Abstract
Fundo
Survivina é um inibidor da apoptose e sua sobre-expressão está associada a mau prognóstico em diversas neoplasias malignas. Embora vários estudos têm analisado a expressão survivin no carcinoma epidermóide de esôfago, poucos têm incidido sobre adenocarcinoma esofágico (EAC) e /ou epitélio escamoso câncer adjacente (CASE). O objetivo deste estudo foi de 1) para determinar o grau da survivina a regulação em amostras de EAC e CASE, 2) avaliar se a expressão survivin na EAC e CASE correlaciona-se com recorrência e /ou morte, e 3) para examinar o efeito de inibição survivin na apoptose em células de EAC.
Métodos
amostras congeladas frescas de EAC e CASE do mesmo paciente foram utilizados para a análise de Western blot qRT-PCR e, e fixado em formol e incluídas em parafina tecido embebido foi utilizado para imuno-histoquímica. linhas celulares de EAC, OE19 e OE33, foram transfectadas com pequenos RNAs de interferência (siRNAs) para knockdown expressão survivin. Isto foi confirmado por qRT-PCR para a expressão de survivina e análise por Western blot da PARP clivada, caspase 3 clivada e survivina. dados de expressão survivin foi correlacionado com a evolução clínica.
Resultados
expressão survivin foi significativamente maior em amostras de tumor EAC comparação com o caso de um mesmo paciente. Pacientes com elevada expressão de survivina em tumores EAC tiveram um risco aumentado de morte. Survivina expressão também foi observado em PROCESSO e correlacionados com um risco aumentado de recorrência distante. avaliação de linha de células demonstraram que a inibição de survivina resultou num aumento da apoptose
Conclusão
expressão
Superior de survivina em tecido de tumor foi associada a maior risco de morte.; enquanto que a expressão survivin no caso foi um preditor superior de recorrência. A inibição da survivina em linhas celulares EAC mostrou ainda aumento da apoptose, apoiando os benefícios potenciais de estratégias terapêuticas direccionadas para este marcador
Citation:. Malhotra U, Zaidi AH, Kosovec JE, Kasi PM, Komatsu Y, Rotoloni CL, et ai. (2013) Valor prognóstico e alvejado Inibição da Survivina Expressão no esôfago Adenocarcinoma e Câncer-Adjacente epitélio escamoso. PLoS ONE 8 (11): e78343. doi: 10.1371 /journal.pone.0078343
editor: Nupur Gangopadhyay, da Universidade de Pittsburgh, Estados Unidos da América
Recebido: 29 Julho, 2013; Aceito: 13 de setembro de 2013; Publicação: 04 de novembro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Malhotra et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. David Gold e Irene Blumenkranz para a prestação de apoio financeiro. números de subvenção e o URL não estão disponíveis. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer de esôfago é atualmente o oitavo câncer mais comum em todo o mundo; com adenocarcinoma esofágico (EAC), correspondendo a 50% dos casos de câncer de esôfago [1] – [5]. A sobrevivência de cinco anos para o câncer esofágico é inferior a 20% e sua incidência aumentou quase três vezes no hemisfério ocidental nos últimos 20 anos [6], [7]. A maioria dos pacientes da EAC são diagnosticadas com doença em estágio avançado e têm taxas de sobrevivência pobres de longo prazo com os agentes quimioterápicos empregados atualmente [5], [8], [9]. A eficácia dos regimes actuais atingiu um patamar e uma intensificação de agentes citotóxicos ou radiação de escalonamento de dose tem sido mostrado para ser associado a efeitos colaterais adversos significativos. Por conseguinte, a necessidade para o desenvolvimento de terapias específicas eficazes destinadas ao tratamento de mecanismos específicos da carcinogénese são necessários a fim de melhorar a sobrevivência [2] -. [4], [10], [11]
Survivina, igualmente conhecido como inibidor da apoptose baculoviral-Repita contendo 5 ou BIRC5, é um inibidor de apoptose ou morte celular programada [10] – [13]. O mecanismo de acção através da via intrínseca é como se segue: survivina se liga a e inibe a caspase 9, fazendo com que a desactivação do circuito apoptótico; procaspase 3 não é clivado e, portanto, não clivar a PARP (polimerase de poli ADP-ribose); Como resultado, permanece PARP activa e continua com a reparação do ADN, resultando na inibição da apoptose (Figura 1) [8], [10], [11], [13], [14]. Normalmente survivina só é encontrada durante o desenvolvimento embrionário e fetal, como um meio para regular a divisão celular e crescimento adequado e não é detectável em tecidos normais, a maior parte terminalmente diferenciadas [15]. Alguns tecidos adultos normais com expressão persistente survivina incluem células hematopoiéticas estaminais [16], [17] timócitos, melanócitos [18], a mucosa gástrica [19] e epitélio do cólon [19]. Estudos têm relatado um aumento da expressão de survivina em um certo número de cancros, incluindo mama, pulmão, melanoma, leucemia, linfoma, do cólon, do pâncreas, etc. e [15]. As evidências também suporta mais de expressão de survivina em carcinoma de células escamosas do esôfago e sua associação com um mau prognóstico [3], [4], [8], [10], [11], [20]. Porque survivina não é expressa na maioria dos tecidos saudáveis, ele representa um alvo ideal para o desenvolvimento de novos agentes câncer [3], [4], [8], [10], [11], [13], [20 ], [21]. Em agentes de fatos visando survivin estão atualmente na fase I e fase II de ensaios clínicos em doentes com cancro avançado onde os métodos de inibição incluem oligonucleotídeos antisense (ASOs), repressores de transcrição, e imunoterapia [10], [14], [22]. Alguns destes agentes demonstraram resultados iniciais promissores, no entanto, nenhum deles tenha melhorado a sobrevivência geral [3], [4], [7], [10], [11], [14], [22] – [24].
Survivin se liga e inibe a caspase 9, caspase 9 é incapaz de clivar caspase 3, caspase 3 é incapaz de clivar PARP, PARP promove a reparação do ADN e não induz a apoptose.
Embora existam tem havido muitos relatórios que analisam o papel da survivina em carcinoma de células escamosas do esôfago (SCC), poucos estudos têm abordado o seu papel no adenocarcinoma esofágico (EAC) [3], [4], [7] – [9], [21] , [25], [26]. Em adição expressão deste gene anti-apoptótica no epitélio escamoso cancro adjacente (CASE) não foi estudado. O objetivo do nosso estudo, portanto, foi de 1) para determinar o grau da survivina a regulação em amostras de pacientes EAC e CASE, 2) para avaliar a recorrência e sobrevivência com expressão survivin na EAC e tecido CASE, e 3) para examinar o efeito de inibição da survivina na apoptose em linhas celulares da EAC.
Materiais e Métodos
Ética Declaração
O estudo foi realizado após obter a aprovação da Universidade de Pittsburgh Institutional Review Board. As amostras foram tomadas a partir da Cancer Center UPMC – Registro risco de câncer de esôfago, da Universidade de Pittsburgh IRB Estudo Número 98-122 com URL: https://www.upmccancercenter.com/trials/trialDisplay.cfm?id=2277 type=D. Como parte do estudo, todas as amostras dos pacientes foram obtidas com consentimento escrito completo.
Linhas Celulares
As linhas celulares EAC OE19 (JROECL19) e OE33 (JROECL33) foram obtidos através de Sigma-Alderich (St. Louis, MO). Elas foram mantidas no Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 meio de crescimento de células (Life Technologies, Carlsbad, CA, 21870076), suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) (Life Technologies, Carlsbad, CA, 26140079), 1% L-glutamina (Life Technologies, Carlsbad, CA, 25030081), 1% de penicilina-estreptomicina (Life Technologies, Carlsbad, CA, 15070063). Todas as células foram armazenadas em 25 cm
2 frascos e incubou-se a 37 ° C com 5% de CO
2 ar humidificado. Tripsina-EDTA (Life Technologies, Carlsbad, CA, 25200072) foi usado para colher as células do seu balão e preparar uma suspensão de células individuais para análise de transferência de Western e Transcrição Reversa -. Reacção em Cadeia da Polimerase (RT-PCR)
Transfection siRNA
OE33 e OE19 foram semeadas numa placa de 6 poços a uma densidade de 4 x 10
5 24 horas antes da transfecção. As células foram transfectadas quer com pequenos ARN interferentes (siRNAs) ou não tratados. As categorias de siRNA utilizados incluíram survivin siRNA específico, ou um controlo negativo (mistura) (Dharmacon, Lafayette, CO, D-001810-10-05). Cada solução foi diluída siARN do estoque de 100 um a 5 um em RNase H
2O, em seguida, diluída para 0,25 ^ M em Opti-MEM (Life Technologies, Carlsbad, CA, 31985062). Simultaneamente, 2 mL de reagente de transfecção 4 (Dharmacon, Lafayette, CO, T-2004) por reacção foi diluída com 98 mL de Opti-MEM. As soluções foram incubadas separadamente durante 5 minutos à temperatura ambiente, misturados entre si, e incubou-se durante mais 20 minutos à temperatura ambiente. A solução final foi diluída com ARNsi 1 mL por reacção com Opti-MEM para uma concentração final de 25 nM. As células foram incubadas a 37 ° C em 5% de CO
2 ar humidif içado, com uma mudança de meio RPMI após 24 horas. lisado celular total foi coletada em 48 horas para análise de RNA ou 72 horas para análise de proteínas.
Pacientes e Preparação de tecidos
O estudo foi realizado após obter a aprovação da Universidade de Pittsburgh Institutional Review Board. Os pacientes que foram submetidos a esofagectomia por adenocarcinoma de esôfago localizada desde o início de 2008 até final de 2010 foram incluídos no estudo. Quarenta e sete amostras foram rastreados e após a exclusão de carcinoma de células escamosas, cancro adeno, e os blocos de tecido com tumor de menos do que 70%, um total de 37 amostras de pacientes foram analisados para este estudo. Os dados clínicos, incluindo idade, sexo, etnia, estado clínico, estado vital, história de tabagismo, a sobrevida global e tempo de recorrência foi obtido a partir do Departamento de Cardiothoracic base de dados clínica Cirurgia. Para garantir a confidencialidade do paciente, um sistema de mediador honesto foi utilizado para fornecer conjunto de dados clínicos de-identificada ligada a amostras de tecidos [27]. tecido fresco congelado em OCT incorporado foi utilizado para a reacção em cadeia quantitativa de transcrição inversa-polimerase (qRT-PCR), e análise de Western blot. -Fixadas com formalina, (FFPE) de tecido embebido em parafina foi utilizado para imuno-histoquímica.
Análise Western Blot
A proteína foi recolhido a partir de cada grupo de tratamento linha de células por adição de tampão de lise (tampão RIPA contendo 0,1% protease mistura cocktail inibidor, 0,1% de mistura de inibidores de fosfatase Halt mistura e 1% de PMSF) e utilizando um levantador de célula. A solução foi rodado durante uma hora a 4 ° C para lisar completamente as células, em seguida, centrifugados a 12000 g a 4 ° C durante 20 minutos para separar a proteína. O sobrenadante contendo a proteína foi recolhido e quantificada utilizando BCA Pierce Ensaio (Thermofisher, Rockford, IL, 23227). Trinta e cinco ug de proteína de cada amostra foi desnaturada e resolvida por 4-20% de gel de gradiente de SDS-PAGE (Bio-Rad, Hercules, CA, 161-1159), em seguida, electrotransferidas para uma membrana Immobilon-P PVDF de nitrocelulose (Millipore Corporation , Billerica MA, IPVH08100). A membrana foi bloqueada em não-gordo 5% de leite seco em TBS-T, à temperatura ambiente durante uma hora. O anticorpo de interesse foi incubada com a membrana, a 4 ° C durante a noite, seguido de 1,5 horas de incubação à temperatura ambiente no anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano correspondente (Cell Signal, Boston MA, 7074 ou 7076, 1:3,000) anticorpo Survivina ( Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, foi utilizado SC-47750) em 1:200, caspase-3 (Cell Signal, Boston, MA, 9665) em 1:1,000, clivado-PARP (Cell Signal, Boston, MA, 9546) em 1:2,000 e β-actina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, A1978) em 1:30,000 foi utilizado como um controlo de carga. Os sinais foram desenvolvidos utilizando um reagente de quimioluminescência (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, 509049324)
quantitativa Transcrição Reversa -. Reacção em Cadeia da Polimerase (qRT-PCR)
O ARN total foi purificado a partir de linhas de células usando o Kit RNeasy Micro (Qiagen, Valencia, CA, 74004). Resumidamente, as pelotas contendo 1 × 10
6 células foram agitadas em tampão de lise RLT e o ARN foi extraído após o protocolo do fabricante utilizando um volume de eluição de 14 ul. Usando um espectrofotómetro ND-2000 (Nanodrop Technologies, Inc, Wilmington, DE), a qualidade e quantidade de ARN foi avaliada por OD
260/280. O DNA complementar (cDNA) foi reverso transcrito a partir de ARN total utilizando 3 ug de ARN em cADN de pré-mistura EcoDry num volume total de 20 ul (Clontech, Mountain View, CA, 639547) de acordo com o protocolo do fabricante. As condições de reacção foram de 42 ° C durante 60 minutos, seguido por 70 ° C durante 10 minutos, utilizando termociclador ABI Prism PCR 7900HT (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). A PCR foi realizada num volume total de 20 ul usando 600 ng de ADNc, 1 × Taqman PCR mastermix universal (Invitrogen, Grand Island, NY, EUA, 4.304.437), e 1 × Survivina ou iniciadores GAPDH (Applied Biosystems, Carlsbad, CA hs03043576_m1 e hs99999905_m1) para cada reacção. Os parâmetros dos ciclos foram: um ciclo de 95 ° C durante dez minutos, seguido de 45 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos, e 60 ° C durante um minuto, em um sistema StepOne Plus (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). Todas as reacções foram realizadas em duplicata técnicos.
A extração de RNA total a partir de tecido fresco congelado foi feito usando o Qiagen RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA 74104). Resumidamente, 10 uM secções OCT foram cortados em tampão RLT, lisadas usando uma agulha de extremidade romba de calibre 20 e o ARN foi extraído seguindo as instruções do fabricante, utilizando um volume de eluição de 50 ul. qRT-PCR foi realizada com o One-step Kit de qRT-PCR (Life Technologies, Carlsbad, CA 4310299) de acordo com as instruções do fabricante, num volume total de 20 ul usando 2 ul de lisado de tecido e 1 × Survivina ou 1 × GAPDH iniciador ( Life Technologies, Carlsbad, CA hs03043576_m1 e hs99999905_m1) para cada reacção. As condições do ciclo utilizados foram: 1 ciclo de 50 ° C durante 30 minutos, 95 ° C durante 2 minutos, e 50 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos, 60 ° C durante 45 segundos, utilizando o ABI Prism 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems , Carlsbad, CA). Todas as reacções foram feitas em triplicado técnicas. parcelas de amplificação para ambas as categorias de amostra, linhas celulares e tecidos congelados frescos foram analisados com o software StepOne, fornecida com o sistema de StepOne Além disso, para determinar o limiar de ciclo (CT). GAPDH foi utilizada para normalizar os dados de expressão. O 2 método
-ΔCT foi utilizado para determinar survivin dobrar expressão no tecido tumoral e CASE.
Imuno-histoquímica
seções FFPE foram imunocoradas para mostrar expressão survivin no tumor EAC e emparelhados amostras de epitélio escamoso . amígdalas humana reactiva e no soro não imune foram corridos em paralelo como controlos positivos e negativos, respectivamente. As amostras de tecido foram cortadas em 4 mm em lâminas carregadas e desparafinados. As lâminas foram imersas em 0,01% de Triton X-100 durante dez minutos à temperatura ambiente, enxaguadas em H
2O, então submerso em 10 mM de tampão citrato, pH 6,0 a 95 ° C durante 20 minutos para a recuperação de antigénios. O bloqueio ocorreu em 3% H
2O
2, seguido de uma lavagem com água da torneira. Depois de três lavagens de 1 × solução salina tamponada com Tris com Tween 20 a 0,001% (TBS-T), as lâminas foram adicionalmente bloqueados em soro normal de cavalo a 2,5% (Vector Laboratories, Burlingame, CA, MP7401). O anticorpo primário survivina (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, sc47750) foi aplicado a 01:50, durante a noite a 4 ° C. As lâminas foram lavadas três vezes em TBS-T, em seguida, incubadas em reagente anti-coelho ImmPress (Vector Laboratories, Burlingame, CA, MP7401) durante 30 minutos, para auxiliar na detecção de expressão de survivina. Mais uma vez, as lâminas foram lavadas três vezes em TBS-T, e desenvolvido usando IMMPACT DAB (Vector Laboratories, Burlingame, CA, SK4105).
Análise Estatística
As análises estatísticas foram realizadas utilizando software SPSS (IBM, Armonk, NY, Versão 20). Um valor de p 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Dentro de cada amostra de tecido, os valores médios de níveis de expressão de mRNA de Survivina (determinada por 2
-ΔCT método) foram avaliados em ambos os tecidos EAC tumor (nível survivin tumor) e amostras de tecido CASE (nível survivin normal). O teste t de Student foi utilizado para comparar tumor média e níveis survivinas normais. análise receiver operating characteristic (ROC) foi utilizado para determinar se os níveis de survivina pode ser utilizado para definir os grupos de alto e baixo risco de recorrência; O alto risco /limiares de baixo risco estabelecidas na ROC análises foram usadas para categorizar os pacientes de alto risco /baixo risco para ambos os níveis de survivina tecido CASE e níveis survivinas tecido EAC. análises separadas ROC foram realizadas prevendo recorrência dos níveis survivinas tecido CASE e da EAC níveis survivinas tecido. Em ambos os casos, a inspecção visual das figuras gráficos produzidos foram utilizados em conjunto com Survivin listados pontos pontuação cortado com sensibilidade e especificidade (1 menos) correspondente, a fim de determinar os limites óptimos para definir os grupos de alto e baixo risco.
Quanto o procedimento ROC para determinação do limiar, foi utilizado o método padrão de inspeção visual da curva para determinar que o ponto mais próximo do canto superior esquerdo da figura ROC, juntamente com a inspeção de valores de sensibilidade e especificidade correspondente ao longo valores disponíveis. Isto proporcionou um meio para determinar que o valor fornecido o melhor equilíbrio entre sensibilidade e especificidade. Após a inspeção das figuras ROC, esta inspeção foi relativamente simples para o caso, no entanto foi um pouco menos simples para níveis de células tumorais. Nesse caso, um valor que foi escolhido enfatizado sensibilidade à custa de especificidade, como falsos negativos foram julgadas para ser mais perigosa do que eram falsos positivos. Este confiaram mais nos valores de sensibilidade /especificidade calculados como houve uma AUC não significativa (área sob a curva) e ponto de corte de acordo com qualquer visualmente aparente.
Kaplan-Meier foi gerado para determinar a sobrevivência baseada em alta e grupos de recorrência de baixo risco. A Mantel-Cox Log Rank Test foi realizado a fim de comparar a sobrevivência global entre os grupos de risco. Um modelo de riscos proporcionais de Cox foi utilizado para avaliar a eficácia do nível de survivina dentro de ambas as amostras de casos e tecido EAC na predição de mortalidade.
Resultados
A superexpressão da survivina em linhas celulares de EAC, tumor humano e CASE tecido
expressão de mRNA de Survivina foi significativamente superior nas amostras de tumor quando comparados com amostras de tecido de casos relativos a análise qRT-PCR (Figura 2A). Em média, as amostras de tumor demonstraram níveis de expressão de survivina 3 x maior do que a do tecido PROCESSO (p . 0,00001 Figura 2B). A imuno-histoquímica (Figura 3) e análise Western blot (dados não apresentados) também confirmou a expressão de survivina tanto em tumor EAC, bem como PROCESSO
A:. QRT-PCR foi realizada para comparar a expressão de survivina entre o tumor e epitelial escamosa adjacente tecido. B: Em média, as amostras de tumor mostrou 3 × maior expressão survivin do que o tecido adjacente emparelhado
expressão Survivin foi avaliada através de coloração IHQ, tecido tumoral e epitélio escamoso adjacente mostrou presença de coloração indicativo de expressão survivin.. As setas representam coloração positiva.
A inibição da survivina em linhas celulares EAC resultou em aumento da apoptose
siRNA direcionado para survivin resultou na diminuição da expressão de survivina em OE19 e linhas celulares OE33 em relação aos controles em qRT-PCR (Figura 4A). Da mesma forma, ARNsi de incubação resultou numa regulação negativa da expressão de survivina em ambas as linhas celulares de análise Western Blot. A diminuição na expressão de survivina resultou na supra-regulação da proteína a jusante apoptótica, PARP clivada. Caspase 3 clivada foi consumido através da reacção com a PARP, resultando na regulação positiva de PARP clivada (Figura 4B)
.
linhas celulares OE19 e OE33 EAC foram transfectadas com ARNsi e expressão de survivina foi analisada entre o controlo e as linhas celulares transfectadas. Ambas as linhas celulares transfectadas com ARNsi mostraram inibição clara e regulação negativa da expressão de survivina. B: Western blot da inibição siRNA da survivina na linha de células EAC. siARN foi incubado com linhas de células OE19 e OE33 para inibir a expressão de survivina. p-actina foi utilizado como um controlo de carga. Survivina foi regulada negativamente, enquanto que as proteínas a jusante apoptóticas caspase 3 clivada e PARP clivada foram regulados positivamente. A regulação positiva de proteínas apoptóticas jusante indica a apoptose ocorre por meio de incubação com siRNA.
implicações clínicas da superexpressão survivin
Trinta e sete pacientes que foram submetidos à EAC esofagectomia para o adenocarcinoma de esôfago localizada foram incluídos no estudo (Tabela 1). As amostras composta de trinta homens (81%) e sete do sexo feminino (19%) com idades variando de 44 a 90 anos (média = 62,76; DP = 10,94). distribuição fase do estudo de coorte baseado em O Comité Misto Americana do Câncer (AJCC) estadiamento do câncer confirmado 6 pacientes com doença em estádio I, 13 com a fase II e 18 pacientes com doença em estágio III (Tabela 2). Sete pacientes receberam terapia neo-adjuvante e dezoito pacientes receberam quimioterapia adjuvante após a cirurgia. Dois pacientes no grupo de neo-adjuvante recebeu quimio-radioterapia concomitante e a maioria dos pacientes receberam platina /f luorouracilo com base quimioterapia de combinação (Tabela 3). Em um seguimento médio de 12,06 meses, treze pacientes desenvolveram recorrência, 12 pacientes com recorrência distante e 1 doente para os quais não foram comunicados dados. Dos 12 pacientes com recidiva à distância, 3 também tiveram recorrência local. Dez pacientes (77%) tinha morrido na hora de longo prazo follow-up.
análise ROC indicou que um limiar superior ou igual a 2,85 para survivin média expressão de mRNA em caso era indicativo de um maior risco de recorrência distante com uma sensibilidade de 0,77, especificidade de 0,83, e uma AUC de 0,73 (p . .05 PPV = 0,71, NPV = 0,87) (Figura 5). Assim, os doentes que exibem expressão survivin média de 2,85 ou superior em CASE foram classificados no grupo de alto risco e aqueles com níveis inferiores a 2,85 expressão foram classificados no grupo de baixo risco. Apesar de uma aparência histológica normal, a sobre-expressão survivin no CASE provou ser um indicador de recorrência distante. expressão survivin no tecido tumoral não se correlacionou com recorrência. Categorização em grupos de alto e baixo risco, usando um limiar
tumor
expressão survivin de 3,66 não prever a recorrência (p = 0,55), mas previu um aumento na probabilidade de morte por EAC (descrito posteriormente).
A probabilidade de recorrência à distância foi determinada para os níveis de survivina em tumores EAC humana e tecido epitelial escamoso adjacente. Um aumento do nível survivin no tecido epitelial escamoso adjacente estava determinado a ser um fator de risco para a recorrência distante (p = 0,02).
curvas de sobrevida de Kaplan-Meier foram gerados para os grupos de alto e baixo risco com base em CASE expressão de survivina. O grupo de alto risco demonstraram uma associação com aumento da mortalidade, embora a correlação não atingiu significância (p = 0,12, Figura 6). A análise de Kaplan-Meier para os grupos survivinas tumor alto e baixo risco obtiveram resultados semelhantes (p = 0,11).
curvas de sobrevida de Kaplan-Meier foram gerados para os grupos de alto e baixo risco com base na expressão escamoso adjacente CASE survivin epitelial. O grupo de alto risco demonstraram uma associação com aumento da mortalidade, embora a correlação não atingiu significância. A análise de Kaplan-Meier para os grupos survivinas tumor alto e baixo risco obtiveram resultados semelhantes (p = 0,11).
A Cox modelo de riscos proporcionais foi usado para avaliar a eficácia do nível de survivina dentro ambos os casos e tumor EAC amostras de tecido na predição de mortalidade. Outros fatores de risco considerados foram idade no momento da esofagectomia, o uso do tabaco (em embalagens por ano), o consumo de álcool, e uma história de esôfago de Barrett (Tabela 4). Fumar foi associado com uma maior taxa de morte (p = 0,06) com as probabilidades de mortalidade sendo 1.018 maior para cada pacote por ano fumado. Survivina expressão em tecido de tumor foi associada a maior risco de morte (p = 0,05). A probabilidade de um paciente no grupo survivin tumor de alto risco experimentar a morte foi 5,23 vezes maior do que a de um paciente categorizado no grupo de baixo risco (p 0,05)
Discussão
.
os estudos mostraram níveis mais elevados de survivina em epitélio metaplásico e epitélio displásico de Barrett em comparação com tecido escamoso apoiando assim a hipótese de que a sobre-regulação deste gene é provável um evento precoce que precede o desenvolvimento de adenocarcinoma [12]. Os relatórios também têm apoiado survivina como um potencial biomarcador de carcinoma epidermóide de esôfago [28], mas não há evidências conflitantes sobre o seu papel prognóstico em adenocarcinoma de esôfago [29]. Em um estudo realizado por Rosato e colegas, expressão survivin não tinha valor prognóstico para pacientes com EAC. [9] O objetivo do estudo foi avaliar o papel deste gene anti-apoptótica em maior profundidade no adenocarcinoma esofágico e CASE tendo em heterogeneidade tumor consideração, bem como a expressão de mudanças genéticas antes da manifestação histológica do fenótipo tumoral no epitélio adjacente .
Análise do tecido humano usando IHC, Western blot e qRT-PCR confirmou a regulação positiva da survivina no tecido tumoral EAC comparação com CASE. Nossos resultados estabeleceram que o aumento da expressão survivin no tecido tumoral EAC é um fator de risco para a morte com o grupo survivin tumor de alto risco de ser 5 vezes mais probabilidade de morrer do que aqueles classificados no grupo survivina de baixo risco. É possível que a expressão mais elevada no interior do tecido do tumor EAC podem estar relacionados com a agressividade do tumor (isto é, piora da desregulação celular), por conseguinte, correlacionando-se com a mortalidade. No entanto, com base em nossa amostra, este estudo é susceptível de fraca potência e maior série de pacientes seriam necessários para estudar essas associações ainda mais.
Além disso expressão de survivin no caso não foi completamente ausente, como seria de esperar para o terminal epitélio escamoso normal diferenciada [10], [11]. Considerando-se provas que demonstram a regulação positiva deste gene em metaplásico pré-maligna e epitélio colunar displásico, os nossos dados sugerem que a survivina pode ser sobre-expressão genética de um evento precoce, ocorrendo nos histologicamente normais aparecendo epitélio escamoso antes do desenvolvimento de metaplasia e transformação de adenocarcinoma. Embora a mucosa adjacente ao tumor mantém diferenciação escamosa, que abriga a sobre-expressão desse gene anti-apoptótica que poderia ser um potencial condutor de tumorigénese. Alternativamente, pode ser postulado que baseada na correlação com recorrência, a expressão de survivina em caso pode ser considerado como o equivalente molecular de uma margem positiva e /ou um indicador de recorrência distante. Se os níveis de survivina elevados em caso representa evidência molecular que o tecido adjacente está mostrando sinais de malignidade, o prognóstico pode ser pior do que o previsto pelo sistema de classificação pTNM. Pode ser postulado que o fato de que não houve um aumento da mortalidade em pacientes com níveis elevados de survivina em caso poderia representar um erro de tipo II secundária ao pequeno tamanho da amostra. Maiores estudos podem ajudar a esclarecer estas associações
O fato de que a expressão survivin no tumor não se correlacionou com recorrência poderia ser a partir do fato de que esses pacientes tinham morrido antes de recorrência poderia ter sido documentado.; Esta suposição é apoiada pelo fato de que havia mais pacientes com doença estágio avançado no grupo de expressão tumor de alto risco. Além disso, como evidenciado a partir de estudos anteriores, cada tumor apresenta uma heterogeneidade significativa com as variações intra-tumorais em mutações somáticas, composição alélica, supressor de tumor e desregulação oncogénica [30]. A predominância de vários clones originais no tecido tumoral amostrado pode conduzir a resultados inconsistentes ao realizar perfis moleculares de um determinado cancro. No presente estudo, a mudança vezes em ARNm de survivina foi altamente variável no tecido do tumor em comparação para caso, e isto pode reflectir a heterogeneidade do tumor e fornecem uma potencial explicação para a falta de correlação com a recorrência do tumor. CASE demonstraram níveis mais consistentes e é talvez um melhor substrato para a avaliação da survivina como um marcador de prognóstico em pacientes com EAC. Estes dados sublinham a necessidade de um esforço concertado para o banco e analisar histologicamente o tecido aparentemente normal câncer de-adjacente, para a criação de perfil molecular na EAC e talvez outros tumores.
análise de linha de celular no presente estudo confirmou a inibição clara de survivina através de transfecção com siRNA. Survivina foi regulada negativamente de forma eficaz e caspase 3 foi consumido na reacção que conduz à regulação positiva de PARP clivada, indicando que a inibição da survivina conduz à activação da via apoptótica. Como survivina não é expresso no tecido normal, que é, potencialmente, um alvo ideal para novos agentes [10], [11]. Portanto, a inibição efectiva através de siRNA com a ativação a jusante da apoptose suporta a validade dos ensaios clínicos futuros na EAC avaliar a eficácia de um novo agente que usa siRNA ou outras vias inibidoras [10].
Em conclusão, os atuais suportes de estudo upregulation da survivina como um potencial início de mudança genética na EAC ocorrendo em CASE aparecendo normal. expressão survivin no tecido EAC foi um preditor significativo de mortalidade, enquanto o nível de survivina em CASE expressão foi um preditor mais confiável de recorrência do tumor. Além disso, também demonstraram que a inibição da survivina em linhas celulares EAC leva à sobre-regulação da apoptose apoiando ainda mais a avaliação de estratégias terapêuticas direccionadas para este marcador.
As limitações do estudo incluem o pequeno tamanho da amostra e uma duração relativamente curto de acompanhamento. Novos estudos com amostras maiores e mais longos acompanhamento pode ajudar a esclarecer algumas das associações observados em estudos sobre a expressão survivin na EAC e CASE. Isso também ajudaria controle para mais fatores que impactam a recorrência e sobrevivência em pacientes com EAC.
Reconhecimentos
Dr. James D. Luketich por seu apoio ao estudo.