Abstract

usando tecnologias de sequenciamento de profundidade pode conduzir a descoberta de novas vias de cancro regulados por miARNs supressores oncogénicos e /ou tumorais. Foi determinada a assinatura de expressão miRNA do genoma no cancro da bexiga (BC) por tecnologia de sequenciamento de profundidade. Um total de dez pequenas bibliotecas de RNA foram sequenciados (cinco BCs e cinco amostras de histologicamente normal da bexiga epitélio (NBE)), e 13.190.619 para 18.559.060 RNA pequeno limpo leituras foram obtidas. Um total de 933 miARNs conhecidos e novos candidatos de miARN 17 foram detectados nesta análise. Entre os miRNAs conhecidos, um total de 60 miRNAs foram significativamente regulada negativamente em BC comparação com NBE. Nós também descobrimos que vários miRNAs, tais como

miR-1 /133a

,

miR-206 /133b

,

deixe-7c /miR-99a

,

miR-143/145 Comprar e

miR-195/497

, foram localizados próximos uns aos cinco loci distintos e constituiu miRNAs em cluster. Entre estes miRNAs em cluster, nós nos concentramos no

miR-195/497

cluster porque este miRNA agrupado não tinha sido analisado em BC. Transfecção de madura

miR-195

ou

miR-497

em duas linhas de células BC (menino e T24) proliferação de células cancerígenas inibiu significativamente, migração e invasão, sugerindo que o

miR- 195/497

conjunto funcionou como supressores de tumor em BC. Em relação aos genes alvo do

miR-195/497

cluster, o algoritmo TargetScan mostrou que 6.730 genes foram putativo

miR-195/497

alvos, e 113 significativamente enriquecida vias de sinalização foram identificados em esta análise. A categoria “Pathways no câncer” foi o mais enriquecido, envolvendo 104 genes alvo candidato. dados de expressão gênica revelaram que 27 de 104 genes alvo candidato foram realmente regulada em amostras clínicas BC. Luciferase ensaios repórter e Western blot demonstrou que

BIRC5

e

Wnt7a

foram directamente visados ​​pela

miR-195/497

. Em conclusão, a expressão aberrante de miRNAs em cluster foi identificado por sequenciação de profundidade, e downregulation de

miR-195/497

contribuiu para a progressão BC e metástase. vias cancerosas do tumor supressora miRNA-mediadas fornecer novos insights sobre os potenciais mecanismos de oncogênese BC

Citation:. Itesako T, Seki N, Yoshino H, Chiyomaru T, Yamasaki T, Hidaka H, ​​et al. (2014) O MicroRNA Expressão Assinatura do cancro de bexiga por Sequenciação Deep: o significado funcional do

miR-195/497

Cluster. PLoS ONE 9 (2): e84311. doi: 10.1371 /journal.pone.0084311

editor: Bernard W. Futscher, da Universidade do Arizona, Estados Unidos da América

Recebido: 02 de abril de 2013; Aceito: 13 de novembro de 2013; Publicação: 10 de fevereiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Itesako et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi parcialmente financiado pelo Ministério da Educação, Ciência, Desporto e Cultura Grants-in-Aid para a Investigação científica (C), 23.501.298 e 23.592.340, 2011. Nenhum financiamento externo adicional recebida para este estudo. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

nos países desenvolvidos, o cancro da bexiga (BC) é o quinto tumor mais comumente diagnosticado ea segunda causa mais comum de morte em pacientes com neoplasias do trato geniturinário. Nos Estados Unidos, existem mais de 73.000 casos novos e 14.000 mortes por ano [1]. No Japão, o número de novos pacientes BC foi estimado em 17.461 em 2007 e o número de mortes foi estimado em 7.008 em 2011 [2].

BCs podem ser classificados em duas categorias, tumores não-invasivos musculares e tumor de músculo-invasiva. Apesar de 70% -80% dos pacientes são diagnosticados com tumores não-invasiva do músculo, altas taxas de recorrência (50% -70%) são observadas nestes pacientes. Além disso, entre os casos recorrentes, 15% de BCS progridem para doença invasiva do músculo-[3]. A taxa de sobrevivência de cinco anos para pacientes com BC-não-músculo invasivo está perto de 90%, enquanto que a de pacientes com BC músculo-invasivo é de aproximadamente 60% [4]. Além disso, quase 80% dos pacientes com metástases linfáticas morrer nos primeiros cinco anos [5]. Como a maioria dos ensaios clínicos de quimioterápicos avançada BC têm mostrado benefícios limitados, novos marcadores prognósticos e estratégias de tratamento eficazes com base em análises atuais do cancro do genoma são necessárias.

A descoberta de RNA não-codificantes do genoma humano era um importante avanço conceitual na era pós-genômica sequenciamento [6]. Melhor compreensão da RNA não-codificante é necessário para o progresso continuado na pesquisa do câncer. miARNs constituem uma classe de pequenas moléculas não codificantes de ARN, 19-22 nucleótidos de comprimento, que modulam a expressão do gene. A regulagem é obtida através de emparelhamento imperfeito com ARN mensageiro (ARNm alvo) de genes codificadores de proteínas e regulação da transcrição ou pós-transcricional da sua expressão [7]. Atualmente, 2.042 miRNAs maduros humanos são registrados na miRBase liberar 20,0 [https://microrna.sanger.ac.uk/]. Um corpo crescente de provas indica que miARNs também contribuir para a iniciação, o desenvolvimento e a metástase de vários tipos de cancros. Muitos cancros humanos mostram a expressão aberrante de miARNs que pode funcionar como supressores de tumores ou oncogenes [8]. Portanto, a identificação de miRNAs expressão aberrante é o primeiro passo para elucidar vias oncogênicas miRNA-mediadas em cancros humanos.

O desenvolvimento de high-throughput, tecnologia de sequenciamento de profundidade tem informações romance rapidamente descoberto sobre miRNAs. análise de sequenciação profunda parece ser superior ao microarray- ou métodos que estão limitados a miRNAs conhecidos e geralmente não contêm a lista completa de sequências de miRNAs conhecidos baseados em PCR. análise de sequenciação profunda se tornará o método padrão ouro para análise miRNA abrangente em genômica do câncer. miARN assinaturas de expressão de BC, obtidos por tecnologia de sequenciação profunda levaram a quatro publicações recentes [9] – [12] e deste estudo constitui o quinto relatório. Um total de dez pequenas bibliotecas de RNA foram sequenciados (cinco carcinomas da bexiga e cinco combinado, amostras histologicamente normais de urothelia), levando a 13.190.619 para 18.559.060 pequeno RNA limpo lê nesta análise. Detectamos 933 miRNAs conhecidos e 17 novos candidatos miRNA em nossa série de amostras.

Alguns miRNAs estão localizados em estreita proximidade um do outro sobre o genoma humano e, portanto, são chamados de miRNAs em cluster. No genoma humano, 247 miARNs humanos foram encontrados para ser agrupado em 64 locais a distâncias inter-miARN menos do que 5000 pb [13]. O

miR-15a /16

cluster, por exemplo, é bem conhecido por atuar como um supressor tumoral, segmentando vários oncogenes, incluindo

BCL2

,

MCL1

,

CCND1

e

Wnt3a

[14] – [16], enquanto que o

miR-17/92

cluster é reconhecido como um oncogene [17]. Nós relatado anteriormente que

miR-1-1 /133a-2 Comprar e

miR-1-2 /133a-1

clusters formados em diferentes loci cromossómico no genoma humano, 20q13.33 e 18q11.2, respectivamente, e esses aglomerados funcionar como supressores de tumor, tendo como alvo vários oncogenes em cancros humanos, incluindo BC [18] – [24]. O

miR-143/145

conjunto está localizado no locus de 5q32 e foi também relatado como um cluster de miARN supressor tumoral em BC [25] – [28]. Foram selecionados 60 miRNAs regulados negativamente na assinatura BC e investigadas sua loci cromossómico. Curiosamente, entre os 60 miRNAs, descobrimos que vários clusters formados, tais como

miR-1 /133a

,

miR-206 /133b

,

deixe-7c /miR-99a

,

miR-143/145 Comprar e

miR-195/497

.

neste estudo, a hipótese de que o

miR-195/497

conjunto funcionou como um supressor de tumor através de segmentação de vários genes oncogénicos envolvidos nas vias relacionadas ao câncer específicos no BC. Com base nesta hipótese, realizamos estudos de ganho de função em microRNAs transfectantes e também tentaram identificar romance

miR-195/497

alvos moleculares mediada por fragmentação e as vias pelas

in silico

análise . Compreender o papel dos miRNAs irá fornecer uma estratégia eficaz e promissora para terapias baseadas em evidências miRNA-associados para o tratamento do BC.

Resultados

O sequenciamento e anotação de pequenos RNAs

Dez bibliotecas de ARN pequenas (de cinco BCs e cinco SENV) foram sequenciados usando tecnologia de sequenciamento de profundidade. As características dos pacientes são mostradas na Tabela 1. Inicialmente, 13.905.124 a 18.938.856 sequência cru leituras foram produzidos para as bibliotecas. Depois de se filtrar e de recorte das leituras de baixa qualidade e adaptadores, a partir de 13.190.619 a 18.559.060 de RNA limpo pequeno leituras foram obtidos (Tabela 2). A distribuição de comprimentos de nucleótidos de RNA limpo pequeno lê variou de 16 a 38 nucleótidos em cada biblioteca. O comprimento mais abundante foi de 22 nucleótidos (Figura S1). Toda a limpeza de alta qualidade lê maior do que 18 nucleótidos foram mapeados para o genoma humano e estas leituras foram divididos em diferentes categorias de pequenos RNAs de acordo com sua biogênese e anotação (Tabela 3) pareados por genoma. Ambos os BCs e SENV continha espécies múltiplas e pequenos RNAs heterogéneos que incluem miARN, fragmentos de degradação de RNAs não-codificantes (ARNt, ARNr, snRNA, snoRNA, etc), repetições genómicas, mRNAs, ou RNAs não classificados. A categoria de ARN mais abundante de cada biblioteca era miARN. Os dados da sequência deste estudo foram depositados em DDBJ Sequence Leia Archive (número de acesso; DRA001043)

Identificação de miRNAs reprimidos com base em miRNA assinaturas de BC expressão

Separamos as sequências de leitura limpas de alta qualidade em cada biblioteca em duas categorias, os miRNAs ou RNAs não-codificantes usando dados NCBI GenBank, dados Rfam e miRBase. Neste estudo, um total de 933 miARNs conhecidos e novos candidatos 17 miARNs foram detectados a partir de sequências de leitura limpa e de alta qualidade (Tabelas S1 e S2). Os níveis das novas candidatos miARN expressão foram baixos e os papéis funcionais não foram avaliadas suficiente (Tabela S2). Por estas razões, nós os excluiu da análise. No entanto, o significado funcional destes novos candidatos de miARN é importante e que irão ser estudados no futuro. Aqui, nós nos concentramos sobre os 933 miRNAs conhecidos e estabeleceu a assinatura de expressão miRNA do BC por sequenciamento de profundidade. Diferencialmente expressos miARNs foram identificadas utilizando o programa facetadora com um modelo linear geral. Um total de 60 miRNAs reprimidos foram selecionados para esta análise (Tabela 4).

Em seguida, mapeamos os miRNAs regulados negativamente no genoma humano e encontrou vários miRNAs que estavam juntos e foram chamados de miRNAs em cluster, tais como

miR-1 /133a, miR-206 /133b, deixe-7c /miR-99a, miR-143/145 Comprar e

miR-195/497

(Tabela 5). Porque o papel do

miR-195/497

aglomerado não havia sido relatado em BC, nós nos concentramos em que para estudos posteriores. Como mostrado na Figura 1,

miR-195

e

miR-497

estão localizados dentro da região do mesmo cromossómico (17p13.1), 209 pb para além.

miR-195 Comprar e

miR-497

estão em um intrão do

gene MIR497HG

em 17q13.1 cromossomo humano, onde são separados por 209 pb.

os níveis de expressão de

miR-195

e

miR-497

em amostras clínicas

Para validar os níveis de

miR- expressão 195 Comprar e

miR-497

em amostras clínicas, nós submetido 29 BCs e 20 SENV para deter-circuito RT-PCR. Descobrimos que os níveis de expressão

miR-195 Comprar e

miR-497

em BCs foram significativamente menores do que aqueles em SENV (

miR-195

: 0,083 ± 0,078 e 1,367 ± 1,178, P 0,0001;

miR-497

: 0,056 ± 0,058 e 1,928 ± 2,425, P 0,0001) (Figura 2A, B). Curiosamente o coeficiente de correlação de Spearman obtidos com o teste de classificação revelou uma correlação positiva entre os níveis de expressão de

miR-195

e

miR-497

nas amostras clínicas (r = 0,984, P 0,0001) (Figura 2C).

A, B) A expressão de

miR-195 Comprar e

miR-497

foi significativamente menor em 20 espécimes clínicos BC do que em 29 espécimes não cancerosas adjacentes.

RNU48

foi utilizado como controle interno. *, P 0,0001. C) correlação positiva entre os padrões de expressão de miRNA de

miR-195 Comprar e

miR-497

(rank de Spearman coeficiente de correlação r = 0,984, P . 0,0001)

Efeito da

miR-195 Comprar e

miR-497

transfections sobre a proliferação celular, invasão e atividades de migração de linhas celulares BC

Para investigar os papéis funcionais de estes miRNAs, foram realizados estudos de ganho de função utilizando transfectantes de miRNA. O ensaio XTT mostraram inibição significativa da proliferação celular em

miR-195 Comprar e

miR-497

transfectantes (BOY e T24) em comparação com os transfectantes miR-controle (porcentagem de viabilidade celular para o menino : 61,7 ± 1,4, 59,1 ± 0,9, e 100,0 ± 2,2, respectivamente, P 0,0001; e, para T24: 66,0 ± 0,9, 67,7 ± 1,2, e 100,0 ± 2,8, respectivamente, P 0,0001) (Figura 3A). O ensaio de Matrigel invasão demonstrou que o número de células invasoras foram significativamente menores em ambos os

miR-195-

e

miR-497

Menino -transfected e células T24 linhas em comparação com os controles (percentagem de células invasão para o menino: 8,7 ± 3,1, 13,4 ± 1,7 e 100 ± 12,3, respectivamente, cada P 0,0001; e, por T24: 64,7 ± 16,2, 36,5 ± 7,5, e 100 ± 18,7, respectivamente, P = 0,009 para o

miR-195

transfectante vs. controlo, P 0,0001 para o

miR-497

transfectante controle vs.) (Figura 3B). O ensaio de cicatrização de feridas demonstraram significativa inibição da migração celular em ambos os

miR-195-

e

miR-497

células menino e T24 -transfected em comparação com os controles (porcentagem de fechamento da ferida para o menino : 51,2 ± 15,5, 43,9 ± 8,3 e 100 ± 28.7, respectivamente, cada P 0,0001; e para T24: 70,1 ± 11,4, 72,3 ± 18,8, e 100 ± 12.6, respectivamente, cada P 0,0001) (Figura 3C).

ganho de função estudos foram realizados usando

miR-195

e

miR-497

-transfected menino e T24 em comparação com os transfectantes miR-controle. A) A proliferação celular determinada pelo ensaio de XTT. B) A atividade celular invasão demonstrada pelo ensaio de invasão de Matrigel. C) a actividade de migração celular determinada pelo ensaio de cicatrização da ferida. *, P 0,0001; **, P = 0,009.

genes alvo previsto e vias de câncer do

miR-195/497

conjunto

Para explorar as funções biológicas do

miR-195/497

cluster, realizamos

in silico

análises usando dois algoritmos independentes, TargetScan e GeneCodis3 e dados de expressão microarray pública aprovados pela GEO. O fluxo de trabalho para

in silico

análise é mostrado na Figura 4. No início, o banco de dados TargetScan indicou que 6.730 genes foram previstas metas do

miR-195/497

cluster, que partilhavam o mesmo sequência de semente ‘GCUGCU’ nas suas regiões 3 ‘não traduzida (3’UTR).

Um total de 6730 genes foram identificadas pelo algoritmo TargetScan. Em seguida, 113 vias de sinalização significativamente enriquecidos foram identificados usando os programas KEGG e GeneCodis3. Entre eles, o topo 21 vias enriquecidos são mostrados na Tabela S3. Os níveis de expressão de genes em 104 via o topo enriquecido (Acesso no cancro) foram finalmente avaliado. Entre eles, 27 genes alvo putativos foram upregulated em amostras clínicas BC com base em dados de banco de dados GEO expressão (números de acesso; GSE11783 e GSE31684). (Tabela S4)

Com base na classificação via KEGG, estes genes foram implicados em 113 vias, e “Pathways em câncer” foi o mais significativamente enriquecido (Tabela S3). Um total de 104 genes foram envolvidos nesta via. Foram pesquisados ​​os oncogenes visados ​​pelas

miR-195/497

cluster baseado na hipótese de que oncogenes putativos seria regulada em amostras clínicas devido à regulação baixa de supressor de tumor

miR-195/497

miRNAs . Por meio de análise de banco de dados GEO, 27 genes foram selecionados como

miR-195/497

-regulated genes oncogénicos em BC (Figura 5 e Tabela S4). Para confirmar esta análise, foram selecionados os dois principais genes regulados positivamente (

BIRC5

e

Wnt7a

), e validado se esses miRNAs foram regulados pelo

miR-195/497

( abaixo).

mapa de calor diagrama mostra a expressão de genes 27 candidatos envolvidos em “Caminhos do câncer” em 90 espécimes BC e seis amostras da bexiga não cancerosas adjacentes.

BIRC5 Comprar e

Wnt7a

foram diretamente regulados pelo

miR-195/497

aglomerado em células BC

o mRNA e proteína níveis de expressão

BIRC5

e

Wnt7a

foram reprimidos em

miR-195-

e

miR-497-

transfectadas células menino e T24 em comparação com transfectantes de controlo (Figura 6A, B).

A)

BIRC5

e

Wnt7a

mRNA expressão 72 h após transfecção com o

miR-195

,

miR-497

, eo miR-controle.

GUSB

expressão foi utilizada para a normalização. B)

BIRC5

e

expressão Wnt7a

proteína 72 h após transfecção com o

miR-195

,

miR-497

, eo miR-controle.

GAPDH

foi utilizado como um controlo de carga. A proporção de

BIRC5

ou

Wnt7a

para

GAPDH

expressão foi avaliada usando software ImageJ (ver 1.43;. https://rsbweb.nih.gov/ij/index .html). * P . 0,01

Nós próxima realizados ensaios de repórter de luciferase para determinar se

BIRC5

e

Wnt7a

mRNAs teve sítios-alvo funcionais para

miR-195 Comprar e

miR-497

em BC. Foi utilizado um vector que codifica os 3-‘UTRs de

BIRC5

e

Wnt7a

mRNAs, incluindo locais alvo putativos para

miR-195 Comprar e

miR-497

(posições 198-204 e 197-203, respectivamente; Tabela S5). Descobrimos que a intensidade luminescente foi significativamente reduzida na presença do local alvo de

BRIC5

pelo

miR-195-

e

miR-497-

transfectantes (Figura 7A ). Obtivemos o mesmo resultado com um ensaio de repórter luciferase para o

Wnt7a

gene (Figura 7B). Estes dados sugerem que o

miR-195 Comprar e

miR-497

vinculado diretamente para sites específicos na 3′-UTR de ambos

BRIC5

e

Wnt7a

mRNAs.

intensidade luminescente foi medida em

miR-195- Comprar e

miR-497-

transfectantes em comparação com o transfectante miR-controle. A)

miR-195/497

locais de ligação de cluster no 3′-UTR de

BIRC5

mRNA. repórter da luciferase ensaio vector utilizado a codificação região 3’UTR do

BIRC5

incluindo putativo

miR-195/497

sites de destino.

Renilla

valores luciferase foram normalizados para valores luciferase de pirilampo. * P 0,01. B)

miR-195/497

locais de ligação de cluster no 3′-UTR de

Wnt7a

mRNA. Luciferase ensaio de repórter vector é a região 3′-UTR a codificação do

Wnt7a

incluindo putativo

miR-195/497

site de destino. * P . 0,01

Discussão

Acredita-se que miARNs regular a expressão de aproximadamente 30% de todos os genes no genoma humano [29]. Em células normais, a interação de miRNAs e RNAs mensageiros-alvo (mRNAs) é rigidamente controlado, que esta regulação é muitas vezes ausente em células cancerosas. Um crescente corpo de evidências sugere que os miRNAs são expressas de forma aberrante em muitos cancros humanos e que eles desempenham papéis importantes na iniciação, desenvolvimento e metástase destes cancros [30]. Portanto, a identificação de miARNs expressas de forma aberrante é um passo importante na análise de oncogénese humana. O método analítico mais recente em genómica, a tecnologia de sequenciação profunda, tem o potencial para identificar novos miARNs específicos de tecidos, incluindo os tecidos de cancro em humanos [31]. tecnologia de sequenciação profunda é atualmente o padrão ouro para análise abrangente dos miRNAs humanos. Neste estudo, a sequenciação profunda identificou um grande conjunto de miRNAs que são diferencialmente expressos entre BC e epitélio normal.

Determinar as assinaturas dos miRNAs expressão pode rápida e confiável revelar miRNAs que são expressos de maneira aberrante em cancros. Portanto, anteriormente analisados ​​assinaturas de expressão de miARN através do uso de matrizes baseadas em PCR e procurou miARNs supressores de tumor em BC. miRNAs supressores tumorais Desta forma, foram identificados com sucesso, tais como

miR-1 |,

miR-133a

,

miR-145 Comprar e

miR-218

[18] – [20], [25], [32] – [36]. Nós comparamos os nossos resultados anteriores com as assinaturas de sequenciamento de profundidade aqui descritos, o que nos permite incluir os dados originais com a nova assinatura. Até à data, houve quatro estudos de assinaturas de expressão BC miRNA por análises de sequenciação de profundidade [9] – [12]. Em dados publicados,

miR-1 |,

miR-145

,

miR-143

,

miR-125b

, e

miR- 100

foram listados como os miRNAs mais frequentemente reprimidos [9] – [12], dados confirmados por nossa própria assinatura. Este facto apoia a eficácia da assinatura sequenciação profunda, e sugere que existem novos miARNs supressores de tumores nestes novos dados. A vantagem desta estratégia é a de ser capaz de identificar novos candidatos de miARN em BC que não tenham sido anteriormente relatadas. Encontrámos 17 tais sequências que possam constituir novos candidatos miRNA. No entanto, eles foram detectados níveis muito baixos de expressão em comparação com miARNs conhecidos em ambos cancro e tecidos benignos. O significado funcional destes novos candidatos de miARN é desconhecida, e que será importante no futuro, para examinar a relação entre estes candidatos miARNs aC e oncogénese. No presente estudo, nós não utilizar tecido de micro-dissecção, por conseguinte, a proporção exacta de células epiteliais nas amostras normais e a proporção exacta de células tumorais nas amostras de tumor são desconhecidos. No entanto, a fina-flap da mucosa da bexiga normal foi consistia principalmente de células NBE, enquanto que amostras de tumor foram constituídos principalmente de células epiteliais cancerosas. Portanto, acreditamos que a menor contaminação de outras células não era significativo e não afetou níveis de expressão de microRNAs.

Os microRNAs podem ser classificados em famílias com base em suas sequências ou em grupos com base em sua loci genômica. miRNAs cluster são transcritos de forma coordenada e têm funções semelhantes regulam os mesmos objectivos [37]. Por exemplo, a expressão do

miR-1 /133a

conjunto com frequência reduzida vários tipos de cancros, incluindo BC. Este cluster funciona como um supressor de tumor que visam os mesmos genes oncogénicos tais como

TAGLN2

e

PNP

[18] – [23]. Exemplos semelhantes foram relatados com outros miRNAs agrupados, tais como

miR-15a /16 Comprar e

miR-143/145

[14] – [16], [25] – [28]. Assim, esses estudos mostraram que miRNAs em cluster pode trabalhar em conjunto para realizar a sua função ao longo dos mesmos processos biológicos e os mesmos genes-alvo. No que se refere ao

miR-195/497

aglomerado, foi demonstrado que

miR-195

foi regulada negativamente em vários cancros [38] – [40] e inibiu a absorção de glucose, a proliferação, e ciclo celular, visando

GLUT3

e

CDK4

no BC [41], [42]. Também tem sido demonstrado que m

IR-497

foi regulada negativamente e funcionou como um supressor de tumor por segmentação

BCL2

em vários cancros [43], [44]. O

miR-195/497

cluster também funcionava como um supressor de tumor, visando

RAF1 /CCND1

no cancro da mama [45]. Para validar esses relatórios anteriores, foram avaliados os níveis de expressão de

miR-195

e

miR-497

em amostras clínicas BC e nós confirmou que

miR-195

e

miR-497

foram significativamente regulada negativamente em tecidos tumorais. Em seguida, nós investigamos o significado funcional de

miR-195

e

miR-497

em BC usando duas linhas de células, menino e T24. Restauração de madura

miR-195

ou

miR-497

em células cancerosas revelou significativa inibição da proliferação de células cancerosas, invasão e migração. Nossos dados atuais e estudos anteriores sugerem que o

miR-195/497

conjunto faz de fato funcionar como um supressor de tumor no BC.

miRNAs são únicos na sua capacidade de regular muitos genes codificadores de proteínas. previsões Bioinformatic indicam que miARNs regular mais de 30% dos genes codificadores de proteínas [29]. Em células cancerosas, normais miRNA – redes de mRNA são perturbadas por miRNAs expressos de maneira aberrante. Nós tomamos a posição de que a identificação de novas vias de câncer e genes-alvo responsáveis ​​regulados pelo supressor tumoral

miR-195/497

cluster é um primeiro passo importante na compreensão BC oncogênese. A partir dessa visão, nós identificamos vias moleculares e oncogenes destino que foram regulamentados pela

miR-195/497

cluster usando dados de expressão de genes do genoma e

in silico

análise. O

miR-195/497

conjunto pertence ao

miR-15/16/195/424/497

família que compartilha o mesmo 3′-UTR sequência de semente de ligação (AGCAGCA). O banco de dados TargetScan identificados 6.730 genes que eram alvos candidatos do

miR-195/497

cluster. análise de caminho KEGG indicou que esses genes foram implicados em 113 vias, incluindo “Caminhos do câncer”, “sinalização MAPK”, “Endocytosis”, “sinalização de insulina” e “sinalização de Wnt”.

Entre estas vias, nós focada em “Caminhos em câncer”, devido à sua relevância directa. De acordo com nossa hipótese, genes alvo de

miR-195/497

deve ser regulada em células cancerosas. Quando se examinaram os níveis de expressão de genes de 104 no grupo de “Acesso no cancro”, 27 genes foram supra-regulada em amostras clínicas BC, sugerindo que estes genes foram candidato

miR-195/497

alvos e funcionou como oncogenes BC. Para confirmar a fiabilidade do nosso

in silico

análise dos genes-alvo potencial, verificamos se

BIRC5

e

Wnt7a

genes foram, de facto, regulamentada pelo

miR- 195/497

cluster no BC. Nossos dados demonstram que

BIRC5

e

Wnt7a

foram diretamente regulados pelo

miR-195/497

cluster no BC.

BIRC5

é membro do inibidor de apoptose (IAP) família preferencialmente expresso por muitos cancros, incluindo BC [46]. Pode ser medido na urina nos níveis de ARNm e proteínas, e na urina

BIRC5

foi reportado como um biomarcador de diagnóstico para aC [47]. Estudos recentes de outros grupos têm mostrado que vários microRNAs, tais como

miR-542-3p,

miR-218

,

miR-708 Comprar e

miR-203

diretamente inibiu

BIRC5

expressão em diferentes tipos de câncer [48]. Nosso estudo é o primeiro a sugerir que

BIRC5

pode ser regulado pelo

miR-195/497

aglomerado em células BC. Portanto, a nossa estratégia de identificar romance tumor-supressor, miRNA-regulada moleculares metas /percursos em BC é uma abordagem eficaz para a investigação miRNA-câncer.

Conclusões

Em resumo, construímos expressão miRNA assinaturas de espécimes clínicos usando BC profunda sequenciamento como um método padrão-ouro. Um total de 60 miARNs foram significativamente reduzidos em amostras BC. Foram identificados vários miRNAs subregulado que estavam localizados dentro da mesma região genômica que constitui um cluster miRNA, incluindo

miR-1 /133a

,

miR-143/145

,

miR-99a /deixe-7c

,

miR-195/497 e miR-144 /451a

. Regulação negativa do

miR-195/497

aglomerado foi um evento frequente em amostras clínicas BC. Restauração destes miRNAs inibiu significativamente a proliferação de células cancerosas, migração e invasão, sugerindo que

miR-195/497

funcionam como supressores de tumor em BC. Nossa análise do

miR-195/497

Cluster sugeriu que ele reguladas vias câncer putativa e genes oncogénicos. Estas descobertas irão contribuir para a análise do BC oncogênese. Identificação do tumor-supressor

miR-195/497

cluster no BC humana poderia fornecer novas informações sobre potenciais alvos terapêuticos no tratamento do BC.

Materiais e Métodos

amostras clínicas e de cultura de células

As amostras de tecido para miRNA rastreio utilizando profunda seqüenciamento foram obtidas de cinco pacientes BC e cinco SENV. pacientes BC tinham sido submetidos a cistectomia ou ressecção transuretral de tumores da bexiga (TUR-BT) no Hospital Universitário de Kagoshima entre 2003 e 2010. Cinco SENV foram derivadas de pacientes com doenças não-BC. Não há contaminação das células cancerosas foi detectada por patologistas. Outra série de 29 BCs e 20 SENV foram obtidos a partir Hospital Universitário Kagoshima entre 2003 e 2010. Este grupo foi submetido a real-time RT-PCR para avaliar os níveis de expressão de miRNA. As amostras foram encenadas em conformidade com o sistema de classificação tumor-nódulo-metástase do American Joint Committee on Cancer /Union Internationale Contre Cancer le (UICC) e histologicamente classificado [49]. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes e nosso estudo foi aprovado pelo Comitê de Bioética da Universidade de Kagoshima. fundos dos pacientes e características clínico-patológicas estão resumidos nas Tabelas 1 e 6.

Foram utilizadas duas linhagens de células humanas BC: menino, que foi criada em nosso laboratório a partir de um paciente do sexo masculino asiática, 66 anos de idade , que foi diagnosticado com estágio III aC, com metástase pulmonar; e, T24, que foi invasiva e obtido a partir da American Type Culture Collection. Estas linhas celulares foram mantidas em meio essencial mínimo (MEM) suplementado com soro fetal bovino a 10%, numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 e 95% de ar a 37 ° C.

Recolha de Tecidos e ARN extracção

As amostras de tecido foram imersas em RNAlater (Qiagen, Valencia, CA, EUA) e armazenou-se a -20 ° C até a extracção de ARN foi realizada. O ARN total, incluindo miARN, foi extraída a partir de tecidos frescos congelados usando o kit de isolamento de miARN miRvana ™ (Ambion, Austin, TX, EUA) seguindo o protocolo do fabricante. A integridade do RNA foi verificada com o RNA 6000 Nano Kit de Ensaio e 2100 Bioanalyzer ™ (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA).

preparação biblioteca de RNA pequeno e profiling por sequenciação profunda

total de RNAs de cinco BCs e cinco SENV foram submetidos a sequenciação de profundidade. O processo experimental incluiu os seguintes passos: pequena isolamento de ARN, a preparação biblioteca de ADNc, e a sequenciação. O ARN total de cada amostra foi fraccionado pelo tamanho num gel de PAGE a 15% e uma fracção de 18-30 nucleótidos foi recolhido. O adaptador de 5′-ARN foi ligado ao ARN ARN-ligase de T4 com. Ligado ARN foi fraccionado pelo tamanho, e a fracção de 36-50 nucleótidos foi excisada. O adaptador de 3′-O ARN foi subsequentemente ligado a ARN precipitado utilizando ARN-ligase de T4. Ligado ARN foi fraccionado pelo tamanho, e a fracção de 62-75 nucleótidos (adaptadores + pequeno ARN) foi excisado.