Abstract

Fundo

A curcumina inibe o crescimento de xenoenxertos de tumores do cancro do pâncreas em ratos nus; No entanto, o mecanismo de acção não é bem compreendido. É cada vez mais evidente que as proteínas de ligação a ARN regular a expressão do gene pós-transcricional e desempenham um papel crítico na estabilidade do ARN e a tradução. Aqui, nós determinamos que a curcumina modula a expressão do RNA CUGBP2 proteína de ligação para inibir o crescimento do câncer de pâncreas.

Metodologia /Principais Achados

Neste estudo, nós mostramos que a curcumina tratada xenotransplantes tumorais têm uma redução significativa do volume do tumor e a angiogénese. Curcumina inibiu a proliferação, enquanto induz G2-M paragem e apoptose, resultando em catástrofe mitótica de várias células de cancro do pâncreas. Isto foi ainda confirmado por um aumento da fosforilação da quinase da proteína 2 (Chk2) ponto de verificação, juntamente com os níveis mais elevados de ciclina B1 nuclear e CDC-2. A curcumina aumentou a expressão de ciclo-oxigenase-2 (COX-2) e factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) de ARNm, mas os níveis de proteína foram menores. Além disso, a curcumina aumentou a expressão de proteínas de ligação a ARN CUGBP2 /CELF2, TIA-1. CUGBP2 ligação à COX-2 e ARNm de VEGF foi também melhorada, aumentando assim a estabilidade do mRNA, a mudança de 30 min a 8 h uma meia-vida. Por outro lado, knockdown mediada por silenciador de CUGBP2 restaurou parcialmente a expressão de COX-2 e VEGF, mesmo com o tratamento de curcumina. níveis de Cox-2 e ARNm de VEGF foram reduzidos para controlar os níveis, enquanto os níveis de proteínas foram maiores.

Conclusão /Significância

A curcumina inibe o crescimento do tumor pancreático através catástrofe mitótica por aumentar a expressão da proteína de ligação a ARN CUGBP2, inibindo deste modo a tradução de COX-2 e ARNm de VEGF. Estes dados sugerem que a inibição da tradução é um novo mecanismo de acção para a curcumina durante a intervenção terapêutica dos cânceres de pâncreas

Citation:. Subramaniam D, Ramalingam S, Linehan DC, Dieckgraefe BK, Postier RG, Houchen CW, et al . (2011) RNA Binding Protein CUGBP2 /CELF2 Medeia Induzido por curcumina mitótico Catastrophe de células do cancro do pâncreas. PLoS ONE 6 (2): e16958. doi: 10.1371 /journal.pone.0016958

editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 14 Outubro, 2010; Aceito: 18 de janeiro de 2011; Publicação: 11 de fevereiro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Subramaniam et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Apoiado por NIH concede DK062265, CA109269 e CA135559. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Apesar dos avanços na patogênese molecular, câncer de pâncreas continua a ser um importante problema de saúde sem solução nos Estados Unidos [1]. cancro do pâncreas é, um tumor metastático rapidamente invasiva, que é resistente a terapias convencionais [2], [3]. No momento, a quimioterapia baseada único agente (por exemplo gemcitabina) é o principal tratamento para o adenocarcinoma metastático do pâncreas. A gemcitabina tratamento tem uma taxa de resposta de tumor inferior a 10%; Do mesmo modo nenhum dos agentes quimioterapêuticos correntes disponíveis têm uma taxa de resposta objectiva de mais de 10% [4], [5]. Mais recentemente, combinações de drogas com gemcitabina também estão sendo examinados, mas é muito cedo para dizer se eles estão clinicamente superior. No entanto, a magnitude deste problema exige a necessidade de novos agentes terapêuticos.

estudos epidemiológicos sugerem que a dieta desempenha um papel importante na prevenção de diversos tipos de cancro. A curcumina, um ingrediente activo na especiaria cúrcuma, tem demonstrado efeitos anti-tumorais em estudos pré-clínicos [6], [7]. As propriedades anti-tumorais de curcumina incluem a inibição do crescimento do tumor e na indução de apoptose [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16] . Piloto Fase I de ensaios clínicos têm demonstrado que a curcumina é seguro, mesmo quando consumido a uma dose diária de 12 g para 3 meses [17], [18], [19]. A fase mais recente que eu estudo /II demonstrou que a terapia de combinação com 8 g curcumina oral diária com gemcitabina foi seguro e viável para pacientes com câncer pancreático que justificam uma investigação mais aprofundada em sua eficácia [20].

As propriedades anti-tumorais de curcumina foram atribuídas, pelo menos em parte, à sua capacidade para inibir a expressão e a actividade de ciclo-oxigenase-2 (COX-2) [21], [22]. É um enzima limitante da velocidade na via ácido araquidónico para a síntese de prostaglandina. A proteína é sobre-expresso na inflamação e numa variedade de cancros. Nos cancros pancreáticos, da COX-2 overexpresssion está associada com a inibição de apoptose, aumento da capacidade de invasão tumoral, e a promoção de angiogénese. A CELF (fatores CUGBP-ETR3-like) família de proteínas de ligação de RNA é composto por seis membros que estão envolvidos em vários processos celulares, incluindo mRNA splicing, edição, estabilidade e tradução [23]. Um dos membros, CUGBP2 (também conhecido como CELF2, ETR3, BRUNOL2, Napor2) é expressa ubiquamente, embora em níveis mais elevados em células musculares [24], [25]. Em estudos anteriores, nós demonstramos que quando CUGBP2 é sobre-expresso, as células sofrem mitose catástrofe [26], [27]. Nós também demonstraram que CUGBP2 pode ligar-se a sequências de UA-ricas na região 3’untranslated de ARNm de COX-2 e aumentar a estabilidade do ARNm, inibindo a sua tradução [28]. Hur, uma proteína de ligação com semelhança estrutural com CUGBP2 por outro lado ARN relacionado está implicada no aumento da COX-2 e melhorando a estabilidade do mRNA sua tradução por ligação aos mesmos ricos em AU elementos da sequência [29]. Uma terceira ligação de ARN proteína que funciona como um regulador de pós-transcricional da expressão do gene através do reconhecimento de L-sequência rica em RNA é TIA-1 (T-cell-restrito intracelular antigénio-1). TIA-1 tem sido mostrado para inibir a tradução do mRNA em condições de stress ambiental [30], [31]. Neste artigo, nós determinamos o efeito de curcumina sobre a expressão de proteínas de ligação RNA em células de câncer de pâncreas.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Todos os animais foram manipulados em estrita conformidade com as boas práticas de animais, tal como definido pelos organismos nacionais e /ou locais relevantes de bem-estar animal, e todo o trabalho animal foi aprovado pelo Comitê Institucional de animal Care and Use (IACUC) (Protocolo # 07-009) da Universidade de Oklahoma Saúde Sciences Center.

células e Reagentes

AsPC-1, MiaPaCa-2, Panc-1, BxPC-3 células de câncer pancreático Pan02 rato humana e (todos da American Type Culture Collection, Manassas, VA) foram cultivadas em meio RPMI 1640 contendo 10% de soro fetal de bovino inactivado pelo calor (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) e solução de antibiótico-antimicótico a 1% (Mediatech Inc., Herndon, VA) a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2. A curcumina foi comprado de LKT Laboratories, St Paul, MN.

proliferação e ensaios de apoptose

Para avaliar a proliferação, as células foram semeadas para placas de 96 poços e cultivadas durante a noite. As células foram então tratadas com doses crescentes de curcumina em meio RPMI 1640 contendo 10% de FBS. Análise de proliferação celular foi realizada por ensaio enzimático [32]. Para a apoptose, 3/7 actividade de caspase foi medida usando o Apo-ona A caspase-3/7 kit de ensaio homogéneo (Promega, Madison, WI).

Colónia ensaio de formação de

Resumidamente, 6 bem pratos foram inoculadas com 500 células viáveis ​​e deixou-se crescer durante 24 h. As células foram em seguida incubadas na presença ou ausência de várias concentrações de curcumina por até 48 horas. O meio contendo curcumina foi então removido, e as células foram lavadas em PBS e incubou-se durante um adicional de 10 d em meio completo. Cada tratamento foi realizado em triplicado. As colónias obtidas foram lavadas com PBS e fixadas em formalina a 10% durante 10 min à temperatura ambiente e, em seguida, lavadas com PBS, seguido por coloração com hematoxilina. As colónias foram contadas e comparadas com células não tratadas.

análises do ciclo celular

As células foram tratadas com a curcumina durante 12 h e 24 h, e, subsequentemente, tratadas com tripsina e suspensas em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Suspensões de uma única célula foram fixadas usando 70% de etanol durante 2 h, e posteriormente permeabilizadas com PBS contendo 1 mg /ml de iodeto de propídio (Sigma-Aldrich), 0,1% de Triton X-100 (Sigma-Aldrich) e 2 de RNase ug DNase-livre (Sigma-Aldrich) à temperatura ambiente. A citometria de fluxo foi feito com um analisador FACSCalibur (Becton Dickinson, Mountain, View, CA), capturando 50.000 eventos para cada amostra. Os resultados foram analisados ​​com o software ModFit LT ™ (Verity Software House, Topsham, ME).

Tempo real transcrição reversa Análise Polymerase Chain Reaction

RNA total isolado de MiaPaCa-2, células Pan02 e xenoenxertos de tumor utilizando o reagente TRIZOL foi transcrito de modo reverso com transcriptase reversa Superscript II, na presença de iniciadores aleatórios hexanucleotide (todos da Invitrogen, Carlsbad, CA). Os ADN complementares foram, em seguida, utilizado para PCR em tempo real utilizando a polimerase JumpStart Taq ADN (Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) e mancha de ácido nucleico SYBR Green (Molecular Probes, Eugene, OR). Cruzando valores limites para genes individuais foram normalizados para p-actina. Alterações na expressão de ARNm foram expressos como alteração em relação ao controlo de dobragem. Os iniciadores utilizados neste estudo foram os seguintes: β-actina: 5′-GCTGATCCACATCTGCTGG-3 ‘e 5′-ATCATTGCTCCTCCTCAGCG-3′; COX-2: 5’-GAATCATTCACCAGGCAAATTG-3 ‘e 5′-TCTGTACTGCGGGTGGAACA-3′; VEGF: 5’-AGCGCAAGAAATCCCGGTA-3 ‘e 5′-TGCTTTCTCCGCTCTGAGC-3′; Hur: 5′-GTGAACTACGTGACCGCGAA 3’and-5’-GACTGGAGCCTCAAGCCG-3 ‘; CUGBP2: 5’-TGCTTCAACCCCCAACTCC-3 ‘e 5′-GTCCTTGCAGAGTCCCGAGA-3′; TIA-1: 5′-ACCCATCTGTTGAATGGCGT 3’and-5’-GGCAACAGGAAAGTCTAAGGGAT-3 ‘; Ciclina D1: 5’-AATGACCCCGCACGATTTC-3 ‘e 5′-TCAGGTTCAGGCCTTGCAC-3’

ARN Estabilidade ensaio

As células foram tratadas com a curcumina durante 2 h.. Actinomicina D (10 ng /ml concentração final), um potente inibidor de síntese de ARNm foi adicionado às células e ARNm total foi extraído a 0-8 h. O ARN foi submetido a PCR em tempo real como descrito acima. Os dados são apresentados como em relação às células de controlo, no momento da adição de actinomicina D.

Análise Western Blot

Os lisados ​​celulares foram submetidos a electroforese em gel de poliacrilamida e transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno Immobilin (Millipore , Bedford, MA). Os anticorpos foram adquiridos da Cell Signaling Technology (Beverly, MA), Abcam Inc. (Cambridge, MA) e Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA) e as proteínas específicas foram detectadas pelo sistema de quimioluminescência aumentada (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) .

Immunoprecipitation

Para imunoprecipitação, as células foram fixadas com 1% de formalina. Os lisados ​​foram preparados e imunoprecipitados com anticorpo anti-CUGBP2. O sedimento e sobrenadante foram subsequentemente incubadas a 70 ° C durante 1 h para reverter as ligações cruzadas, e o RNA foi purificado e submetido a RT-PCR para determinar os níveis de Cox-2 e ARNm de VEGF.

siARN

sequência de direccionamento do mRNA CUGBP2 5′-GCAAACCUUACUGAUCCUA-3 ‘(Adesão mumber NS. NM_001025076) e um siRNA de controlo scrambled não correspondentes qualquer um dos genes humanos foram obtidos a partir de Ambion Inc., Texas, EUA e transfectado com reagente de transfecção siPORT (Ambion).

tumores de xenoenxerto Pan02

ratinhos nus Cinco semanas de idade do sexo masculino atímicos adquiridos de Jackson Laboratories foram utilizados para

in vivo

experimentos. Os ratos foram mantidos com água e ração padrão do mouse

ad libidum

que é usado em protocolos aprovados pelo Comitê de Estudos em Animais da Universidade. Os animais foram injectados com 1 × 10

6 Pan02 células no flanco esquerdo e direito e permissão para formar xenotransplantes. Uma semana após a plantação das células e depois observando a presença de um tumor palpável, curcumina (200 ug /kg de peso corporal) em 5% de Na

2 HCO

3 tampão sozinho foi administrado por via intraperitoneal diariamente durante 23 d. O tamanho do tumor foi medido semanalmente. No final do tratamento os animais foram sacrificados e os tumores foram removidos, pesados, e preparadas para serem utilizadas em histologia (hematoxilina eosina, a COX-2, VEGF, e CD31) e estudos de expressão de genes

. a imunocitoquímica e imuno-histoquímica

As células foram plaqueadas sobre a lamela e deixou-se crescer durante 24 h. As células foram então fixadas com formalina tamponada 10% durante 10 min e subsequentemente lavou-se com PBS. As células foram depois permeabilizadas com PBS contendo 0,5% de Triton X-100 durante 10 min. As lamelas foram incubadas com anticorpo de coelho anti-ciclina B1 (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA) e anticorpos de coelho anti-Cdc2 (Abcam Inc, Cambridge, MA), seguida por IgG anti-coelho biotinilado. As lâminas foram ainda processados ​​usando o kit de Vectastatin ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA) seguido por coloração com DAB.

tecidos embebidos em parafina foram cortadas para uma secção de 4 uM, desparafinadas e tratadas com tampão de citrato. Em seguida, eles foram bloqueadas com avidina /biotina, durante 20 min. As lâminas foram incubadas com anti-COX-2 ou VEGF ou CD31 ou Hur ou CUGBP2 ou TIA-1 ou ciclina D1 para a noite a 4 ° C. Em seguida, as lâminas foram tratadas com o anticorpo secundário, tal como a HRP de cabra anti-coelho para subsequente da COX-2, VEGF, Hur, CUGBP2, TIA-1, e a coloração de ciclina D1. Para CD31staining de cabra anti-rato HRP foi utilizado. Cada anticorpo secundário foi incubado durante uma hora e, em seguida, desenvolvida com DAB (Sigma Aldrich). Finalmente, as lâminas foram contrastadas com hematoxilina.

A análise estatística

Todos os valores são expressos como a média ± SEM. Os dados foram analisados ​​utilizando um teste não emparelhado 2-tailed t. A

valor P

inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

A curcumina inibe o crescimento do tumor de xenoenxertos tumorais Pan02 e angiogênese

Para começar a avaliar o papel da curcumina na proliferação tumoral

in vivo

, examinamos a capacidade de curcumina para suprimir o crescimento de xenoenxertos de células de cancro pancreático de rato em ratinhos nus. tumores de xenoenxerto induzidas células de câncer pancreático foram autorizados a desenvolver e crescer a um tamanho de 200 mm

3 após o que a curcumina foi administrado por via intraperitoneal por três semanas diária. A curcumina inibiu significativamente o crescimento dos xenoenxertos de tumor (Fig. 1a). Os tumores excisados ​​de animais de controlo variou de 700 a 800 mg, enquanto aqueles tratados com curcumina pesavam menos que 400 mg (Fig. 1B). Além disso, o volume de tumor foi significativamente diminuída (Fig. 1A). Não houve qualquer alteração aparente no peso do fígado, no peso do baço, ou de peso corporal nos animais (dados não mostrados). Estes dados implicam que a curcumina é um potente agente terapêutico para o tratamento de cancros do pâncreas e é relativamente não-tóxico para os murganhos. Nós também determinado o efeito da curcumina na vascularização do tumor através da coloração para o CD31 antigénio específico endotelial. Como mostrado na Figura 1C, o tratamento de curcumina reduzido significativamente a coloração CD31 e obliterada os vasos tumorais sugerindo diminuiu angiogénese. Também calculamos a densidade de microvasos e achei que fosse significativamente reduzido após o tratamento curcumina (Fig. 1D). Curcumina

(A) ratos nus que transportam xenoenxertos de tumores de células Pan02 nos flancos foram administrados por via intraperitoneal por 3 semanas. Houve uma redução significativa no tamanho do tumor de animais tratados com curcumina, quando comparado com controlos não tratados (* p 0,05). (B) o tratamento resultou em curcumina significativamente menor peso de tumor, quando comparado com os controlos (* p 0,05). (C) secções de tumores foram coradas para CD31, um marcador de superfície específico de células endoteliais e com hematoxilina e eosina (H E). A figura representativa é apresentada mostrando redução significativa nos microvasos. (D) O número de microvasos em tecidos tumorais foram contadas em 12 campos de alta potência e média. Os dados mostram que a densidade microvascular foi significativamente reduzida nos enxertos de animais curcumina tratados (* p 0,05)

A curcumina inibe a célula de câncer pancreático crescimento

Para determinar o mecanismo de curcumin-. mediada parada do crescimento, estudamos as células cancerígenas pancreáticas

in vitro

. Para isso, utilizou cinco linhas de células cultivadas diferentes MiaPaCa-2, Panc-1, ASPC-1, BxPC-3 e Pan02. A curcumina suprimiu significativamente a proliferação de linhas de células do cancro do pâncreas MiaPaCa-2, Pan02, AsPC-1, BxPC-3 e Panc-1 de uma forma dependente da dose e tempo. Este efeito anti-proliferação de células tumorais foi visto dentro de um período de 24 h, a qual continuou a aumentar significativamente ao longo dos próximos 72 h (Fig. 2A). Para determinar o efeito a longo prazo do tratamento curcumina, as células foram tratadas com 30 uM curcumina durante 24 h, após o que as células foram deixadas a crescer em meio normal. Curcumina tratamento suprimida a formação de colónias em todas as linhas celulares do cancro do pâncreas (Fig. 2B), sugerindo que os efeitos da curcumina sobre as células de tumor era irreversível. A ciclina D1 é uma proteína reguladora do ciclo celular, que regula a transição G1 para a fase S do ciclo celular e funciona como um cofactor para vários factores de transcrição [33]. A sobre-expressão de ciclina D1 foi ligado ao desenvolvimento e progressão do cancro [34]. Em ambas as células MiaPaCa-2 e Pan02, curcumina tratamento resultou na redução da expressão de ciclina D1 em 24 h (Fig. 2C e D). Além disso, a ciclina A2, que regula a progressão /S G2, foi regulada negativamente potencialmente retardar a progressão de células de fase S (dados não mostrados).

(A) curcumina inibe a proliferação de células de cancro do pâncreas. MiaPaCa-2, células Pan02, AsPC-1 e BxPC-3 foram incubadas com curcumina (1-50 uM) durante até 72 h. A proliferação celular foi analisada utilizando a actividade da enzima hexosaminidase. Curcumina tratamento resultou numa diminuição da dose e dependente do tempo significativo na proliferação celular em todas as células, quando comparado com controlos não tratados. (B) A curcumina inibe a formação de colónia. células MiaPaCa-2 e Pan02 foram incubadas com 30 uM de curcumina durante 24 horas e as colónias foram deixadas a formar por incubação em meios regulares contendo 10% de FBS durante um adicional de 10 d. O tratamento com a curcumina inibiu a formação de colónias. Um representativos de três experiências independentes, é apresentada. (C) A expressão da ciclina D1 é suprimida a 24 h. ARN a partir de células MiaPaCa-2 e Pan02 incubadas com 30 uM curcumina foram sujeitos a PCR em tempo real para a ciclina D1 mRNA expressão. Houve supressão significativa do ARNm às 24 h, mas não às 12 h (* p 0,05). (D) Os lisados ​​de MiaPaCa-2 ou Pan02 incubadas com 30 uM curcumina foram analisados ​​por transferência de Western para os níveis de expressão da ciclina D1. tratamento curcumina inibe a ciclina D1 mRNA e expressão de proteína.

curcumina induz G2-M parada do ciclo celular antes da catástrofe mitótico

A seguir, determinar se a curcumina afecta a progressão do ciclo celular e a consequência desta efeito. a paragem do crescimento induzida curcumina do MiaPaCa-2 dentro de 24 h a G

Fase 2 M (Fig. 3A). Resultados semelhantes foram observados em células Panc-1 e Pan02 (dados não mostrados). A curcumina é conhecido por induzir a apoptose em diversas células cancerosas. A caspase-3 e 7 são moléculas efectoras chave que se sabe induzirem apoptose em várias células de cancro, amplificando o sinal a partir de caspases iniciadoras, tais como a caspase 8, caspase 10 ou [35], [36]. Capsase 3 e 7 foram aumentados dentro de 24 h nas células MiaPaCa-2 linha tratados com curcumina sugerindo a indução da apoptose (Fig. 3B). análises de Western blot de MiaPaCa-2 e os lisados ​​celulares Pan02 demonstraram um aumento significativo na caspase-3 activada em células tratadas curcumina (Fig. 3B) de inserção. Estes dados sugerem que as células de tumor foram tratados curcumina sofrer apoptose. Para determinar se uma prisão na fase G2 ou a falta de progressão para a mitose está contribuindo para o maior nível de células visto em L

fase 2M, avaliamos a expressão e localização de ciclina B1 e serina /thereonine quinase CDC- 2. A ciclina B1 /CDC-2 complexo desempenha um papel significativo no G

2M de transição de fase do ciclo celular. Para induzir a mitose, ciclina B1 e CDC-2 heterodimerizar localizar e para o núcleo, que por sua vez activa as enzimas que regulam a condensação da cromatina, colapso da membrana nuclear e a mitose reorganização microtúbulos específica [37], [27]. Análise imunocitoquímica demonstrou níveis nucleares significativamente mais elevados de ambos ciclina B1 e CDC-2 em células curcumina tratada sugerindo que as células tratadas foram submetidos a curcumina catástrofe mitótica (Fig. 3C). Em adição a isto, a análise Western Blot demonstraram um aumento da expressão de ambos ciclina B1 e CDC-2 em células tratadas curcumina e fosforilação da cinase Chk2 em ambas as células MiaPaCa-2 em cultura de tecidos e os Pan02 xenoenxerto de tumor (Fig. 3D). Dado que as células foram em apoptose, ao mesmo tempo que estavam em G2-M prisão, sugere que a curcumina induz as células a sofrer catástrofe mitótica.

perfis A) do ciclo celular de células de MiaPaCa-2 tratada com a curcumina durante 12 h e 24 h, e foram determinados por citometria de fluxo utilizando coloração com iodeto de propídio para teor de ADN. tratamento curcumina aumentou significativamente células no S e G

Fase 2 M de ciclo celular dentro de 12 h. (B) o tratamento de curcumina induz apoptose. células MiaPaCa-2 e Pan02 incubadas com 30 uM de curcumina foram analisadas quanto apoptose por activação da caspase 3/7. Curcumina tratamento aumentou o número de células que sofrem apoptose em comparação com controlos não tratados (* p 0,05). (Inset) curcumina induz caspase 3, um mediador de apoptose. Os lisados ​​de células MiaPaCa-2 ou Pan02 incubadas com 30 uM curcumina foram analisadas por western blotting de proteínas caspase 3. Curcumina mostra células tratadas clivado (activada) da caspase 3 enquanto que as células não tratadas não têm de caspase-3 clivada. (C) o tratamento de curcumina aumentou os níveis de ciclina B1, cdc-2 fosforilado e o ponto de verificação cinase Chk2. Os lisados ​​de células tratadas com a curcumina MiaPaCa-2 (esquerda) e xenoenxertos de tumor Pan02 (direita) foram analisados ​​por transferência de Western para fosfo Chk2, e ciclina B1 e CDC-2 níveis de expressão de proteína. tratamento curcumina fosforila quinases de ponto de verificação e aumento dos níveis de ciclina B1 e CDC-2 em ambos os MiaPaCa-2 células e xenotransplantes tumorais Pan02. Resultados (D) o tratamento de curcumina na localização nuclear de ciclina B1 e CDC-2. Imunocitoquímica de curcumina tratada com MiaPaCa-2 células tanto o cyclinB1 e níveis de proteína Cdc-2 eram predominantemente no núcleo em comparação do que células não tratadas. A fosforilação de Chk2, juntamente com a expressão aumentada e a translocação nuclear de ciclina B1 e CDC-2 demonstra progressão mitótica das células.

A curcumina inibe a expressão de COX-2 e VEGF durante a indução CUGBP2, TIA-1

COX-2 desempenha um papel importante na carcinogénese, incluindo o aumento da capacidade de invasão, a promoção da angiogénese e resistência à apoptose [38]. Por conseguinte, determinada a sua expressão em xenoenxertos de tumor. As análises PCR em tempo real demonstrou que a COX-2 de expressão do mRNA foi significativamente menor em curcumina tratada xenoenxertos de tumor quando comparados com os tumores de controlo (Fig. 4A). Este foi ainda confirmada por transferência de Western e imuno-histoquímica análises, onde foram observados níveis mais baixos de proteína COX-2 nos tecidos tratados com curcumina (Fig. 4B, C). As prostaglandinas e os outros promotores de tumores são conhecidos por induzirem a expressão de VEGF em células epiteliais que promove a angiogénese e, assim, o crescimento do tumor [39]. VEGF mRNA e a expressão da proteína foi analisada e também foi encontrada para ser significativamente inferior em curcumina tratada xenoenxertos de tumor quando comparados com os tumores de controlo (Fig. 4A, B). A imuno-histoquímica demonstrou também que o tratamento curcumina reduziu significativamente a coloração de VEGF quando comparada com o controlo tumor (Fig. 4C). A ciclina D1 é uma proteína reguladora do ciclo celular, que regula a transição G1 para a fase S e funciona como um cofactor para vários factores de transcrição [40]. A sobre-expressão de ciclina D1 também tem sido associada ao desenvolvimento e progressão do cancro [34]. Curcumina tratamento expressão da ciclina D1 inibida nos xenoenxertos de tumor, sugerindo que inibe a proliferação de células de cancro (Fig. 4A, B). Um certo número de proteínas de ligação a ARN têm sido identificadas para reconhecer ARE contendo sequências e regular a estabilidade do mRNA. Os membros da CELF (CUGBP2) e da família elav (Hur) de proteínas de ligação a ARN estão implicados em vários processos celulares, incluindo splicing do mRNA, a edição, a estabilidade e a tradução [23], [41]. Foi anteriormente demonstrado que CUGBP2 é induzida em células que sofrem apoptose e funções para inibir COX-2 de ARNm tradução [28], [42]. T-cell- restrito intracelular antigénio-1 (TIA-1) é também uma proteína de ligação a ARN que funciona como um supressor de translação, especialmente sob condições de stress [43]. Aqui observa-se que a curcumina tratamento resultou num aumento significativo em ambos CUGBP2, TIA-1 mRNA e a expressão da proteína nos xenoenxertos de tumor (Fig. 4A, B, D). Por outro lado, não houve alteração significativa observada em ambos os níveis de mRNA e proteína Hur em resposta a curcumina (Fig. 3A, B, D).

(A) RNA total a partir de xenoenxertos de tumor foram submetidos a Pan02 PCR em tempo real. tratamento curcumina resultou em redução da ciclina D1 níveis de mRNA de COX-2, VEGF e, quando comparado ao grupo controle. Por outro lado, CUGBP2, TIA-1 aumentou a expressão de ARNm foi (* p 0,05). Dados é uma média de xenoenxertos em 5 ratos. (B) Análise de transferência de Western demonstrou que os lisados ​​de tecido de animais tratados curcumina têm níveis significativamente mais baixos de COX-2, VEGF, e as proteínas ciclina D1, mas o aumento dos níveis de proteínas e CUGBP2 TIA-1. (C) A imunohistoquímica demonstra que o tratamento curcumina reduziu significativamente a expressão de COX-2 e VEGF. (D) A imuno-histoquímica demonstra aumento da expressão de CUGBP2 e TIA-1 em xenoenxertos tumorais.

A curcumina inibe a tradução COX-2 e mRNA VEGF em células de câncer de pâncreas

Estudos anteriores demonstraram níveis aumentados de ARNm de COX-2 e a expressão da proteína em adenocarcinomas pancreáticos [38]. Portanto, o próximo determinou os efeitos do tratamento sobre a curcumina expressão de COX-2. Curcumina tratamento aumentou significativamente os níveis de ARNm de COX-2 em células MiaPaCa-2 (Fig. 5a). No entanto, houve uma redução significativa nos níveis de proteína da COX-2 (Fig. 5B). Resultados semelhantes foram observados em células Pan02 (dados não mostrados). Determinou-se também o efeito da curcumina na expressão do gene de VEGF nas células. Curcumina tratamento aumentou significativamente o ARNm de VEGF, inibindo os níveis de proteína em MiaPaCa-2 células (FIG. 5A, B). Resultados semelhantes foram observados em células Pan02 (dados não mostrados). Por outro lado, a curcumina aumentou significativamente tanto a expressão CUGBP2, TIA-1 mRNA e proteína (Fig. 5A, B). No entanto, não houve nenhuma alteração significativa observada com a expressão Hur (Fig. 5A, B). Em estudos anteriores, nós demonstramos que CUGBP2 liga-se a COX-2 3’UTR para inibir a sua tradução [28]. Dado que os níveis de ARNm de COX-2 são mais elevados, mas os níveis de proteína são mais baixos em resposta ao tratamento curcumina, verificou-se se a curcumina aumenta a ligação de CUGBP2 para COX-2 de ARNm. A imunoprecipitação acoplada RT-PCR demonstrou que não havia um nível mais elevado de ligação a CUGBP2 COX-2 e ARNm de VEGF quando comparado com o controlo, as células não tratadas (Fig. 5C). Além disso, actinomicina D experimentos demonstraram que o tratamento curcumina resultou em níveis significativamente mais elevados de COX-2 a estabilidade do mRNA, a semi-vida aumenta de 30 min nas células não tratadas para ~ 8 h (Fig. 5D). Resultados semelhantes foram observados com o VEGF; a meia-vida do ARNm de VEGF também aumentou de 30 min a . (Figura 5D). 8 h em células tratadas curcumina

(A), a expressão de ARNm. células MiaPaCa-2 foram tratadas com a curcumina durante 2 h. Curcumina tratamento aumentou os níveis de COX-2, VEGF, CUGBP2 e ARNm TIA-1. Não houve alteração significativa da expressão de mRNA Hur (* p 0,05). Dados a partir de três experiências independentes. (B) as análises de transferência de Western que demonstram lisados ​​com curcumina células tratadas MiaPaCa-2 têm níveis mais baixos da COX-2 e proteínas VEGF e níveis crescentes de CUGBP2, TIA-1. Representativos de três experiências independentes. (C) (painel esquerdo), o aumento da ligação da ligação CUGBP2 para COX-2 ou mRNA VEGF após o tratamento curcumina. extracto celular total (T) a partir de células tratadas com curcumina foram imunoprecipitados com anticorpo anti-CUGBP2, e ARN dos imunoprecipitados (P) e sobrenadante (S) foram isoladas e submetido a RT-PCR para a COX-2 e ARNm de VEGF. Os dados demonstram um aumento da COX-2 ou mARN de VEGF no sedimento de células tratadas com curcumina. (Painel direito) Os dados foram quantificados e houve um aumento claro da COX-2 e ARNm de VEGF no sedimento de células tratadas curcumina. células (D) MiaPaCa-2 foram tratadas com a curcumina durante 2 h e a estabilidade da COX-2 e ARNm de VEGF foram determinados após a adição de actinomicina D (concentração final: 10 ug /ml). Curcumina aumenta a meia-vida do ARNm de COX-2 de 30 min a 8 h. Da mesma forma, a curcumina aumentou a semi-vida do ARNm de VEGF de 30 min a 8 h. Os dados demonstram tratamento curcumina aumentou significativamente a estabilidade do mRNA de COX-2 ou VEGF.

A curcumina mediada estabilidade COX-2 e mRNA VEGF requer CUGBP2

Temos anteriormente demonstrado que CUGBP2 ligação a COX -2 3’UTR aumenta a estabilidade do ARNm de COX-2, enquanto inibindo a sua tradução [28]. Por isso, determinado o efeito do knockdown CUGBP2 na supressão tradução mediada por curcumina de COX-2 e ARNm de VEGF. As medições do tempo de PCR comum demonstrou que o tratamento curcumina resultou em níveis significativamente mais elevados de COX-2 e ARNm de VEGF, que foi reduzido para controlar os níveis de expressão quando CUGBP2 foi knockdown (Fig. 6A). A seguir, determinou se houve quaisquer efeitos sobre a expressão da proteína. Curcumina tratamento reduziu significativamente os níveis de ambas as proteínas de COX-2 e VEGF. No entanto, quando CUGBP2 foi derrubado com um siRNA específico, COX-2 e proteínas VEGF níveis não foram afetados pelo tratamento curcumina (Fig. 6B). Nós também determinar se os efeitos mediados por curcumina sobre a COX-2 e a estabilidade do ARNm de VEGF são afectados por CUGBP2 knockdown. Embora o tratamento curcumina aumentou a estabilidade do mRNA de COX-2 e VEGF, houve um efeito menor quando CUGBP2 também foi derrubado usando siRNA específico. A meia-vida do ARNm de COX-2 foi aumentada de 30 min para ~ 8 h após o tratamento curcumina, que foi reduzido para ~ 2 h quando a expressão CUGBP2 foi inibida (Fig. 6C). Resultados semelhantes foram obtidos para o VEGF, onde knockdown de CUGBP2 reduziu a estabilidade mediada por curcumina a partir de 8 h para 1 h (Fig. 6c). Estes dados sugerem que o aumento mediado curcumina na estabilidade da COX-2 e ARNm de VEGF ocorre em parte através CUGBP2.

(A) CUGBP2 é necessário para níveis de Cox-2 e ARNm de VEGF induzida por curcumina.