Abstract

O estresse oxidativo, um fator importante na modulação da via glicolítica e indução de estresse genes ativados, é ainda mais agravado devido à redução do sistema de defesa antioxidante, que promove a progressão do câncer através de indução de angiogênese. A curcumina, um quimioprotector fitoquímicos que ocorre naturalmente, é relatado para inibir a carcinogénese em vários modelos animais experimentais. No entanto, o mecanismo envolvido na acção anti-carcinogênico da curcumina devido ao seu efeito a longo prazo é ainda para ser comunicados devido ao seu metabolismo rápido, embora metabolitos são acumulados nos tecidos e permanecem por um longo tempo. Portanto, o efeito a longo prazo da curcumina necessita de investigação aprofundada. O presente estudo teve como objetivo analisar a ação anticarcinogenic da curcumina no fígado, mesmo após a interrupção do tratamento em camundongos com linfoma de Dalton. O estresse oxidativo observado durante a progressão do linfoma reduzida atividades antioxidantes enzimáticos, e angiogênese induzida, bem como ativação de estresse activado genes precoces e via glicolítica. Curcumina tratamento resultou na activação da enzima antioxidante superóxido-dismutase e a regulação por diminuição dos níveis de ROS, bem como actividade de ROS produção de enzima NADPH:-oxidase, a expressão de genes do stress activado HIF-1α, cMyc e actividade de LDH para o nível normal. Além disso, levar a uma inibição significativa da angiogénese, observado através da actividade MMP, PKCα e nível de VEGF, assim como por ensaio de tampão de Matrigel. Assim resultados deste estudo concluem que o efeito a longo prazo da curcumina mostra o potencial anticancerígeno através da indução do sistema de defesa antioxidante e inibição da angiogênese via regulação para baixo dos genes do estresse ativado e via glicolítica no fígado de ratos com linfoma rolamento.

Citation : das L, Vinayak M (2014) Long Term Efeito da curcumina no Regulamento da via glicolítica e angiogênese através da modulação do estresse ativado Genes em Prevenção de Câncer. PLoS ONE 9 (6): e99583. doi: 10.1371 /journal.pone.0099583

editor: Gautam Sethi, Yong Loo Lin Faculdade de Medicina da Universidade Nacional de Cingapura, Cingapura

Recebido: 25 Março, 2014; Aceito: 15 de maio de 2014; Publicação: 16 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Das, Vinayak. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados são incluídos dentro do papel

Financiamento:. O trabalho foi apoiada por doações do Departamento de Ciência e Tecnologia (Grant No.-SR /S0 /AS-97/2007), Governo da Índia a MV . O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

espécies elevados reactivas de oxigénio (ROS) como o radical superóxido e

2O

2 função H como moléculas de sinalização em vários aspectos de respostas mediadas por fator de crescimento, incluindo a angiogénese durante a progressão do câncer. A principal fonte de produção de ROS é regulada pela NADPH oxidase. O factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) é um forte indutor da angiogénese, o que estimula a proliferação, migração e formação do tubo de células endoteliais (ECs) através do tipo 2 do receptor de VEGF. VEGF induziu a angiogénese é mediada por proteína-quinase C (PKC), como a PKC está envolvido na via de sinalização de desenvolvimento de tumor mediada por VEGF e a angiogénese [1]. PKCα promove atividade angiogênica das células endoteliais através da indução de VEGF e VEGF aumenta a sua própria expressão através do mecanismo de feedback positivo PKCα-dependente [2]. Além disso, o VEGF é regulada ao nível transcricional pelo factor 1-α indutível por hipoxia (HIF-1α) em resposta a hipoxia [3], [4]. HIF-1 não só regula o fornecimento de oxigênio (angiogênese), mas o consumo de oxigênio (metabolismo glicolítico) também no microambiente do tumor hipóxico [5]. A expressão de um número de genes a partir do oncogene com mediada seguido por genes HIF-1 mediada são induzidas que promovem alterações metabólicas durante a carcinogénese. Isso resulta no fenótipo altamente glicolítica “Warburg” e supressão da biogénese mitocondrial [6]. A regulação positiva da lactato desidrogenase A (LDH-A) é um mediador molecular maior do efeito Warburg, que ocorre mesmo na condição aeróbia como consequência do microambiente do tumor hipóxico e alterações em certos oncogenes ou genes supressores de tumores [7]. Além disso, a sobre-expressão de LDH-A é regulada por HIF-1 cooperação com desregulada de c-Myc. Observou-se que a activação oncogénica através da expressão desregulada do c-Myc contribui para a tumorigénese em vários tecidos em ratinhos transgénicos e diversos tipos de cancros humanos, incluindo linfomas [8]. Assim, a desregulação da expressão de oncogenes, genes supressores de tumores e de estabilidade genes estão envolvidos na carcinogénese, que resultam num nível reduzido de defesa antioxidante no microambiente do tumor e as células cancerosas [9]. Além disso, a metaloproteinase de matriz (MMPs) são dependentes de zinco enzimas proteolíticas, matriz extracelular, bem como clivam substratos não-matriz (factores de crescimento, receptores da superfície celular, etc.) e regulam vias que controlam o crescimento celular, inflamação, angiogénese ou de sinalização. Ele age como modulador do microambiente do tumor e pode até trabalhar de uma forma nonproteolytic. A desregulação das MMPs está envolvido em muitas doenças, tais como metástases tumorais, artrite reumatóide, doença periodontal e [10], [11]. Além disso, as MMPs reactivar a actividade angiogénica do VEGF através da degradação selectiva do factor de crescimento do tecido conjuntivo (CTGF), como uma das isoformas de VEGF se liga de CTGF e a actividade angiogénica do VEGF é inibido no complexo de VEGF-CTGF [12]. Assim, a inibição de actividades angiogénicas através da modulação da via glicolítica, a activação do sistema de defesa antioxidante endógena e inibição de formação de ROS pode ser um passo para prevenir a carcinogénese. Durante a progressão do linfoma de Dalton (um murina transplantáveis ​​não-Hodgkin, linfoma de célula T do), diferentes partes são afectados incluindo fígado e de medula óssea para além do sistema linfático. Fígado sendo a maior metabólica e desintoxicação órgão do corpo é muito afectado durante a progressão do linfoma. Além disso, metástase e malignidade foi confirmado no início de fígado de rolamento linfoma de Dalton (DL) de ratos, que são características de linfoma não-Hodgkin [13], [14].

array Broad de fitoquímicos que ocorrem naturalmente podem conferir benefícios de saúde ideal para os seres humanos. O uso do extrato total ou constituinte single-isolado ou um metabolito de um componente isolado para alcançar benefícios de saúde desejáveis ​​tem sido um problema dos últimos anos. A curcumina, um fitoquímico quimiopreventivo de ocorrência natural derivado de cúrcuma (

Curcuma longa

), é relatado para inibir a carcinogénese induzida quimicamente em locais múltiplos órgãos em vários modelos animais experimentais. A curcumina suprime a activação de vários factores de transcrição que estão implicados nas actividades oncogénicos, blocos de transformação, proliferação e invasão, bem como induz apoptose em células tumorais. Assim curcumina mostra imensa promessa para o tratamento de câncer [15]. No entanto, é ainda de ser comunicados se a acção anti-carcinogênico de curcumina é devido ao efeito acumulado dos seus metabolitos ou devido à própria curcumina, como o metabolismo da curcumina é muito rápido, mas metabolitos permanecer durante mais tempo nos tecidos diferentes [16]. Além disso, as evidências que se acumulam sugerem que o consumo de extratos de alimentos inteiros ou parcialmente purificadas é mais benéfico ao longo do componente single-isolado devido à existência de interacções sinérgicas entre os fitoquímicos em alimentos integrais [17], [18]. Portanto, o presente estudo foi desenhado para investigar o mecanismo envolvido na ação anticarcinogenic da curcumina, mesmo após a retirada da administração. O estudo é focado na via glicolítica e angiogênese, cooperativa regulada por c-Myc e HIF-1 sob microambiente do tumor oxidativo no fígado metastático de ratos com linfoma rolamento.

Materiais e Métodos

Reagentes

Todos os produtos químicos eram de grau analítico e molecular biologia, bem como livre de endotoxinas e utilizado sem purificação adicional. A curcumina, reagentes de isolamento de ARN e a polimerase Taq, não fluorescente 2 ‘, 7’-diclorofluoresceína diacetato (H2DCFDA) e conjugado HRP anti-actina β foram adquiridos a partir de Sigma Aldrich. Transcriptase reversa, ribonuclease Inhibitor, primers aleatórios e 100 pb Além disso DNA escada de Fermentase Life Science e primers específicos de genes para RT-PCR foram sintetizados a partir Metabion. Anti-ratinho PKCα e VEGF-A anticorpo foram adquiridos a Santacruz biotecnologia e BioLegend respectivamente. Conjugado com HRP de cabra anti-coelho e o anticorpo secundário de coelho anti-rato de Bangalore Genei. matriz de membrana basal Matrigel da BD Biosciences, gelatina de Amresco e ECL (Kit de sinal Super) foi comprado de PIERCE Biotechnology.

Animais e indução de células T do linfoma (linfoma de Dalton)

Mice (AKR cepa) foram criados e mantidos sob condições de laboratório padrão com cuidado humano adequada, conforme as orientações do comitê de ética animais institucional, a 25 ± 2 ° C, sob uma programação escuro de 12 h de luz /12 h fornecido com ratos padrão alimentar e água potável

ad libitum

. Todas as experiências com animais foram realizados com a aprovação do Comitê de Ética Institucional Animal, Universidade Banaras Hindu. ratos machos adultos saudáveis ​​(16-20 semanas de idade e de 30 ± 2 g) foram utilizados no trabalho experimental. linfoma de Dalton (linfoma de células T transplantáveis ​​não-Hodgkin) células de ascite foram transplantadas para ratinhos macho adultos por meio de injecção intraperitoneal (ip) o transplante em série de cerca de 1 × 10

6 células tumorais de ascite viáveis ​​em 1 ml de solução salina de tampão fosfato (PBS) por murganho, como descrito anteriormente [19]. células ascite linfoma de Dalton foram dotados pelo Prof. Ajit Sodhi, Escola Superior de Biotecnologia da Universidade Hindu de Banaras, Varanasi, na Índia. linfoma de Dalton é um linfoma de célula T murina transplantáveis ​​originado na glândula timo de um 2 mouse /DBA no Instituto Nacional do Câncer, Bethesda, MD, em 1947. [20].

Desenvolvimento de DL foi confirmada por inchaço abdominal anormal e aumento do peso corporal, que eram visíveis claramente em 10-11 dias pós ratos transplante e DL sobreviveu por 20 ± 2 dias. Primeiros 7-9 dias a partir de próximo dia do transplante DL, o crescimento do linfoma de Dalton não mostraram qualquer mudança importante no peso corporal e ascite acúmulo de líquido. Assim primeiros 7-9 dias pode ser comparado com o de preparação de fase lag-phase /da curva sigmóide de crescimento da população de células ascite. Portanto, a programação do tratamento curcumina para ratos DL foi selecionado de acordo para 9 dias a partir de dia seguinte após o transplante e ratos DL foram sacrificados no dia 18 de pós-transplante DL (antes de ratos DL morre naturalmente) para obter o efeito a longo prazo da curcumina, como curcumina deve ser completamente metabolizado dos seus metabolitos a 9 dias antes do último dia de tratamento. Assim, o efeito não seria devido ao efeito directo da curcumina, mas pode ser devido aos metabólitos de curcumina.

Cronograma de tratamento curcumina para ratos DL e coleta de tecido

Um grupo do normal ratinhos foi usado como controlo, sem qualquer tratamento (N). DL ratinhos foram divididos aleatoriamente em cinco grupos com 6 ratos em cada grupo (n = 6). Três grupos foram tratados com diferentes doses de curcumina: 1,5 mg [linfoma de Dalton rolamento de ratinhos tratados com 50 mg de curcumina /kg de peso corporal (DLT50)], 3 mg [linfoma de Dalton rolamento ratinhos tratados com 100 mg de curcumina /kg de peso corporal (DLT100) ], e 4,5 mg [linfoma de Dalton rolamento ratinhos tratados com 150 mg de curcumina /kg de peso corporal (DLT150)], dissolvido em 50 ul de DMSO para cada ratinho por dia através de IP durante 9 dias consecutivos, a partir do dia seguinte, após o transplante DL. Um grupo de ratos recebeu 50 ul de DL DMSO como veículo (DL + DMSO) de um modo semelhante e outro grupo de ratos dL foram utilizados sem qualquer tratamento (DL). Todos os ratinhos de cada grupo foram sacrificados no dia 18 de pós-transplante DL por deslocamento cervical. Fígado foi excisado imediatamente depois de sacrificar o animal e lavados em solução salina normal gelada. Fígado de todos os animais (n = 6) de um grupo foi reunido e misturado através do corte assepticamente a 4 ° C durante resultado médio. tecido coletado foi utilizado imediatamente ou conservados à temperatura de -80 ° C para posterior estudo.

In vivo

angiogênese ensaio

Outro conjunto de seis grupos com três ratos por grupos foram tomadas para estudar

in vivo

angiogênese. Todos os tratamentos foram os mesmos que acima, excepto que, no momento do transplante de DL, cada ratinhos de todos os grupos foram injectados por via subcutânea com 500 ul de matriz de membrana basal BD Matrigel (tampão de Matrigel). Apenas depois de sacrificar, tampões de Matrigel foram removidos. Plugs foram imediatamente fotografados e pesados. Para quantificar a vascularização do bujão, a quantidade de hemoglobina (Hb) acumulada no tampão foi medida utilizando o kit de HEMOCOR-D (crista Biosystems, Tulip Grupo, Índia) seguindo o protocolo e a absorvância de amostras do fabricante foram medidos a 540 nm.

RT-PCR

o RNA total foi isolado usando TRI Reagent (Sigma-Aldrich) de acordo com o seu manual do usuário. tratamento com DNase foi efectuada em ARN total utilizando TURBO Kit de ADN livre de I ™ para remover qualquer contaminação por ADN genómico. O ARN foi quantificado a 260 nm e a integridade foi verificada por electroforese em gel de agarose formaldeído a 1%. O ADNc foi sintetizado a partir de ARN total isolado utilizando uma mistura padrão contendo cada dNTP, hexâmero aleatório, M-MuLV da transcriptase reversa, inibidor de RNase e de tampão de reacção de acordo com o protocolo padrão de Fermentas Life Science, e o ADNc foi utilizado imediatamente ou armazenado a -80 ° C. Expressão de isoenzimas de SOD e NOX, HIF-1α, cMyc, LDH-A, PKCα, VEGF-A e MMP 9 2 genes foram estudados por semi-quantitativo de RT-PCR utilizando ADNc sintetizado. Taq polimerase e os pares de iniciadores apropriados (Tabela-1) foram utilizadas para reacções de PCR utilizando termociclador (Applied Biosystem). A PCR foi iniciado com 3 min a 95 ° C para desnaturação seguido por três etapas ciclo de temperatura (Quadro 1). Um passo final de extensão a 72 ° C durante 7 min foi incluído após o ciclo final para completar a polimerização. O número de ciclos foi optimizada dentro da fase exponencial da amplificação. O tamanho dos produtos amplificados foi verificada por electroforese em gel de agarose utilizando 100 bp ladder. A intensidade da banda de produtos amplificados no gel de agarose foi visualizado, fotografados e analisados ​​usando Gel Doc System (Alpha Innotech

CE). Além disso, a intensidade da banda foi normalizado com a pista correspondente de β-actina como controlo interno.

PAGE não desnaturante e coloração atividade específica

ensaios de gel de atividade foram usados ​​para medir a atividade da enzima e isozimas padrão de enzima antioxidante SOD, bem como NOX e LDH. Como as alterações de actividade enzimática está associada com alterações metabólicas, análise PAGE não-desnaturante em gel e ensaio de actividade foi preferido ao longo de imunodetecção, por causa, o método utiliza a detecção baseada especificidade para o substrato de apenas uma parte activa da proteína. Assim, considera-se altamente relevante para correlacionar uma mudança no nível de uma isoenzima específica com o de alterações metabólicas no nível celular.

superóxido dismutase (SOD)

O ensaio de actividade de gel de SOD foi realizada por PAGE não desnaturante, seguido de coloração de actividade de acordo com o método de Beauchamp e Fridovich [21]. Igual quantidade de proteína de cada amostra foi separada por 10% PAGE não-desnaturante a 4 ° C. Após a electroforese, o gel foi embebida em solução 1,23 NBT mM durante 20 min no escuro. O gel foi brevemente lavado com água destilada e incubadas durante 15-20 minutos no escuro em 100 mM de tampão de fosfato (pH 7,0) contendo 28 mM de TEMED e 0,28 mM de riboflavina. Em seguida, o gel foi exposto a uma luz fluorescente até aparecimento de zonas claras bandas de actividade de aromáticos com fundo azul. A intensidade das bandas foi analisada por varrimento de densitometria utilizando um Sistema Analisador de Imagem Alpha (Alpha Innotech, San Leandro, CA, EUA)

coloração de actividade de NADPH:. Oxidase

O nível de actividade enzimática de NOX foram identificados isozimas em PAGE não-desnaturante, seguido de coloração de actividade pelo método de redução do NBT descrito por Sagi e Fluhr [22]. Igual quantidade de proteína de cada amostra foi separada por 10% PAGE não-desnaturante a 4 ° C. Após electroforese o gel foi corado em 50 mM de Tris-Cl (pH 7,4) NBT 0,2 mM, MgCl2 0,1 mM, e CaCI2 1 mM, no escuro, durante 20 min. Em seguida, NADPH 0,2 mM foi adicionado à solução de coloração, e foi observado o aparecimento de bandas de formazano azul. A reacção foi terminada por imersão dos géis em água destilada. A intensidade das bandas foi analisada por varrimento de densitometria utilizando um Sistema Analisador de Imagem Alpha (Alpha Innotech, San Leandro, CA, EUA).

coloração de actividade de lactato desidrogenase (LDH)

enzimática gel ensaio de actividade de lactato desidrogenase foi realizada por PAGE não desnaturante seguida por coloração de actividade específica tal como descrito por Dietz e Lubrano [23]. Igual quantidade de proteína de cada amostra foi separada por 8% PAGE não-desnaturante a 4 ° C. Após a electroforese, o gel foi submetido a LDH de coloração de actividade específica em solução de coloração contendo 125 mM de Tris-Cl (pH 7,4), cloreto de magnésio 0,5 mM, 0,1 mM de lítio-lactato, 1 mg /mL de NAD, 10 mM de NaCl, 0,25 mg /ml de NBT e 0,025 mg /ml de PMS com agitação suave durante 5-10 min à temperatura ambiente, após o desenvolvimento de bandas de LDH o gel foi lavado. A intensidade das bandas foi analisada por varrimento de densitometria utilizando um Sistema Analisador de Imagem Alpha (Alpha Innotech, San Leandro, CA, EUA).

ensaio de peróxido de hidrogénio

nível de peróxido de hidrogénio no tecido hepático foi medido espectrofotometricamente tomando a absorvância a 570 nm como descrito anteriormente [24]. A concentração de H

2O

2 em cada amostra foi determinada utilizando a curva padrão, tendo gerado por quantidades conhecidas de H

2O

2, e expresso em ^ mole /mg de proteína.

ROS Ensaio

nível total de ROS foi determinada por a conversão oxidativa de não fluorescente 2 ‘, 7′-diclorofluoresceína diacetato (H2DCFDA) à altamente fluorescente 2′, 7’-diclorofluoresceína (DCF), tal como descrito anteriormente [25 ]. extractos de fígado de montante 100 ul foram incubadas a 37 ° C durante 60 min com 100 ul de H2DCFDA 2 mM (Invitrogen) em PBS. A fluorescência foi registada a 485 nm (excitação) e 527 nm (emissão) com a Hitachi F-3000 de fluorescência espectrofotômetro. O nível de ROS em cada amostra foi determinado pela observação de fluorescência (absorvância) /mg de proteína.

Gelatina zimografia

Actividade de MMPs na amostra de tecido foi analisada para estudar a actividade degradante de gelatina usando zimografia conforme descrito anteriormente [26]. Igual quantidade de proteína de cada amostra misturada com um volume igual de 2X tampão não redutor (0,125 M de Tris-Cl pH 6,8, 20% glicerol, 4% de SDS, 0,003% de azul de bromofenol) foi separada a 4 ° C por 8% resolver e 5% de empilhamento de SDS-PAGE contendo 0,1% de gelatina. Após a electroforese, o gel foi lavado duas vezes em 2,5% de Triton X-100 durante 20 min cada, a fim de remover enzimas SDS e renaturar. O gel foi em seguida incubada durante 20 horas a 37 ° C no tampão contendo 21 mM de Tris-Cl (pH 7,6), 10 mM de CaCl2, e 0,04% de NaN3. Então gel foi lavado em água destilada, coradas com CBB e descorados em metanol e ácido acético. A atividade de proteases foi observado como uma banda clara de gelatina digerida. A intensidade das bandas foi analisada por varrimento de densitometria utilizando um Sistema Analisador de Imagem Alpha (Alpha Innotech, San Leandro, CA, EUA).

A análise estatística

A análise estatística foi realizada por um programa SPSS usando -way ANOVA seguido pelo teste de Tucky. Os valores foram expressos em média ± S.E.M. obtido a partir de três diferentes conjuntos de experiências, p 0,05 foi considerado como estatisticamente significativo (95% de intervalo de confiança). # P 0,05 e ## 0,01 comparado com N, * p 0,05 e ** P . 0,01 comparado grupo DL + DMSO respectivamente

Resultados

Expressão e actividade enzimática de SOD

a expressão de SOD no fígado de DL e DL + DMSO ratos foi encontrado para ser regulada negativamente de forma significativa em relação ao normal. As expressões de ambos Mn-SOD e Cu /Zn-SOD em ratinhos dL foram 75% e 78% dos ratinhos normais e respectivamente 82% e 69% do normal, respectivamente, na DL + DMSO. regulação significativa acima da expressão de ambas as isozimas de SOD foi encontrada para o nível normal de curcumina por tratamento; Mn-SOD foi regulada até 1,21 vezes e 1,22 vezes superior de ratinhos DL + DMSO com 100 e 150 mg de curcumina /kg de peso corporal, respectivamente, e Cu /Zn-SOD até 1,15 vezes, 1,42 vezes e 1,1 vezes de DL + DMSO com 50, 100 e 150 mg de curcumina /kg de peso corporal, respectivamente [Fig. 1 (a)]. De modo semelhante actividade da SOD também segue a tendência semelhante de variação na expressão. A actividade de Mn-SOD em DL e ratinhos DL + DMSO verificou-se ser de 65% e 63% dos ratinhos normais, respectivamente. Curcumina tratamento elevou a actividade de um modo dependente da dose, que foi de aproximadamente até 1,3 vezes, de 1,39 vezes e 1,58 vezes da DL + DMSO em 50, 100 e 150 mg de curcumina /kg de peso corporal, respectivamente. Do mesmo modo, a actividade de Cu /Zn-SOD foi diminuída em ratinhos DL e DL + DMSO até 61% e 61,5% dos ratinhos normais, respectivamente. tratamento curcumina foi capaz de aumentar a actividade de Cu /Zn-SOD em forma dependente da dose semelhante, aproximadamente até 1,24 vezes, 1,35 vezes, 1,5 vezes de ratinhos DL + DMSO com 50, 100 e 150 mg de curcumina /kg de peso corporal, respectivamente [Fig. 1 (C)].

Efeito da curcumina na expressão de ARNm e actividade enzimática de SOD isozimas no fígado de ratos tendo linfoma (A) RT-PCR da Mn-SOD, Cu /Zn-SOD e β-actina do gene, (B) densitométrica de varrimento de Mn-SOD e genes de Cu /Zn-SOD após normalização com β-actina, (C) a coloração específica que mostra a actividade de isoenzimas SOD, (D) densitométrica de varrimento da banda de isoenzimas SOD actividade. Fígados de todos os seis animais de cada grupo foram reunidos separadamente e utilizados para a extracção de RNA total e proteínas na condição de não desnaturação. Os dados representam ± médios S.E.M. # P 0,05 comparado com o grupo N e * p 0,05 comparado com o grupo DL + DMSO respectivamente. Cur é a curcumina, M é de 100 pb e marcador de peso corporal é o peso corporal. N, DL, DL + DMSO, DLT50, DLT100 e DLT150 representa normais, rolamento do linfoma de Dalton, linfoma de Dalton ratinhos portadores tratados com linfoma de DMSO e Dalton ratinhos tratados com 50, 100 e 150 mg de curcumina /kg de peso do corpo foi dissolvido em DMSO, respectivamente rolamento.

expressão e actividade enzimática de NOX

observou-se a expressão de Nox1 e NOX2 para ser significativamente regulada positivamente em ratinhos DL e DL + DMSO, em comparação com ratinhos normais, que foi modulados em direcção nível normal por tratamento curcumina [Fig. 2 (A)]. A expressão de Nox1 verificou-se ser cerca de 1,75 vezes e 1,44 vezes superior de camundongos normais no fígado de ratos e DL DL + DMSO respectivamente. Curcumina tratamento reduziu a expressão, que era cerca de 83%, 86% e 72% dos ratinhos DL + DMSO com a dose de 50, 100 e 150 mg /kg de peso corporal, respectivamente. Da mesma forma em relação ao normal, a expressão de NOX2 verificou-se ser aproximadamente 2,7 vezes e 2,38 vezes no fígado dos ratinhos DL e DL + DMSO, respectivamente, a qual foi regulada negativamente após o tratamento curcumina como observado em aproximadamente 60%, 86% e 87% dos ratinhos DL + DMSO com a dose de 50, 100 e 150 mg /kg de peso corporal, respectivamente. De modo semelhante foi observada actividade de NOX a ser elevada como a sua expressão de ARNm. NOX regula a formação de ROS; Por conseguinte, a actividade de NOX pode ser medido como um indicador de nível de ROS. Em comparação com os ratinhos normais, a actividade de Nox1 foi de aproximadamente 1,6 vezes e 1,45 vezes enquanto que a actividade de NOX2 foi de 1,37 vezes e 1,3 vezes no fígado de ratos e DL DL + DMSO respectivamente. Diferentes doses de tratamento curcumina modulada significativamente a actividade para o nível normal. Actividade de Nox1 verificou-se ser aproximadamente 86%, 70% e 80% dos ratinhos DL + DMSO, enquanto que a actividade de NOX2 verificou-se ser aproximadamente 78%, 84% e 84% dos ratinhos DL + DMSO com a dose de 50, 100 e 150 mg /kg de peso corporal, respectivamente [Fig. 2 (C)].

Efeito da curcumina na expressão de ARNm e actividade enzimática de NOX isozimas no fígado de ratos tendo linfoma (A) RT-PCR do NOX2, Nox1 e os genes de p-actina, (B) densitométrica digitalização de genes Nox2 e Nox1 após normalização com β-actina, (C) a coloração específica que mostra a actividade de isoenzimas de NOX, (D) densitométrica de varrimento da banda de isozimas de NOX actividade. Fígados de todos os seis animais de cada grupo foram reunidas separadamente e utilizadas para a extracção de RNA total e proteínas na condição de não desnaturação. Os dados representam ± médios S.E.M. # P 0,05 e ## 0,01 comparado com o grupo N, * p 0,05 e ** P 0,01 comparado com o grupo DL + DMSO respectivamente. Cur é a curcumina, M é de 100 pb e marcador de peso corporal é o peso corporal. N, DL, DL + DMSO, DLT50, DLT100 e DLT150 representa normais, rolamento do linfoma de Dalton, linfoma de Dalton ratinhos portadores tratados com linfoma de DMSO e Dalton ratinhos tratados com 50, 100 e 150 mg de curcumina /kg de peso do corpo foi dissolvido em DMSO, respectivamente rolamento.

nível de H

2O

2 e ROS totais no tecido hepático

o nível de H2O2, sendo um indicador de estresse oxidativo reflete o estado oxidativo do tecido. O nível de peróxido de hidrogénio no fígado de DL e DL + DMSO murganhos foi significativamente elevados, até cerca de 1,47 vezes e 1,39 vezes superior de ratos normais, respectivamente. Curcumina tratamento reduziu significativamente o nível de até 82% dos ratinhos DL + DMSO ratinhos com 100 mg de curcumina /kg de peso corporal, e de 96% e 90% dos ratinhos DL + DMSO com 50 e 150 mg de curcumina ratinhos /kg de peso corporal, respectivamente [Fig. 3 (A)]. ROS sintetizado por NOX bem de outros actos fontes como uma importante molécula sinalizadora no microambiente do tumor oxidativo para induzir a transformação oncogénica. ROS nível total em termos de fluorescência (absorvância) /mg de proteína foi significativamente elevados em ratinhos DL e DL + DMSO até cerca de 2,59 vezes e 2,64 vezes superior de ratinhos normais. Tratamento de curcumina suprimiu significativamente o nível de ROS, que foi observada em cerca de 62%, 51% e 67% dos ratinhos DL + DMSO com a dose de 50, 100 e 150 mg /kg de peso corporal, respectivamente [Fig. 3 (B)].

Efeito da curcumina sobre o estresse oxidativo em termos de nível H2O2 total e nível total ROS no fígado de ratos com linfoma rolamento (A) Histograma mostra o nível total de H2O2 em diferentes grupos, (B) Histograma mostra o nível total de ROS em grupos diferentes. Fígados de todos os seis animais de cada grupo foram reunidas separadamente e homogeneizado foi preparado para determinação do nível de H2O2 e de ROS. Os dados representam ± médios S.E.M. # P 0,05 comparado com o grupo N, * p 0,05 comparado com o grupo DL + DMSO respectivamente. N, DL, DL + DMSO, DLT50, DLT100 e DLT150 representa normais, rolamento do linfoma de Dalton, linfoma de Dalton ratinhos portadores tratados com linfoma de DMSO e Dalton ratinhos tratados com 50, 100 e 150 mg de curcumina /kg de peso do corpo foi dissolvido em DMSO, respectivamente rolamento.

A expressão de HIF-1α e cMyc

A expressão de mRNA do HIF-1α e cMyc foi estudado como um gene do estresse resposta precoce e oncogene, respectivamente, no microambiente do tumor hipóxico. A expressão de ambos os HIF-1α e cMyc foi expresso em ratinhos DL e DL + DMSO, em comparação com ratinhos normais, o que foi significativamente reduzido por tratamento curcumina [Fig. 4 (A)]. A expressão de HIF-1α no fígado de ratos e DL DL + DMSO foi encontrado como sendo de aproximadamente 1,85 vezes e 1,51 vezes superior de ratos normais, respectivamente. O nível de expressão após tratamento curcumina foi de aproximadamente 93%, 91% e 78% dos ratinhos DL + DMSO com a dose de 50, 100 e 150 mg /kg de peso corporal, respectivamente. Do mesmo modo, a expressão de cMyc verificou-se ser cerca de 2,03 vezes e 1,45 vezes superior de camundongos normais no fígado de DL e DL + DMSO ratinhos, respectivamente, e depois do tratamento curcumina a expressão foi diminuída para cerca de 95%, 83% e 78% de DL + DMSO ratos com a dose de 50, 100 e 150 mg /kg de peso corporal, respectivamente.

Efeito da curcumina na expressão de ARNm de gene de stress activado HIF-1α e cMyc no fígado de ratos tendo linfoma (a) RT -PCR de HIF-1α, cMyc e os genes de p-actina, (B) digitalização densitométrica de HIF-1α e genes cMyc após normalização com β-actina. Fígados de todos os seis animais de cada grupo foram reunidas separadamente e utilizadas para a extracção de ARN total. Os dados representam ± médios S.E.M. # P 0,05 e ## 0,01 comparado com o grupo N, * p 0,05 comparado com o grupo DL + DMSO respectivamente. Cur é a curcumina, M é de 100 pb e marcador de peso corporal é o peso corporal. N, DL, DL + DMSO, DLT50, DLT100 e DLT150 representa normais, rolamento do linfoma de Dalton, linfoma de Dalton ratinhos portadores tratados com linfoma de DMSO e Dalton ratinhos tratados com 50, 100 e 150 mg de curcumina /kg de peso do corpo foi dissolvido em DMSO, respectivamente rolamento.

expressão e atividade enzimática da LDH-a

a expressão de mRNA de LDH-a no fígado de DL e ratos DL + DMSO foi regulada até aproximadamente 1,4 vezes e 1.4- dobre de ratos normais, respectivamente. Todas as doses de curcumina significativamente regulada negativamente a expressão. A expressão após tratamento curcumina foi encontrado como sendo de aproximadamente 90%, 79% e 80% dos ratinhos DL + DMSO com a dose de 50, 100 e 150 mg /kg de peso corporal, respectivamente [Fig. 5 (A)]. Piruvato não pode ser metabolizado em condições aeróbias mas é convertida em lactato de LDH-A no microambiente do tumor hipóxico. Portanto, o metabolismo glicolítico pode ser monitorizado em termos de actividade de LDH-A. A actividade de LDH-A foi encontrado para ser elevado até cerca de 1,76 vezes e 1,64 vezes superior de camundongos normais no fígado de ratos e DL DL + DMSO respectivamente. Tratamento de curcumina reduziu significativamente a actividade de LDH-A, que era cerca de 75%, 67% e 85% dos ratinhos DL + DMSO com as doses de 50, 100 e 150 mg /kg de peso corporal, respectivamente [Fig. 5 (C)].

Efeito da curcumina na expressão de ARNm e actividade enzimática da LDH-A no fígado de ratos tendo linfoma (A) RT-PCR de LDH-A e os genes de p-actina, (B) varrimento densitométrico de LDH-a após normalização com β-actina, (C) a coloração específica que mostra a actividade de LDH-a, (D) varrimento densitométrico da banda de LDH-a actividade. Fígados de todos os seis animais de cada grupo foram reunidas separadamente e utilizadas para a extracção de ARN total e das proteínas totais na condição de não desnaturação. Os dados representam ± médios S.E.M. # P 0,05 e ## 0,01 comparado com o grupo N, * p 0,05 e ** P 0,01 comparado com o grupo DL + DMSO respectivamente. Cur é a curcumina, M é de 100 pb e marcador de peso corporal é o peso corporal. N, DL, DL + DMSO, DLT50, DLT100 e DLT150 representa normais, rolamento do linfoma de Dalton, linfoma de Dalton ratinhos portadores tratados com linfoma de DMSO e Dalton ratinhos tratados com 50, 100 e 150 mg de curcumina /kg de peso do corpo foi dissolvido em DMSO, respectivamente rolamento.

expressão e nível de proteína de PKCα

a expressão de mRNA de PKCα foi encontrado para ser-se regulada em ratos DL e DL + DMSO até aproximadamente 1,75 vezes e 1,65 vezes do normal ratos. Todas as três doses de curcumina reduziu a expressão de PKCα significativamente. A regulação da expressão de PKCα foi até cerca de 83%, 69% e 67% dos ratinhos DL + DMSO com 50, 100 e 150 mg de curcumina /kg de peso corporal, respectivamente (Fig. 6 (A)]. Nível de proteína de PKCα segue o Os dados representam ± médios S.E.M. Os dados representam ± médios S.E.M. Os dados representam ± médios S.E.M. Os dados representam ± médios S.E.M.