celular e migração de células de cancro cervical humano [13]. Em contraste, o miR-214 tem como alvo directamente o gene GALNT7 para suprimir o crescimento e invasividade de células de cancro cervical por funcionar como um supressor de tumor, um supressor de tumores [14]. A mudança de pares de bases dentro da região da miARN alvo de genes relacionados com o cancro pode destruir ou criar um sítio de ligação ou alterar a afinidade de ligação e de pós-transcricional controlo de ARNm por miARN e, portanto, pode afectar a transformação de células normais em células cancerosas [9].

análise bioinformática identificou muitos SNPs que estão localizados nos locais putativos de ligação de miRNA de genes candidatos câncer e que afetam significativamente a energia de ligação de miRNA putativo :: duplexes de mRNA [15]. Uma pequena fracção delas foram ainda provado para alterar a expressão de genes alvo através do ensaio de repórter de luciferase e exibir uma associação significativa com a susceptibilidade ao cancro [16], [17]. Landi et al. exibido fora 57 SNPs dentro de sites miRNA-ligação de 104 genes candidatos para o cancro colorectal, encontrou oito SNPs deles mostrando vários Gibbs energia livre de ligação entre os dois alelos de cada SNP e, finalmente, demonstrou um SNP, rs17281995, dentro do miRNA-obrigatório locais de CD86, como a variante moduladores de risco para o cancro colorectal [16]. Usando uma estratégia de pesquisa semelhante, SNPs dentro de sites de outros genes importantes candidatos câncer, tais como genes de reparação do ADN [17] vinculativo miRNA, integrina genes [18] e genes caspase [19], também foram identificados e posteriormente avaliada como variantes de susceptibilidade para cancro da bexiga, cancro da mama, cancro colorectal, e cabeça e risco de câncer de pescoço. Recentemente, Shi et al. demonstraram que o alelo G rs11064 dentro do

gene TNFAIP8

enfraquece a afinidade de ligação de miR-22 para o TNFAIP8 3′-UTR e está associada com um risco aumentado de cancro do colo do útero [20], o que sugere que miRNA- locais de ligação também são os pontos quentes que abrigam variantes de susceptibilidade ao câncer do colo do útero.

no presente estudo, buscou-se identificar novas variantes de risco para o cancro do colo do útero entre os sites miRNA-alvo em genes relacionados ao câncer. Ao analisar as bases de dados de literatura e de bioinformática, encontramos 37 genes relacionados com o cancro com variações em sítios de ligação putativos 3′-UTR de miRNA. A força de associação dessas variantes com cancro do colo do útero foi avaliada por um estudo caso-controle de dois estágios. Para a variante associada, a sua influência funcional na regulação da expressão do miRNA-mediada dos genes-alvo foi investigado usando o ensaio de repórter luciferase.

Materiais e Métodos

1 População do estudo

foram recrutados 840 pacientes com câncer cervical dos pacientes que receberam tratamento hospitalar em três hospitais, entre maio de 2008 e abril de 2012. entre eles, 338 indivíduos do Hospital das Liaocheng Pessoas (LCPH) foram usados ​​no estudo de primeiro estágio (estudo 1), que investigou todos dos SNPs seleccionados, e 502 voluntários do primeiro Hospital Filiado de Xi’an Jiaotong University (TFAHXJTU) e materna e Infantil Hospital Saúde da Província de Shaanxi (MCHHSP) foram utilizados em estudo de segunda fase (estudo 2), que foi para replicar o resultados notáveis ​​(

P Art 0,05) do Estudo 1. Todos os pacientes foram diagnosticados por exame histológico da biópsia sob colposcópio e /ou tecidos ressecados. O estágio clínico e tipo histológico de câncer cervical dos pacientes foram coletados de registros médicos e são apresentados na Tabela 1. Um total de 934 controles saudáveis ​​foram recrutados das mulheres que rotineiramente atendidos exame físico nestes três hospitais, 334 indivíduos de LCPH no Estudo 1 e 600 indivíduos de TFAHXJTU e MCHHSP no Estudo 2. Todos os controlos não tinham histórico de doença neoplásica ou associado a um cancro, e eles tiveram citologia cervical normal em pelo menos dois exames anuais consecutivos. Todos os indivíduos foram geneticamente não relacionados, e sua idade, raça, tabagismo, status socioeconômico e estado civil também foram investigados pela leitura de registros médicos ou por meio de entrevistas. Este estudo foi aprovado pelos Comitês de Ética Médica do LCPH, TFAHXJTU e MCHHSP e todos os participantes deram consentimento informado por escrito.

2 seleção Polimorfismo e genotipagem

Estudos anteriores têm sistematicamente rastreados os SNPs em locais de muitos genes relacionados ao câncer de ligação de miRNA. Resumidamente, eles primeiro blindado genes relacionados ao câncer de pesquisas de banco de dados e literatura, e, em seguida, eles identificaram os locais putativos alvo de miRNA nesses genes por algoritmos especializados (como miRBase, Miranda, PicTar e TargetScan) e selecionou os SNPs que residem no sites por pesquisa dbSNP e BLAST miRNA-vinculativo, finalmente, identificar os SNPs cujos alelos fazer a sequência alvo tem diferencial significativamente energia de ligação de miRNA em um modelo preditivo de computador [16], [18]. Porque muitos genes relacionados ao câncer são compartilhados por vários tipos de câncer [21], foram selecionados os SNPs da literatura anterior, que abrange os tópicos sobre o site miRNA de ligação /locais alvo de miRNA, polimorfismos e câncer /tumor. Base de dados MEDLINE /PubMed foi pesquisada para encontrar literatura que foi publicado a partir de janeiro de 2000 a 2013 de janeiro. Nós, finalmente seleccionadas 41 SNPs em sítios de ligação de miRNA previstos no prazo de 37 genes relacionados com o cancro com menores freqüências alélicas superior a 0,1 na população chinesa Han (Tabela 2). O ADN genómico foi extraído de leucócitos de sangue periférico usando o ADN Midi Kit Blood (Omega Biotech, Norcross, EUA), de acordo com o protocolo do fabricante. Os SNPs seleccionados foram genotipados em pacientes e controles usando MALDI-TOF dentro do sistema MassARRAY (Sequenom Inc., San Diego, CA, EUA) [22].

3 HPV genotipagem

HPV Humano de esfregaço raspagem do colo do útero e /ou tecidos ressecados foi genotipados usando o kit de teste de HPV GenoArray (HybriBio Ltd, Guangdong, China). Primeiro, o DNA do HPV foi amplificado com o L1 primers consenso HPV MY09 /MY11 e HMB01. Em seguida, o produto de PCR processados ​​de hibridação de fluxo na forma de um formato macroarranjo com uma membrana de nylon sobre a qual HPV sondas oligonucleotídicas específicas de genótipo foram imobilizadas. Esta técnica pode identificar 21 genótipos de HPV, dos quais 5 tipos de baixo risco (6, 11, 42, 43 e 44), 14 tipos de alto risco (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52 , 56, 58, 59, 66 e 68), e 2 tipos de risco intermediário (CP8304 e 53).

4 soro IL-16 níveis

O sangue dos pacientes e dos controles ‘ As amostras foram colhidas entre 8 e 10 am Os soros foram centrifugados a 3000 rpm durante 10 min e congelado a -80 ° C. O soro de IL-16 foram medidos por kits disponíveis comercialmente com enzimas ligadas ensaio imunoabsorvente (ELISA) (Pierce Endogen) de acordo com as instruções do fabricante. O nível mínimo de detecção para a IL-16 foi de 0,10 pg /ml. Não se observou-detecção cruzada de outras citocinas. A variação intra-ensaio foi . 10%

cultura

5 celular

linhas celulares de cancro cervical humano, HeLa [23] e SiHa [24], foram adquiridos a partir Type Culture Collection of da Academia chinesa de Ciências (Xangai, China). Estas células foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado com 100 U /ml de penicilina, 100 mg /mL de estreptomicina, e soro fetal bovino a 10% e foram cultivadas a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de dióxido de carbono.

6 as transfecções transientes e ensaios de luciferase

a 3’UTR do ARNm da IL-6, incluindo o alelo C ou alelo T do rs1131445, foram amplificados utilizando os iniciadores de 5′-TGGCCTGGGCCTCCTCACAA-3 ‘(para a frente) e 5’CTCCACCACCCTTCCCTA -3 ‘(reverso). Os fragmentos amplificados foram então clonados no jusante do gene da luciferase do pirilampo no vector pGL3-basic (Promega, Madison, EUA). Estes plasmídeos de recombinação foram sequenciados para confirmar a sua exactidão. Para os ensaios de repórter de luciferase, HeLa e SiHa foi plaqueada em placas de 24 poços para ser co-transfectadas com 100 ng de pGL3-C ou pGL3-T constrói, 50 pmol /mL de quimicamente sintetizados miARNs miR-135b (GenePharma, Xangai, China) ou miARN de controlo negativo utilizando Lipofectamina 2000 reagente de transfecção (Invitrogen, Carlsbad, EUA). Em cada transfecção, 20 ng de plasmídeo pRL-TK (Promega, Madison, EUA) foi utilizado para corrigir a eficiência de transfecção. Cada transfecção foi realizada em triplicado. As células foram recolhidas 48 horas após a transfecção, e a actividade da luciferase foi medida com um sistema de ensaio de repórter de luciferase dupla (Promega, Madison, EUA) e normalizados contra a actividade do gene da luciferase de Renilla.

7. A análise estatística

Nós calculamos o poder como descrito anteriormente [25]. A χ

2 teste foi realizado para fazer uma comparação das variáveis ​​categóricas, incluindo a frequência do genótipo e algumas características demográficas. teste t de Student, de Mann-Whitney U-test ou análise de variância foram realizados para comparar as variáveis ​​contínuas, tais como a idade, o soro de IL-16 e nível de nível de expressão repórter, quando apropriado. As associações entre a IL-16

variantes eo risco de câncer cervical foram estimados

computando as RUP e os seus ICs de 95% de regressão logística multivariada com um ajuste para a idade, índice de massa corporal, tabagismo e da família histórico de câncer. Para evitar uma associação espúria causada por vários testes, a probabilidade de falsos positivos relatório (FPRP) foi calculada de acordo com o método descrito por Wacholder et ai. [26]. Montamos 0,2 como um limiar FPRP e atribuída uma probabilidade anterior de 0,01 para detectar uma OR de 1,50 (para os efeitos de risco) ou 0,67 (para os efeitos protetores) para uma associação com os SNPs ou características clínico-demográficas. O equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW) dos SNPs entre os controlos foi avaliada pelo χ

2 teste. Todas as análises estatísticas foram realizadas por SPSS (versão 13.0, Chicago, IL, EUA). Um valor de

P

. 0,05 foi considerado significativo (bicaudal)

Resultados

1 Características da população

Foram analisados ​​por completo 840 pacientes com câncer cervical e 934 controles em Estudos 1 e 2. as características demográficas e clínicas dos pacientes e controles são apresentados na Tabela 1. não houve diferença significativa na distribuição da idade, raça, status, nível educacional e civil fumar status entre os controles e os casos no Estudo 1, Estudo 2 e todos os assuntos combinados. No entanto, os casos eram mais propensos a ser mais jovens na idade ao primeiro parto (

P

= 0,038) e com a infecção pelo HPV (

P Art 0,001) do que os controles. infecção pelo HPV ainda permaneceu significativamente associada com o câncer do colo do útero depois de considerar o FPRP que era inferior a 0,2. Estas duas variáveis ​​foram ajustado para qualquer efeito de confusão residual na regressão logística multivariada análises posteriores.

2 Associação de SNPs dentro de sites de genes relacionados ao câncer com risco de câncer cervical

miRNA de ligação

Mais de 99% das amostras foram genotipados com sucesso para cada SNP, e a experiência para replicar os seleccionados aleatoriamente 300 amostras adquiridas de dados de genótipos completamente consistentes com a análise inicial. A Tabela 2 mostra a lista de SNPs seleccionados dentro dos locais de ligação de miRNA em 3′-UTR de 37 genes relacionados com o cancro, o miRNA vinculativo que potencialmente afetam e suas freqüências genotípicas e associações com câncer cervical no Estudo 1. Todos as distribuições genotípicas observadas entre os controles de Estudo 1 foram em linha com a HWE. Entre os 41 SNPs que foram incluídas no Estudo 1, cinco SNPs (rs465646 em

REV3L

gene, rs2239680 no

BIRC5

gene, rs1476215 no

FGF2

gene, rs3213180 em

E2F1

gene, rs1131445 no

IL 16

gene) exibiu uma distribuição genotípica marcadamente diferentes entre os casos de câncer cervical e os controles (

P

= 0.003~0.030). Para determinar se verdadeiras associações significativas existia ou se houve resultados espúrios, foi realizada uma réplica para analisar esses SNPs em outra população que reside na província de Shaan Xi do Norte da China. No Estudo 2, as suas frequências do genótipo observadas também foram consistentes com EHW (Tabela 3). Além disso, descobrimos que só

IL-16

rs1131445 continuou a mostrar uma associação significativa com o câncer cervical. Os indivíduos com a sua TC ou CC alelo tiveram um risco aumentado para o câncer cervical (OR ajustado = 1,51, 95% CI 1,18-1,93,

P

= 0,001) com um ajuste para idade, tabagismo, nível educacional, idade em primiparidade, estado civil e estado de infecção pelo HPV. A associação entre rs1131445 e câncer cervical foi mais significativo nos dados que combinada Estudo 1 e 2 (OR ajustado = 1,49, 95% CI 1,22-1,81,

P

= 0,00007) com ajuste para as variáveis ​​acima mencionadas. Nós, então, calculados os valores FPRP para todas as associações significativas observadas. Quando a suposição de probabilidade anterior foi de 0,01, a associação com o

IL-16

rs1131445 (TC /CC vs.TT) ainda era notável em ambos Estudo 1 sujeitos (FPRP = 0,171) e todos os assuntos (FPRP = 0,011). Dado um OR de 1,5 em uma nominal

P

= 0,05 para freqüências genotípicas que variam de 0,20 a 0,40, o poder estatístico do estudo para detectar uma associação de cada SNP com câncer cervical no Estudo 2 e combinado Estudo 1 e 2 foi estimado em 81,0-91,5% e 95,0-98,9%, respectivamente. A análise não revelou estratificação de uma interacção significativa das características clínicas e demográficas e do genótipo rs1131445 no risco de cancro do colo do útero (dados não mostrados). Além disso, não houve correlações significativas entre os genótipos de rs1131445 eo estágio clínico e tipo histológico de câncer do colo do útero (dados não mostrados).

3 Serum IL-16 nível e sua correlação com o

IL-16

rs1131445 genótipo

Dada a associação notável observada entre o rs1131445 eo risco de câncer do colo do útero, investigamos ainda mais os séricos de IL-16 níveis em controles e pacientes com câncer cervical, bem como o potencial de regulamentação efeitos do genótipo rs1131445 na produção de IL-16 no soro. Foram selecionados 100 pacientes com cancro do colo do útero e 80 controles dos temas de estudo 2 e analisou seus níveis de soro de IL-16 por ELISA. A IL-16 de pacientes com câncer cervical soro aumentou significativamente em comparação com os controles (

P

= 0,001, Figura 1A). Além disso, em pacientes com câncer cervical, houve uma correlação significativa entre o soro de IL-16 e rs1131445 genótipo (

P

= 0,001). Os pacientes portadores do alelo rs1131445 C tiveram maior IL-16 do que os não-portadores de soro (

P Art 0,05, Figura 1B). Além disso, não se observa qualquer associação estatisticamente significativa de IL-16 no soro com o estágio clínico e tipo histológico do câncer cervical (dados não mostrados).

A. Soro IL-16 níveis em controles e pacientes com câncer de colo uterino, como medido por ELISA. B. Correlações de soro IL-16 níveis com genótipo em controles e pacientes. Os dados foram expressos como a média ± SEM. *

P Art 0,05 vs. controles grupo. +

P Art 0,05 vs. pacientes com genótipo TT

4 O efeito da rs1131445 na interação entre miR-135b e

IL-16

3. ‘-UTR

Um sítio de ligação putativo dentro da 3’UTR do

IL-16 Compra de miR-135b foi identificado usando miRBase, Miranda e software PicTar. Também se previu-se que a substituição do T para o alelo C em rs1131445 poderia diminuir a ligação de energia livre de Gibbs da miARN-ARNm por 3,93 kJ /mol [16], o que sugere que este SNP poderia afectar o

IL-16

expressão de genes, alterando a afinidade de ligação de miARN-ARNm (Figura 2A). Para testar esta hipótese, um ensaio de luciferase foi realizada em linhas celulares de cancro do colo do útero HeLa e SiHa, as quais transfectadas com o pGL3-C-alelo ou construções de pGL3-alelo T acompanhada por sintetizados quimicamente miARNs miR-135b ou um controlo negativo miARN ( A Figura 2A). Para ambas as construções, na presença de imita o miR-135B, a expressão da luciferase foi significativamente reduzida (Figura 2B-C), o que confirma a potencial interacção funcional da miARN-ARNm. Em contraste, os miARN de controlo negativo sem predição local de ligação no

IL-16

3′-UTR não tem efeito sobre a expressão da luciferase (Figura 2B-C). Além disso, verificou-se que o alelo C resultou em um aumento modesto, mas estatisticamente significativo da expressão de luciferase em comparação com a do alelo T (Figura 2B-C).

. Esquema de

IL-16

3′-UTR abrigando um local putativo de ligação de miR-135b, a posição de rs1131445, e o constructo de pGL3-IL-16-3′-UTR-T /C. B e a actividade da luciferase Relativa C na presença de miR-135b ou o controlo negativo miARN é mostrado para o

IL-16

3′-UTR com o alelo T e o alelo C na HeLa (B) e SiHa (C) células cancerosas; os dados são apresentados como a percentagem em relação à actividade de luciferase das culas transfectadas com o alelo e T CN; a barra de erro representa s.e. a partir de três experiências independentes; *

P Art 0,05, **

P Art 0,05, ***

P Art 0,01. NC representa o controle negativo.

Discussão

No presente estudo, nós analisamos a uma variante suscetibilidade ao câncer do colo do útero a partir do site miRNA-ligação SNPs no prazo de 37 genes relacionados com o cancro por um estudo de duas fases. Verificou-se que o alelo SNP rs1131445 C na 3′-UTR de

IL-16

foi associada a um risco aumentado de cancro do colo do útero. Usando um ensaio de luciferase, descobrimos que miARN-135b diminuiu marcadamente a expressão de luciferase de pGL3-IL-16-3′-UTR constrói nas linhas celulares de cancro do colo do útero HeLa e SiHa. Mais importante, estes efeitos inibidores de miARN-135b foram enfraquecidos pela substituição do T para o alelo C em rs1131445. Estes resultados suportam a hipótese de que as variações nos locais putativos alvo de miRNA poderiam constituir um factor de susceptibilidade para o cancro do colo do útero.

IL-16 é sintetizado por várias células do sistema imunológico e parênquima, incluindo CD4 e células T CD8, eosinófilos, células dendríticas /macrófagos, mastócitos, epitélio brônquico, e fibroblastos [27]. A proteína traduzida a partir directamente

IL-16

ARNm é uma molécula precursora e tem de ser clivada em dois fragmentos de caspase-3. O clivado bioactivo IL-16 é libertado após a estimulação pela histamina ou serotonina e actua como um factor quimioatractor para regular a resposta inflamatória [27]. Recentemente, a IL-16 tem sido reconhecida como um importante factor de promoção de tumores [28], [29], [30], [31]. A produção de IL-16 correlaciona-se com o aparecimento e progressão de vários cancros hematopoiéticos e cancros sólidos [28]. A expressão constitutiva de IL-16 também foi encontrada para regular positivamente em gliomas [29] e o cancro da próstata [31]. Além disso, a sua expressão em tecido de cancro da próstata foi correlacionada com a agressividade do tumor e recaída bioquímica da doença [31]. O soro de IL-16 de nível de elevação tem sido observado em vários cancros [32], [33]. O soro de IL-16 é um preditor para o desenvolvimento de metástases distantes do cancro da mama [32]. Além disso, no cancro da mama, a supra-regulação de IL-16 segregada aumenta a infiltração de monócitos no tecido tumoral [30].

Os papéis de IL-16 em fisiopatologia do cancro do colo do útero, em grande parte permanecem pouco claras. Nossos resultados de soro de IL-16 altitude seguintes carcinogênese cervical ea associação notável do

IL-16

com o risco de câncer cervical sugerem que a IL-16 poderia regular carcinogênese cervical. Esta hipótese é apoiada pelos efeitos cancerígenos de inflamação persistente no colo do útero. infiltração de células imunes em tumores é um determinante crítico para a carcinogênese cervical [30], [34]. O macrófago infiltrando em aumentos de Colo do Útero linearmente com a progressão da doença cervical, de colo normal, baixo grau de lesão intraepitelial escamosa de alto grau, para câncer invasivo [35]. macrófagos associados a tumores contribuem para a progressão do tumor, exercendo as suas múltiplas funções na proliferação de células de tumor, invasão de células de tumor, angiogénese de tumor e [36]. Além de macrófagos, células CD4

+ células T reguladoras podem contribuir para a carcinogênese e limitando a eficácia da resposta imunitária das células T contra o câncer [37]. No cancro cervical, o HPV-specific CD4

+ células T suprimir citocina (IFN-γ, IL-2) produção de interferir com a resposta imunitária anti-tumoral [38]. IL-16 pode ser expressa por células epiteliais em condições inflamatórias [39] e serve para chemoattract monocyptes /macrófagos e células T CD4

+ para o local da infecção [40]. Além disso, a IL-16 secretada estimula monocyptes /macrófagos para produzir várias citoquinas pró-inflamatórias [41]. Portanto, é plausível que a supra-regulação de IL-16 na inflamação induzida pelo HPV pode promover a carcinogénese pela hiperfunção de macrófagos, específico de HPV-CD4

+, células T ou outras células inflamatórias.

Aqui, nós fornecemos a primeira evidência de que rs1131445 no sítio de ligação de miR-135b de

IL-16

3′-UTR, que pode afetar a expressão da proteína IL-16, por interferir com a função supressora miR135b, foi significativamente associada com o risco de câncer cervical. Um ensaio funcional in vitro indicaram que a transfecção de células HeLa e SiHa transportando o

IL-16

3′-UTR com miR-135b imitar reduz significativamente a expressão da luciferase, o que sugere que a IL-16 pode ser orientada por miR-135b. O rs1131445 T para a mudança C inibe a interação de miR-135b com

IL-16

3′-UTR e regula positivamente a sua expressão. Consistente com esta especulação, a análise in vivo revelaram que os pacientes que carregam o alelo rs1131445 C teve um soro maior IL-16 do que os não-portadores, o que levou a uma IL-16 sérica elevada de pacientes em comparação com controles saudáveis. A sobre-regulação de miR-135b foi encontrado no cancro do colo do útero [42], que poderia inibir a expressão de

IL-16

por sua segmentação 3′-UTR. O alelo rs1131445 C prejudica a ligação de miR-135b para o alvo e conduz a uma maior expressão constitutiva de

IL-16

e subsequente libertação para soro. Dadas as funções reguladoras importantes da libertação de IL-16 na resposta imune e a consequente nível do microambiente inflamatório local, os indivíduos que transportam o alelo rs3134615 C seria de esperar que têm risco elevado de cancro do colo do útero. Em conclusão, nossos dados sugerem que rs1131445, como uma variante funcional, pode modular o risco individual de câncer cervical provavelmente através da desregulamentação da regulação pós-transcricional de miRNA-135b em

IL-16

expressão. Embora nosso estudo usou números razoáveis ​​de pacientes e controles e métodos estatísticos rigorosos, não poderíamos descartar por completo a possibilidade de que os resultados espúrios emergiu de nosso projeto estudo de associação de caso-controle, devido ao acaso ou estratificação populacional. Portanto, um estudo mais aprofundado de replicação em larga escala utilizando diferentes populações étnicas, ou análise baseada em família, ou desenho de coorte prospectivo é necessário para produzir resultados muito conclusivos. análises funcionais adicionais também são necessários para esclarecer os papéis exatos de IL-16 na gênese do câncer do colo do útero e progressão no futuro.

Reconhecimentos

Agradecemos profundamente todos os pacientes e voluntários para participar em este estudo.