Sumário

As células cancerosas responder ao estresse ativando uma variedade de vias de sobrevivência sinalização. Proteína Adam (ADAM) 9 é regulada durante a progressão do cancro e terapia hormonal, funcionando em parte através de um aumento de espécies reativas de oxigênio. Aqui, apresentamos

in vitro

e

em evidência vivo

que a segmentação terapêutica da expressão do gene ADAM9 por RNA entregues por lentivírus pequena hairpin (shRNA) proliferação significativamente inibido de linhas celulares de cancro da próstata humano e bloquearam crescimento do tumor num modelo murino de cancro da próstata metástase óssea. estudos do ciclo celular confirmou um aumento na fase G1-e diminuição da população em fase S de células de cancro, sob condições de stress de fome, o que se correlacionou com os níveis intracelulares elevados de superóxido. dados de microarranjos mostraram diminuição dos níveis de regeneração membro da família derivados do ilhéu expressão 4 (REG4) em células de câncer de próstata com knockdown da expressão do gene ADAM9 significativamente. Esta regulação baixa REG4 também resultou na indução da expressão da p21

Cip1 /WAF1, que regula negativamente a ciclina D1 e bloqueia a /transição G1 S. Nossos dados revelam um mecanismo molecular novela de ADAM9 na regulação da proliferação de células de câncer de próstata, e sugere uma modalidade combinada de terapia genética ADAM9 shRNA e agentes citotóxicos para refractário hormonal e câncer de próstata metastático ósseo

Citation:. Liu CM , Hsieh CL, Ele YC, Lo SJ, Liang JA, Hsieh TF, et al. (2013) In Vivo Segmentação da expressão do gene ADAM9 Usando Lentivírus entregue shRNA Suprime Prostate Cancer Crescimento regulando REG4 progressão do ciclo celular dependentes. PLoS ONE 8 (1): e53795. doi: 10.1371 /journal.pone.0053795

editor: Irina U. Agoulnik, Universidade Internacional da Flórida, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de setembro de 2012; Aceito: 03 de dezembro de 2012; Publicação: 16 de janeiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Liu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por NSC99-2320-B-039-029-MY3 do Conselho Nacional de Ciência, Taiwan (https://web1.nsc.gov.tw); INDH-EX99-9902BI, INDH-EX100-9902BI e INDH-EX101-9902BI of National Health Research Institute, Taiwan (https://www.nhri.org.tw). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

ocorrendo em mais de 80% dos casos de câncer de próstata em estágio avançado, metástases ósseas correlaciona-se com um alto nível de morbidade; uma taxa de sobrevida de 5 anos de 25% e sobrevida média de aproximadamente 40 meses [1]. metástases ósseas, devido ao desenvolvimento da dor óssea, fracturas ósseas associadas a cancro e de compressão da coluna vertebral, bem como a neuropatia craniana, anemia e infecção, pode comprometer significativamente a qualidade de vida de doentes com cancro da próstata [2], [3]. Atualmente, a privação de andrógeno é a primeira linha de tratamento para câncer de próstata metastático; No entanto, o cancro da próstata, muitas vezes, progredir para uma fase de osso metastático independente de androgénios. Uma vez que esta progressão ocorre, quimioterapia e radioterapia são as principais opções terapêuticas, sendo que ambos causam efeitos colaterais desagradáveis ​​e apenas fornecem um benefício limitado à quantidade e qualidade de vida [4]. Por isso, é importante prosseguir novos fatores terapêuticos que podem ter o potencial de melhorar a sobrevida de pacientes com refractário hormonal e câncer de próstata metastático ósseo.

Apesar dos recentes avanços em estratégias terapêuticas, muitos cancros malignos ainda desenvolver resistência à radiação e terapias direcionadas [5], [6]. Resistência ocorre como um resultado da resposta ao estresse, permitindo que as células malignas para superar o efeito citotóxico de muitas terapias [7]. Proteína Adam (ADAM) 9 é um importante membro de uma família de genes desintegrina e metaloproteinase. As proteínas codificadas por esta família medeiam as respostas celulares a stress ambiental por interagir com uma variedade de proteínas da superfície das células e que regula diversos processos celulares, incluindo a proliferação, de ligação extracelular da matriz, e o ectodomínio derramamento [8] – [12]. trabalho anterior feito pelo nosso grupo [13] e outros [14] têm demonstrado em estudos clínicos que os níveis mais elevados ADAM9 se correlacionam com um curto período de remissão do cancro da próstata. Nós também demonstrou uma correlação significativa entre tumor ADAM9 coloração eo risco de recorrência e morte por câncer de próstata em pacientes submetidos à terapia hormonal, sugerindo que um aumento progressivo na expressão ADAM9 poderia ser usado como um biomarcador para prognóstico em pacientes com câncer de próstata após terapia hormonal [15]. Além disso, knockdown de ADAM9 expressão resulta no aumento da radiossensibilidade e quimio-sensibilidade a agentes terapêuticos [16], que indica que a sobre-expressão por ADAM9 células cancerosas pode ser mecanismo de escape potencial para vencer a morte de células de cancro induzida pelo stress; No entanto, pouco se sabe sobre os mecanismos de regulação a jusante, através da qual ADAM9 promove a sobrevivência de células cancerosas em resposta ao estresse. Desde expressão ADAM9 elevada é observada em muitos tumores avançados, isto levanta a possibilidade de que ADAM9 pode ser um potencial biomarcador para terapia de gene do cancro alvo, embora mais pesquisas são necessárias.

No presente estudo, avaliamos a viabilidade de vetor lentiviral-entregue pequeno ARN de gancho de cabelo (shRNA) contra ADAM9 para o tratamento de andrógeno-independente e cancro da próstata humano metastático do osso num modelo animal experimental. O mecanismo molecular subjacente à ação terapêutica da ADAM9 terapia-alvo gene também foi elucidada.

Materiais e Métodos

Materiais

Foram obtidos vetores retrovirais contendo shRNA que tem como alvo ADAM9 e controle shRNA da Open Biosystems (Lafayette, CO). Lentiviral vector ADAM9 shRNA e controles foram obtidos a partir da Unidade Nacional de RNAi Núcleo do Instituto de Biologia Molecular /Genomic Research Center, Academia Sinica, Taiwan. Os anticorpos anti-ADAM9 foram obtidos a partir de R D Systems (Minneapolis, MN). EF1-α anti-humano obtido da Millipore (Billerica, MA) foi utilizado como um anticorpo de controlo.

Cell Cultures

A linha de células metastática do cancro da próstata independente de androgénios, PC3 e dependentes de androgénios a linha de células de cancro da próstata, LNCaP, foram usadas em estudos anteriores [13], [17] e cultivadas em t-forma (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado com 5% de soro fetal de bovino inactivado pelo calor (FBS) (Hyclone, Logan, UT), 50 UI /ml de penicilina e 50 ug /mL de estreptomicina (Invitrogen) e mantidas em 5% de CO

2 a 37 ° C.

vectores e RNA de interferência

O retroviral plasmídeo pSM2C e shRNA específico para ADAM9, assim como o plasmídeo de controlo e pGIPZ shRNA especificamente REG4 segmentação foram obtidos a partir abertas Biosystems. O lentiviral pLKO, controlar shGFP e shRNA alvo o mRNA da sequência de codificação ADAM9 foram obtidos a partir da Unidade Nacional de RNAi Núcleo do Instituto de Biologia Molecular /Genomic Research Center, Academia Sinica, apoiado pelo Programa de Pesquisa Nacional de Medicina Genômica Bolsas de NSC (NSC 97-3112-B-001-016). informações de destino é listado na figura S1. Estes vectores shRNA foram construídos através da inserção de oligonucleótidos emparelhados que contêm a sequência de shRNA em EcoRI e AgeI locais a jusante do promotor U6 no vector pLKO.1. lentivírus recombinante portador shRNA foi produzido por co-transfecção de células 293FT com uma mistura de ADN de plasmídeo consistindo de PMD-G (VSV-G de envelope), pCMV-ψR8.91 (gag /pol /Rev), e vectores de pLKO /1-shRNA utilizando o reagente TurboFect (Fermentas, Glen Burnie, MA) de acordo com as recomendações do fabricante. Os sobrenadantes de cultura que contém o vírus foram recolhidas 2 dias após a transfecção e utilizados para infectar PC3, células LNCaP, células e RCC52 em combinação com 8 ug /ml de polibreno (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). As linhas celulares estáveis ​​foram seleccionados por cultura de células em 2,5 ug /ml de puromicina (Calbiochem, La Jolla, CA), durante uma semana. Western Blot, FACS, ou qPCR foi usada para determinar os efeitos da expressão do gene knockdown.

Detecção de Proteína

extractos de proteína a partir das linhas de células foram analisados ​​em géis de SDS-poliacrilamida (15 ug por pista ) e transferidos para membranas de nitrocelulose de ECL Hybone (GE Healthcare das ciências da vida, Piscataway, NJ). As membranas foram sondadas com anticorpo monoclonal de ratinho anticorpos anti-humanos contra ADAM9 (R D systems), p21, e p27 (simpática oferta do Dr. Yun-pulmão Yu na China Medical University Hospital) de acordo com as instruções do fabricante. ligado celular BT474 (as células foram tratadas com 500 nM de doxorubicina dia para o outro) foi obtido do Dr. Wei-Chien Huang na China Medical University Hospital. Para controlo de carga, as manchas foram sondadas com um anticorpo anti-EF1 α monoclonal (1:10,000; Millipore). Após a incubação com um anticorpo conjugado com HRP secundário (1:5000; GE Healthcare Life Science), sinais quimioluminescentes foram detectados utilizando um kit ECL Plus e as transferências foram expostos a Hyperfilm ECL (GE Healthcare Life Science). banda de proteína quantificação foi realizada usando software ImageJ (https://rsbweb.nih.gov/ij/, NIH, Bethesda, EUA).

Medição de Espécies Reativas de Oxigênio

As células foram semeadas em pratos a 70-80% de confluência e fome durante a noite. Para a análise de quantificação, as células foram tripsinizadas, centrifugadas e ressuspensas em HBSS com ou sem FBS a 5% (dependendo se eles foram expostos a radiação ou inanição). O peróxido de hidrogénio foi detectada utilizando dichlorofluorescindiacetate (DCF, 2 uM) (Invitrogen). Superóxido foi detectada utilizando dihydroethidium (DHE, 10 uM) (Invitrogen). imagiologia superóxido foi detectado utilizando o indicador vermelho MitoSox mitocondrial dismutase (Invitrogen). As amostras foram incubadas durante 40 min à temperatura ambiente no escuro num agitador rotativo. Análise de DCF e DHE de fluorescência foi realizada utilizando um FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA) de acordo com as instruções do fabricante. For Imaging mitocondrial geração de superóxido, as células foram privadas durante 24 horas, seguido de carregamento com MitoSOX Vermelho, Alexa-488 WGA e DAPI (Invitrogen) durante 30 min e visualização sob um microscópio de fluorescência.

Proliferação celular Assay

o efeito de ADAM9 shRNA sobre a proliferação celular foi medida por contagem directa do número de células. Resumidamente, as células foram plaqueadas a uma densidade de 1 x 10

5 em 60 mm de prato. Às vezes designadas, as células foram removidas por tripsinização, e o número de células viáveis ​​foi contado num hemocitómetro com o uso de azul de tripano (0,4%) de coloração.

Ensaio clonogénico

Pela ensaio de proliferação de células clonogénicas, suspensões de células foram preparadas por tratamento com 0,25% de tripsina e 0,05% de EDTA. Depois de calcular a concentração de células utilizando um hemocitómetro, as células 100 foram semeadas em placas de 6 poços com FBS t-médio e 5% durante 2 semanas. O número de colónias em cada poço foi determinada através da contagem do número de células em cada colónia. Somente colônias com ≥50 células foram definidas como bem sucedida. Para identificar as colónias, o meio foi retirado e 3,7% de formaldeído foi adicionada durante 15 minutos, seguido por incubação em 1 ml de violeta de cristal durante 15 minutos à temperatura ambiente. imagens de colónias foram tomadas e número de células calculadas usando ImgaeJ.

Transwell Invasion Ensaio

A capacidade de invasão das células cancerosas foi avaliada utilizando 24 poços, placas Transwell (Corning, Lowell, MA). Resumidamente, 2 × 10

5 as células em meios contendo 0,5% de FBS foram adicionados à câmara superior contendo 8 uM de poro de policarbonato revestidos com 1 mg /mL de matrigel; a câmara inferior foi preenchida com meio contendo 5% de FBS. Após 16 h de incubação, a superfície superior da membrana foi esfregado com um cotonete. As células invasoras sobre a superfície inferior da membrana foram fixadas e coradas com violeta de cristal a 0,5%. campos aleatórios (5 por membrana) foram fotografadas em ampliação de 40x para o cálculo do número de células. Além disso, as células foram quantificadas através da medição da absorvância de extractos de corante a 570 nm, em 100 ul de solução de Sorenson (9 mg Citrato tirsodium, 305 mL de água destilada, 195 mL de HCl 0,1 N, 500 mL de etanol a 90%).

cicatrização de feridas Ensaio

células ressuspensas em meio de cultura foram semeadas em placas de 24 poços. Uma única ferida foi criada no centro da monocamada celular por remoção suave das células associadas com uma ponta de pipeta de plástico estéril após a culturas de células atingiu ≥90% de confluência. Os detritos foram removidos por lavagem com meio isento de soro. Células que migraram para a área de feridos ou aqueles que se projeta da borda da ferida foram visualizados e fotografados em um microscópio Zeiss Axioplan (Carl Zeiss MicroImaging, Thornwood, NY) com um objectivo de 10 × em cinco pontos pré-selecionados de tempo (0, 2, 4 , 6, e 8 horas). Cada experiência foi realizada de forma independente, pelo menos, três vezes.

imuno coloração

Cinco micron secções de tecido embebidos em parafina de espessura foram desparafinados e reidratadas. As secções de tecido foram incubadas durante 2 horas com anticorpo anti-humano ADAM9 monoclonal de ratinho (diluição 1:50, R D Systems). Após lavagem para remover o anticorpo primário não ligado, as secções foram tratadas com uma espinha dorsal de polímero de dextrano conjugado com anticorpos secundários e marcado com peroxidase de rábano de acordo com as instruções do fabricante (sistema de DAKO Envision para anticorpos de ratinho e primários de coelho, DAKO Corporation, Carpinteria, CA) durante 30 minutos . As secções de tecido foram incubadas em substrato cromogénico da peroxidase, diaminobenzidina, durante 5 minutos; em seguida, as secções foram contrastadas com hematoxilina de automação (DAKO) durante 15 minutos. A especificidade da marcação por este processo foi verificada por meio de reacções de controlo negativo utilizando tampão para substituir o anticorpo primário e IgG específicos de isotipo. coloração Masson foi realizada utilizando o kit de tricromo de um Masson (Sigma-Aldrich) seguindo o protocolo padrão fornecido pelo fabricante.

resistente ao tartarato fosfatase ácida (TRAcP) Coloração de osso

A imunocoloração com TRAcP foi realizada de acordo com o protocolo do fabricante (Takara Bio Inc., Shiga, Japão). Resumidamente, as secções de osso de rato tíbia embebidos em parafina foram desparafinados e reidratadas para a reação Trac Posteolytic. As secções de osso foram incubadas com a solução de substrato (0,1 volume de tartarato de sódio em naftol-AS-BI-fosfato de solução /Fast Red Violet LB substrato, pH 5,2) a 37 ° C durante 45 minutos. Após lavagem da lâmina com água destilada e a adição de glicerol para evitar a desidratação, as amostras foram examinadas ao microscópio.

Determinação do teor de ADN celular por análise FACS

As células cancerígenas foram plaqueadas a 1 × 10

6 células por placa de 100 mm e fome durante 24 ou 48 horas. As células foram tryspinized e submetido a análise do ciclo celular utilizando iodeto de propídio como descrito anteriormente [18]. O conteúdo de DNA relativa dos núcleos foi medida por FACSCalibur (BD Bioscience).

In Vivo

xenoenxertos Models

Cinco semanas de idade do sexo masculino atímicos nu (nu /nu ) obtidos a partir de ratinhos Centro Nacional de animais de Laboratório em Taiwan foram usadas para administração subcutânea (SC), intracardíaca, e a implantação do tumor intratibial. As células foram cultivadas até 100% de confluência, tripsinizadas e enumeradas. Os ratos foram sedados com 1,7% de isoflurano misturado com o ar para s.c implantação do tumor. tumores de xenoenxerto foram estabelecidas por s.c injecção de 10

6 células PC3 que expressam células pSM2c ou shADAM9 em 100 ul de PBS em ambos os lados de cada ratinho. Os animais foram sacrificados ao fim de 8 semanas. Não houve diferenças significativas do peso do corpo entre os animais com e sem s.c. tumores no momento do sacrifício. Para a injecção do tumor intratibial, uma agulha de calibre 27 foi utilizado para perfurar um orifício no interior da cavidade da medula, através do planalto tibial em ambas as tíbias direita e esquerda. A 28-gauge seringa Hamilton foi usada para injectar 5 × 10

5 células em um volume de 50 uL para dentro da cavidade da medula. O crescimento do tumor foi monitorado por raios-X, tanto bioluminescência e uma vez por semana. Os animais foram sacrificados ao fim de 8 semanas. Tíbias foram removidas, lavadas em PBS e fixadas em 10% de formaldeído à temperatura ambiente durante 24 h. amostras de osso foram lavadas com PBS seguido de descalcificação com 0,25 M de EDTA em PBS (pH 7,4) à temperatura ambiente durante 6 semanas. As soluções de descalcificação EDTA foram mudadas semanalmente. O crescimento do tumor foi monitorizado semanalmente utilizando um sistema de imagem de bioluminescência (Xenogen IVIS série 200, Caliper, Hopkinton, MA).

Extração de RNA e DNA Microarray Analysis

O ARN total foi isolado a partir de células cultivadas (Roche Applied Science, Mannheim, Alemanha) seguindo o protocolo do fabricante. As amostras de RNA purificados foram submetidos a Phalanx Biotech para a análise microarray usando o v5 Whole Human Genome OneArray® Microarray (Biotech Grupo Phalanx, Inc., Hsinchu, Taiwan). Cada microarray contém 29.187 sondas genoma humano e de 1088 sondas de controlo experimentais. descrição detalhada dos procedimentos de microarrays e gene listas de sondas estão disponíveis a partir https://www.phalanxbiotech.com/tech_support/general.php.

A sobre-expressão de REG4

A região de codificação REG4 comprimento completo foi amplificado por PCR utilizando os iniciadores listados em Materiais e Métodos S1, e subclonado em pcDNA3.1 (Invitrogen) vectores p3XFLAG-CMV-7.1 (Stratagene, Santa Clara, CA) ou. As construções foram transfectadas transientemente REG4 em PC3

shADAM9 utilizando lipofectamina 2000 (Invitrogen) seguindo o protocolo padrão. REG4 overexpressed foi confirmada por imunotransferência (R D System). REG4 secretada no meio condicionado foi recolhido e concentrado utilizando Centricon YM-3 filtros de centrifugação (Millipore).

Declaração de Ética

Os estudos com animais foram realizados em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pelas diretrizes Institucional e de um Comité da China University Medical Research animal foi seguido para os estudos com ratos (IACUC # 99-68-N). Todos cirurgia foi realizada sob Zoletil (tiletamina-zolazepam) a uma dose de 20 mg /kg de anestesia por injecção intraperitoneal, e imagem de bioluminescência foi feita sob anestesia por controlo Isoflurance. Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.

Análise Estatística

Todos os dados do

in vitro

estudos são apresentados como a média ± SD. As diferenças entre grupos foram analisadas utilizando

t-teste de Student of the bicaudal, ou como indicado na legenda da figura. A

valor p

inferior a 0,05 foi considerado significativo. Nos estudos com ratos, o teste de soma classificação Mann-Whitney foi utilizado para análise.

Resultados

Knockdown de ADAM9 Expressão Diminuição do cancro da próstata Proliferação celular

Para validar o papel de ADAM9 na progressão do cancro da próstata, nós reprimidos de forma estável expressão ADAM9 em, óssea metastática PC3 células cancerosas da próstata andrógeno-independente e células cancerosas da próstata LNCaP andrógeno-dependentes com vetores retrovirais quer ou lentivírus transportando shRNA específicos de ADAM9. O resultante ADAM9 linhas celulares PC3 knockdown

shADAM9 e LNCaP

shADAM9, que mostrou uma redução de aproximadamente 88% e 76%, respectivamente, na expressão da proteína ADAM9 quando comparado com qualquer um vector vazio (pSM2C vector retroviral) ou shRNA controle (lentiviral- shGFP) (Fig. S2), foram seleccionados para o estudo seguinte. Um ensaio de proliferação de células de curto prazo de 3 dias indicou que tanto PC3

shADAM9 (Fig. 1a) e LNCaP

shADAM9 (Fig. 1b), as células exibiram uma diminuição significativa na proliferação celular. Este atraso no crescimento de células de knockdown ADAM9 foi ainda confirmada por ensaios clonogénicos em que uma redução de 40-50% no

shADAM9 células PC3 foi observada após 2 semanas de cultura de células (Figs. 1C e 1D).

a proliferação celular diminuiu a partir de 2 dias após a sementeira (1 × 10

4 células /cavidade) de ADAM9-knockdown PC3 (a) e LNCaP (b) (* teste t de Student,

P

≤0.05) . (C) clonogénicos ensaios de proliferação celular de PC3, PC3

shGFP, PC3

pLKO e PC3

shADAM9-46978 revelou diminuição colônias no PC3

shADAM9-46978. (D) Quatitative análises de estudos clonogénicas demonstraram que o número de colónias de células foi menor no knockdown lentiviral de expressão ADAM9 em comparação com o tipo selvagem, simulada infectados, e os controlos não-alvo (** Teste t de Student,

p

≤0.001).

para avaliar a diferença de crescimento entre células cancerosas ADAM9-proficientes e ADAM9 com deficiência nos ossos, o local metastático primário para câncer de próstata, marcado-luciferase PC3

shGFP e PC3

shADAM9 intratibialmente foram injectados no mesmo ratinho nu, mas em diferentes pernas (Fig. 2-a, n = 10). Os dados de imagem bioluminescentes colectivos mostraram que a incidência de PC3

desenvolvimento do tumor shGFP foi de 80%, e os tumores foram detectados logo aos 15 dias pós-injecção. Em contraste, apenas 10% dos ratos tíbias injectados com PC3

shADAM9 teve crescimento tumoral detectável. A intensidade de bioluminescência foi de aproximadamente um log mais baixa do que a maior parte do PC3

shGFP tumores em 40 dias pós-injecção (Fig. 2b). Um resultado semelhante foi também obtido com xenoenxertos subcutâneos (Fig. S3), o que indica um papel importante de ADAM9 na proliferação de células cancerosas da próstata e o crescimento do tumor.

(a) PC3

shGFP e PC3

shADAM9 foram injectadas na tíbia esquerda e direita do mesmo ratinho (n = 10). (B) imagem de bioluminescência em 40 dias pós-inoculação. setas pretas mostram o único sinal detectado em um

lesão óssea PC3 shADAM9. (C) a digitalização radiográfica computadorizada da área da lesão. imagem superior: destruição óssea é extensa na perna esquerda em comparação com a perna direita; imagem inferior: Rato com uma lesão óssea destrutiva na perna esquerda e nenhuma lesão na perna direita. (D) de imagem histológica que mostra que o osso trabecular e cortical foi substituído pelo PC3

shGFP tumor. Em contraste, trabecular e cortical óssea ainda estava intacta no PC3

tumor shADAM9 (H E). coloração Masson indicada apenas vestígios de ossos deixados no PC3

shGFP comparação com PC3

tumores shADAM9 (Tricromio). (E) Análise de TRAcP da actividade dos osteoclastos. A seta indica osteoclastos observados em um

tumor shGFP PC3. destaque vermelha indica loci de 40 × ampliação.

ADAM9 silenciamento gênico Diminuição in vivo osteolíticas lesões ósseas causadas por PC3 tumores em ratos

Uma vez que, as células PC3 são conhecidas para induzir lesões ósseas

in vivo

, determinou-se o knockdown de expressão ADAM9 poderia atenuar a reabsorção óssea induzida por tumor. digitalização radiográfica computadorizada das pernas afectadas revelou defeitos ósseas osteolíticas graves na tíbia esquerda (injectados com PC3

shGFP), ao passo que a massa parecia normal na tíbia direita (injectados com PC3

shADAM9) (Fig. 2c). coloração tricromo de Masson de perna esquerda confirmou que o osso trabecular e cortical na metáfise tibial proximal tinha sido destruído, e a cavidade da medula tinha sido substituído por tumores. Em contraste, os trabecular e cortical ossos permaneceu intacto no PC3

shADAM9-injetada tíbia direita e, com exceção de um incidente em que os sinais de bioluminescência fracos tinham tumores comparativamente pequenos no espaço da medula com destruição óssea leve (Fig. 2d). Além disso, o número e a extensão dos osteoclastos maduros na interface-tumor ósseo de PC3

tíbias shGFP-injectadas foram muito mais elevados do que os dos PC3

tíbias shADAM9-injectados, tal como determinado por fosfatase ácida resistente a tartarato (TRAcP) coloração (

P

0,01). (Fig. 2E), indicando que silenciar a expressão de ADAM9 reduzida a capacidade de células de cancro da próstata para induzir osteoclastog�ese no osso

expressão de segmentação por ADAM9 Entrega intratumoral de shRNA Suprime Crescimento da próstata câncer em camundongos

para examinar se a inibição mediada shRNA de expressão ADAM9 representa uma estratégia promissora para a terapia genética do cancro da próstata, células PC3 foram inoculadas por via subcutânea em ambos os flancos de ratinhos nus. Os tumores foram deixados crescer para um tamanho de cerca de 200 mm

3. Dez dos quinze ratos que tinham tumores PC3 em ambos os flancos foram selecionados para receber a injeção intra-tumoral de 1 × 10

5 lentivirais ufc (LV) transportando shGFP (flanco local da esquerda) ou shADAM9 (direita local do flanco) semanais para um total de 6 semanas (Fig. 3a), e os restantes 5 ratos serviram como controlos recebendo injecções de PBS. Diminuição do crescimento do tumor da próstata foi observado em tumores tratados com VE-shADAM9 em comparação com os tratados com VE-shGFP ou PBS (Fig. 3b). O tamanho médio do tumor após 6 semanas de tratamento com PBS ou LV-shGFP foi 782,7 ± 174,6 mm

3 e 1027 ± 272.2 mm

3, respectivamente. Por contraste, o tamanho de tumores tratados com a terapia de VE-shADAM9 foi 135,9 ± 72,4 milímetros

3. O nível de expressão ADAM9 foi diminuída em tumores tratados com a terapia LV-shADAM9, como confirmado por ambos coloração de tecidos (Fig S4D-f.) E immunoblotting (Fig 3c;.

p

≤0.05).

(a) Esquema de ADAM9 experimento terapia knockdown. Os ratinhos foram injectados subcutaneamente com células PC3 em ambos os flancos, e o tamanho do tumor foi medido duas vezes por semana até que o tamanho atingiu cerca de 200 mm

3. Os ratos receberam então injecções de PBS em ambos os locais de tumor (n = 5) ou lentivírus shGFP no tumor do lado esquerdo e shADAM9 para o lado direito (n = 10). Os vírus foram injectados e os tumores medidos semanalmente durante 6 semanas consecutivas. (B) Após a terapia shADAM9, volumes de tumor não aumentou em comparação com a terapia shGFP ou controlos de PBS (**

p

≤0.01,

t

teste de Student). (C) ensaio de imunotransferência da expressão confirma ADAM9 diminuição da expressão ADAM9 após a terapia shADAM9. EF-1α foi usado como um controle de carga (*

p

≤0.05; **

p

≤0.01,

t

teste de Student). (D) Análise estatística de coloração de Ki67. terapia shADAM9 diminuiu significativamente atividades de proliferação celular em tumores PC3. PBS e terapia shGFP não mostrou nenhuma diferença no índice de proliferação (**

p

≤0.001, One Way ANOVA). (E) A análise estatística da coloração TUNEL não apresentou diferença significativa (NS) entre terapias (

p

≥0.05, One Way ANOVA).

Para determinar as respostas celulares associadas a LV -shADAM9 terapia, a proliferação do tumor (Ki-67, Fig. S4g-i) e apoptose marcador de coloração (índice de TUNEL, a Fig. S4j-l) de secções de tumor foram realizadas. Nós não encontrou uma diferença significativa entre o número de células em apoptose nos controles e LV-shADAM9 (Fig. 3e e Fig. S4j-l). Em contraste, o tratamento com VE-shADAM9 resultou numa diminuição drástica do número de células-Ki-67 positivos em relação a ambos PBS e tratamentos LV-shGFP (Fig. 3D e a Fig. S4g-i). Estes dados demonstram que

In vivo

entrega de VE-shADAM9 regride eficazmente o crescimento do tumor por inibição da proliferação de células, em vez de a indução de morte celular apoptótica.

knockdown ADAM9 induz a paragem do ciclo celular em G1 /S Transição sob estresse Condições

Para delinear ainda mais o mecanismo de inibição do crescimento do tumor induzida por terapia LV-shADAM9, a distribuição do ciclo celular entre PC3 ADAM9-proficientes

shGFP e PC3 ADAM9 deficiente

células shADAM9 cultivadas sob condições suplementado com soro (FBS a 5%) de soro-fome ou foram analisados. Enquanto PC3

shGFP e PC3

shADAM9, sob condições normais, não mostraram uma mudança nos perfis do ciclo celular, a população em fase S foi significativamente diminuída com o tempo (de 24 a 48 h) em PC3 privadas de soro

células shADAM9, em comparação com a de PC3

shGFP. Esta redução foi acompanhada pelo aumento da percentagem de células na fase G1 (Fig. 4a). Um resultado semelhante foi obtido usando células LNCaP (Fig. 4B). Além disso, immunoblotting estudos de G1 /proteínas relacionadas com a transição S revelou um nível significativamente mais elevado de p21

Cip1 /WAF1. Além disso, um baixo nível de ciclina D1 foi induzida em PC3

shADAM9 que em PC3

shGFP sob condições de privação de soro (FIG. 4C). Apesar de privação de soro não causou nenhuma alteração no nível de p27 expressão

KIP1 em qualquer PC3

shADAM9 ou PC3

shGFP, o nível basal de p27

KIP1 foi maior no PC3

shADAM9 . Tomados em conjunto, estes resultados indicam que a exposição de PC3

shADAM9 ao soro inanição induz uma paragem do ciclo celular G1. expressões aumentadas de p21

Cip1 /WAF1and p27

KIP1 também foram detectados em LNCaP

shADAM9 em condições de cultura normais (Fig. 4d).

A fome reduziu a população de células em fase S em ADAM9 knockdown células cancerosas em comparação com a dos controlos em PC3 (a), LNCaP (b). (C) Os níveis de expressão de p21

Cip1 /WAF1, p27

KIP1, e ciclina D1 aumentou em células shADAM9 sob condições de estresse de fome em células PC3. (D) Os níveis de expressão de p21

Cip1 /WAF1 e p27

KIP1 aumentou em LNCaP

shADAM9 sob condições normais e de fome.

Devido à nossa constatação anterior que ADAM9 é uma proteína de stress-sensível que pode apoiar a sobrevivência das células do câncer de próstata e progressão sob condições de estresse oxidativo intensas [13], [19], procurou-se determinar se inanição de soro, um

condição in vitro

que imita o tumor hostil microambiente [16], [19], pode induzir o stress oxidativo intracelular no qual as células deficientes em ADAM9 não conseguiu superar. Detectamos um aumento nos níveis de superóxido endógenos tanto PC3

shGFP e PC3

células shADAM9 após 24 horas de privação de soro, em comparação com células cultivadas em condições de soro suplementado conforme medido por imagens de células vivas com uma sonda fluorescente vermelha MitoSox ( a Fig. 5-a), bem como a citometria de fluxo com o corante fluorescente, dihydroethidium (DHE) (Fig. 5b). Notavelmente, PC3

shADAM9 exibiu significativamente maior teor de superóxido de PC3

shGFP, quer ao nível basal ou induzida por privação de soro. Em contraste, não há alterações do nível de peróxido de hidrogénio intracelular foram encontrados em qualquer PC3

shGFP ou PC3

shADAM9 células, tal como testado por citometria de fluxo com sondas de DCFH-DA (Fig. 5c). Estes dados demonstram que o stress oxidativo induzido por privação de soro de células de cancro da próstata é mediada, pelo menos em parte, por meio de superóxido mas não peróxido de hidrogénio, um resultado semelhante para a nossa observação anterior envolvendo ionizantes espécies reactivas de oxigénio induzida por radiação geração (ROS) [16 ].

(a)

shADAM9 células PC3

shGFP e PC3 foram cultivadas em FBS a 5%, quer ou sob a privação de soro durante 24 horas, seguido por tratamento com 0,5 uM MitoSOX fluorescência. Igual intensidade de fluorescência foi utilizada em cada captação de imagem para quantificação dos níveis de superóxido. H