baseado em microtúbulos, foi implicado na regulação da estrutura cromossômica e microtúbulos kinetochore dinâmica. Considerando-se as funções de KIF4A, assumiu-se que KIF4A está envolvida na progressão de carcinomas de células escamosas orais (carcinoma epidermóide estudados) através da activação do posto de montagem do fuso (SAC). No entanto, pouco se sabe sobre a relevância da KIF4A no comportamento da CEB. Nós investigamos o status de expressão KIF4A e seus mecanismos funcionais em CCEO.

Métodos

Os níveis de expressão KIF4A em sete células CCEO derivados foram analisados ​​por reação inversa quantitativa transcriptase-polymerase chain e immunoblotting analisa. Usando um modelo KIF4A knockdown, avaliou-se a expressão de moléculas relacionados com (SAC) (BUB1, MAD2, CDC20, e ciclina B1), do ciclo celular, e a proliferação celular. Além de

em

vitro

dados, a correlação clínica entre os níveis de expressão KIF4A em carcinoma epidermóide estudados primários (n = 106 pacientes) e o estado clínico-patológico por imuno-histoquímica (IHQ) também foram avaliadas.

Resultados

mRNA e proteína KIF4A foram up-regulada de forma significativa (

P Art 0,05) em sete células CCEO derivados comparação com queratinócitos orais normais humanos. Nas células KIF4A knockdown, a ativação SAC foi observada através de um aumento da expressão BUB1 nas cinetócoros, localização kinetochore apropriado de MAD2, a regulação negativa de CDC20, up-regulação da ciclina B1, e do ciclo celular preso em fase G2 /M. Os resultados mostraram que a proliferação celular de células de knockdown KIF4A diminuiu significativamente (

P

0,05) em comparação com células de controlo. IHC mostraram que a expressão KIF4A em epidermóide estudados primários foi significativamente (

P

0,05) maior do que epidermóide estudados nos homólogos orais normais e que KIF4A-positivos foram correlacionada de perto (

P

0,05) com tamanho tumoral.

Conclusões

Nossos resultados propostos para a primeira vez que KIF4A controla a proliferação celular através da activação SAC. Portanto, KIF4A pode ser um regulador chave para a progressão tumoral no carcinoma epidermóide estudados

Citation:. Minakawa Y, Kasamatsu A, Koike H, Higo M, Nakashima D, Kouzu Y, et al. (2013) Cinesina membro da família 4A: Um indicador em potencial para a progressão do câncer bucal humana. PLoS ONE 8 (12): e85951. doi: 10.1371 /journal.pone.0085951

editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, China

Recebido: 06 de junho de 2013; Aceito: 10 de dezembro de 2013; Publicação: 30 de dezembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Minakawa et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

As proteínas kinesin superfamília (KIFS), classificadas em. 14 subfamílias, são proteínas motoras ATP-dependentes com capacidade motion plus-end dependente de microtúbulos [1,2]. Durante a mitose, as atividades de KIFS no microtúbulos do fuso são precisamente controlada para garantir que os eventos de mitose são orquestradas na ordem correta durante todo mitose [3,4]. Estas proteínas em microtúbulos interpolares controlar um equilíbrio de forças externas e forças internas para garantir a captura dos cromossomas e apego aos eixos e evitar eixo de alongamento antes anaphase [5,6]. Entre os KIFS, KIF4A controla organização do fuso, o alinhamento cromossomo, ea dinâmica dos microtúbulos kinetochore com um regulador de proteína de citocinese 1 [4,7-13]. Desregulação da KIF4A induz a separação do fuso anormal e faz com que a aneuploidia de células filhas [14,15]. Células afectadas por aneploidy são caracterizados pelo ganho ou perda do material genético. Eles são fortemente suspeito de estar associado com a progressão do cancro [16]. Portanto, a hipótese de que KIF4A pode estar associado a progressão do câncer.

O ponto de verificação de montagem do fuso (SAC) monitora interações entre cinetócoros e microtúbulos do fuso durante a mitose e controla transição metaphase-anaphase até que todos os cromossomos estabelecer biorientation. Portanto, o SAC tem um papel importante na proliferação celular através de um mecanismo de controlo do ciclo celular, o que é especialmente importante para a exactidão do cromossoma segregação [17-19]. Bom funcionamento do SAC exige a acção concertada de várias proteínas de ponto de verificação, isto é, BubR1, Bub1, Bub3, MAD1 e Mad2 [19-22]. O posto de controle ativo inibe anaphase promover complexo /ciclossoma (APC /C) parada na anaphase [23-26]. A inibição da APC /C evita a degradação de várias proteínas mitóticas chave, que deve ser degradado por anafase para iniciar [23-28]. A presença de cromossomos não acopladas ou falta de tensão do eixo que normalmente é gerada por bipolares resultados fixação cromossomo na ativação continuou checkpoint, paragem da mitose e, eventualmente, a morte celular programada [17-19,23-25]. Além disso, o SAC tem sido relatada como sendo defeituoso em um número de cancros humanos, incluindo a via oral, rectal, da tiróide, e cancros do ovário, e está associada com a progressão do cancro [29-32].

Uma vez que a relação entre o SAC e KIF4A está apenas começando a ser entendido, assumiu-se que a desregulação de KIF4A está envolvida na progressão de carcinomas espinocelulares orais (epidermóide estudados) através da activação do SAC [4,5,17 , 33,34]. Relatamos aqui que a expressão aberrante de KIF4A no carcinoma epidermóide estudados foi funcionalmente e clinicamente ligado ao crescimento tumoral e que KIF4A pode ser um marcador molecular para a progressão do carcinoma epidermóide estudados.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

o Comitê de Ética da Faculdade de Medicina da Universidade de Chiba aprovou o protocolo do estudo (número de aprovação, 236). O estudo foi realizado de acordo com as normas éticas da Declaração de Helsinki. Todos os pacientes forneceram consentimento informado por escrito.

linhas celulares derivadas de CEs e amostras de tecido

linhas celulares CCEO-derivadas humanas imortalizadas (HSC-2, HSC-3, HSC-4, Ca9-22 , Sa3, HO-1-u-1, e KON) foram obtidos a partir da Human Ciência Research Resources Bank (Osaka, Japão) ou do RIKEN BRC (Ibaraki, Japão), através do Projeto Nacional de Bio-Recursos do Ministério da Educação, cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia (MEXT) (Tóquio, Japão). curtas em tandem repetir pro fi les con fi rmou identidade celular. Todas as células CCE-derivados foram cultivadas em modificado meio de Eagle /F-12 de HAM de Dulbecco (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) suplementado com 10% de soro fetal bovino (Sigma) e 50 unidades /ml de penicilina e de estreptomicina (Sigma). queratinócitos primários humanos normais em cultura (HNOKs orais) foram utilizados como um controlo normal [35-40]. Eles eram espécimes epitélio de mucosa oral saudáveis ​​coletadas de pacientes jovens no Hospital Universitário Chiba. Três HNOKs independentes foram primárias cultivadas e mantidas em Meio oral de queratinócitos (ScienCell Research Laboratories, Carlsbad, CA) composta por 5 ml de suplemento de crescimento de queratinócitos oral (ScienCell Research Laboratories) e 5 ml de solução de penicilina /estreptomicina (ScienCell Research Laboratories).

Uma centena de seis amostras de CCEO primárias e epitélio normal pareados por paciente foram obtidos durante cirurgias realizadas no Hospital Universitário de Chiba. Os tecidos ressecados foram fixados em solução de formol tamponado a 20% para o diagnóstico patológico e imuno-histoquímica (IHQ). diagnóstico histopatológico de cada amostra de CCEO foi realizada de acordo com os critérios da Organização Mundial de Saúde do Departamento de Patologia da Chiba University Hospital [41]. estadiamento clínico-patológico foi determinado pela classificação TNM da União Internacional contra o Cancro [42]. Todos os pacientes tinham CEB que foi confirmado histologicamente, e amostras tumorais foram verificadas para garantir que o tecido tumoral estava presente em mais de 80% das amostras.

Preparação de cDNA e proteína

O ARN total foi isolado usando Trizol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante. cDNA foi gerado utilizando 5 ug ARN total de linhas celulares CCEO derivadas usando Ready-To-Go You-primeiro-First-Strand Beads (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido) e oligo (dT) (Hokkaido Sistema de Ciência, Sapporo, Japão) de acordo com as instruções do fabricante. As células foram lavadas duas vezes com solução salina fria tamponada com fosfato (PBS) e centrifuga-se brevemente. Os sedimentos de células foram incubadas a 4 ° C durante 30 minutos num tampão de lise (ureia 7 M, 2 M tioureia, 4% w /v de CHAPS, e Tris 10 mM, pH 7,4) com um cocktail inibidor de proteinase (Roche, Diagnostics). A concentração de proteína foi medida com o kit BCA Protein Assay (Thermo, Rockford, IL).

A análise da expressão de ARNm

em tempo real quantitativa de reacção em cadeia da polimerase-transcriptase reversa (qRT-PCR) foi realizada LightCycler utilizando aparelhos 480 (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha). Primers e sondas universais foram concebidos utilizando a sonda Biblioteca Universal (Roche Diagnostics), que especi fi ca o conjunto mais adequado. As sequências dos iniciadores utilizados para qRT-PCR foram:

KIF4A

, para a frente,

5′-TCTGTTTCAGGCTGCTTTCA -3 ‘

; reversa,

5′-GCCCTG AAATATTTGATTGGAG -3 ‘

; e sonda universal 25, eo gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH), para a frente,

5′-CATCTCTGCCCCCTCTGCTGA-3 ‘; ,

5′-GGATGACCTTGCCCACAGCCT-3 ‘reversa; e sonda universal 60. O montante transcrição para

KIF4A

foi estimada a partir das respectivas curvas padrão e normalizadas para

GAPDH

montante transcrição determinada em amostras correspondentes. Todas as amostras foram analisadas em triplicado e três preparações independentes de ARN foram analisados ​​a partir de cada linha celular.

análise de imunotransferência

extractos de proteína (20 ug) foram separados por electroforese em dodecil sulfato de gel de poliacrilamida de sódio em 4 -12% de gel, transferido para membranas de nitrocelulose e bloqueadas durante 1 hora à temperatura ambiente no bloqueio Um (Nacalai Tesque, Tóquio, Japão). As membranas foram incubadas com anticorpo de coelho anti-KIF4A anticorpo policlonal (Gene Tex, San Antonio, TX), anticorpo monoclonal de ratinho anti-GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anticorpo monoclonal anti-CDC20 rato (Santa Cruz Biotechnology), e anticorpo policlonal de coelho anti-B1 ciclina (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) durante a noite a 4 ° C. As membranas foram lavadas com 0,1% de Tween-20 em solução salina tamponada com Tris, incubadas com o anticorpo secundário e acoplado a peroxidase de rábano conjugado com anti-coelho ou anti-rato IgG (Promega, Madison, WI) durante 1 hora à temperatura ambiente. Finalmente, as membranas foram detectados utilizando substrato quimioluminescente SuperSignal West Pico (Thermo), e imunotransferência foi visualizado por exposição das membranas a ATTO claro Captura II (ATTO, Tóquio, Japão). intensidades de sinal foram quantificadas utilizando o software versão 3.0 CS Analyzer (ATTO).

A transfecção com shRNA plasmídeo

linhas celulares de CCEO (HSC-3 e Ca9-22) foram transfectadas com KIF4A shRNA (shKIF4A vetores) ou controlo shRNA (shMock) (Cruz Biotechnology de Santa) usando Lipofectamine LTX e Plus Reagentes (Invitrogen). Após a transfecção, os transfectantes estáveis ​​foram isolados por meio de cultura contendo 2 ng /mL de puromicina (Invitrogen). Duas a três semanas após a transfecção, as colónias viáveis ​​foram transferidos para novos pratos. células shKIF4A shMock e foram usadas para experiências adicionais.

Imunofluorescência

Os transfectantes foram plaqueadas em lâminas com câmara (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) a 50% de confluência, lavadas com PBS arrefecido em gelo , e fixadas com paraformaldeído a 4%, PBS durante 20 minutos, em seguida permeabilizadas em PBS contendo 0,2% de Triton X-100 como previamente descrito [43]. Foram utilizados os seguintes anticorpos primários para detectar a activação SAC: de coelho anti-KIF4A anticorpo policlonal (Gene Tex), de ratinho anti-anticorpo monoclonal BUB1 (Santa Cruz Biotechnology), e anticorpo anti rato-MAD2 (Santa Cruz Biotechnology). As células fixadas foram incubadas com uma solução de bloqueio contendo 0,5% de albumina de soro bovino durante 1 hora à temperatura ambiente e incubadas com anticorpos primários durante a noite a 4 ° C. Após lavagem com PBS, as células foram incubadas com anticorpos secundários durante 1 hora a 37 ° C. Os anticorpos secundários eram IgG de anticorpo anti-coelho conjugado com isotiocianato de fluoresceína (Vector Laboratories, Burlingame, CA) e Texas-Red-conjugado de anticorpo anti-IgG de murganho (Vector Laboratories) incubada durante 1 hora à temperatura ambiente no escuro. Finalmente, as secções foram lavadas três vezes com PBS e montadas utilizando meio de montagem com DAPI (Vector Laboratories). A imunofluorescência foi realizada por microscopia confocal e analisados ​​com o software Fluoview (Olympus Optical, Tóquio, Japão).

Cell-ciclo de análise

Para sincronizar células no G0 /G1 ou G2 /M transição, as células foram privadas de soro durante 48 horas ou tratados com 200 ng /ml de nocodazolo (Sigma) durante 20 horas [44,45]. Para determinar a distribuição do ciclo celular, as células foram colhidas, lavadas com PBS, e sondaram-se com o kit de reagente de DNA CycleTEST Plus (Becton-Dickinson, San José, CA) de acordo com o protocolo do fabricante. Determinação por citometria de fluxo do teor de ADN foi analisado por BD AccuriTM C6 Citómetro de fluxo (Becton-Dickinson). As fracções das células na fase G0-G1, S, e G2-M fases foram analisados ​​usando o software FlowJo (ár, Ashland, OR).

crescimento celular

Os transfectantes foram semeadas em placas de seis poços a uma densidade de 1 × 10

4 células viáveis ​​por poço. As células foram recolhidas durante 168 horas, e contadas a cada 24 horas. Nos pontos de tempo indicados, as células foram tripsinizadas e contadas utilizando um hemocitómetro em amostras em triplicado.

IHC

O IHC foi realizada em secções de 4-M de espécimes embebidos em parafina, utilizando anticorpo de coelho anti-KIF4A anticorpo policlonal (Gene Tex). Resumidamente, após desparafinização e hidratação, a actividade de peroxidase endógena foi extinta por 30 minutos de incubação numa mistura de solução de peróxido de hidrogénio a 0,3% em metanol a 100%; as secções foram bloqueadas durante 2 horas à temperatura ambiente com 1,5% de soro de bloqueio (Santa Cruz Biotechnology) em PBS antes de reagir com o anticorpo anti-KIF4A a 4 ° C numa câmara húmida durante a noite. Após a incubação com o anticorpo primário, as amostras foram lavadas três vezes em PBS e tratou-se com reagente de Envision (DAKO, Carpinteria, CA) seguido por desenvolvimento de cor em tetracloridrato de 3,3′-diaminobenzidina (DAKO). Os slides, em seguida, foram ligeiramente contrastadas com hematoxilina, desidratadas com etanol, limpas com xileno, e montadas. A ligação não específica de um anticorpo para que não o antigénio, por vezes, ocorreram proteínas. Como controlo negativo, as secções foram imunocoradas em triplicado sem exposição a anticorpos primários, o que confirmou a especificidade de coloração (Figura S1A). Para quantificar o status da expressão da proteína KIF4A nesses componentes, foram utilizados os sistemas de pontuação IHC descritos anteriormente [39,40,46-49]. Em resumo, as percentagens médias de células tumorais positivas foram determinadas em pelo menos três campos aleatórios a 400 x de ampliação em cada secção. A intensidade da KIF4A-imunorreacção foi pontuado como se segue: 0+, nenhum; 1+, fraco; 2+, moderada; e 3+, intenso. O número celular e da intensidade de coloração foram multiplicados para produzir uma pontuação KIF4A IHC. Considerou-se a intensidade da coloração das células do músculo esquelético, que eram controlos positivos para KIF4A (Figura S1B). Casos com uma pontuação KIF4A IHC superior a 95,0 (+3 desvio-padrão [SD] pontuação para o tecido normal) foram definidos como KIF4A-positivo. A ± corte 3-SD, o que estatisticamente seria esperado apenas 0,2% da medição para cair fora deste intervalo, foi usado porque era improvável de ser afectado por erro experimental aleatório produzido pela manipulação da amostra [50]. Dois patologistas independentes de Hospital da Universidade Chiba, nenhum dos quais tinha qualquer conhecimento do estado clínico dos pacientes, fez esses julgamentos.

A análise estatística

Na comparação de níveis de expressão KIF4A, a significância estatística foi avaliada utilizando o teste U de Mann-Whitney. As relações entre as pontuações de coloração e perfis clínico-patológicas KIF4A-imuno-histoquímica foram avaliados por χ

2, teste exato de Fisher e teste U de Mann-Whitney.

P Art 0,05 foi considerado significativo. Os dados são expressos como a média ± erro padrão da média (SEM).

Resultados

linhas celulares Avaliação da expressão KIF4A em CEB-derivados

Para investigar o ARNm expressão de

KIF4A

, foi realizada análise de qRT-PCR utilizando sete linhas celulares CCEO derivados (HSC-2, HSC-3, HSC-4, Ca9-22, SA3, Ho-1-u-1, e KON) e HNOKs.

KIF4A

ARNm foi regulada de forma significativa em todas as linhas celulares derivadas CEB-comparados com os HNOKs (Figura 1A). Os dados são expressos como a média ± SEM dos resultados em triplicado (

P

0,05). Também realizamos immunoblotting análise para investigar status de expressão da proteína KIF4A nas linhas celulares CCEO derivados e os HNOKs (Figura 1B). Um aumento significativo na expressão da proteína KIF4A foi observada em todas as linhas celulares CEs em comparação com as HNOKs. Análise da expressão indicaram que ambos os produtos de transcrição e tradução dessa molécula foram altamente expresso em linhas celulares derivadas de CEB.

(A) Quantificação da expressão de ARNm em linhas celulares KIF4A CEB-derivados por análise de qRT-PCR. Significativo a sobre-regulação de ARNm KIF4A é visto em sete linhas celulares derivadas de CEB comparação com os HNOKs (

P

0,05, teste de Mann-Whitney). Os dados são expressos como a média ± SEM dos resultados em triplicado. (B) Análise de imunotransferência de proteína KIF4A nas linhas e HNOKs celulares CCEO derivados. a expressão da proteína KIF4A é regulado para cima nas linhas celulares CCEO derivados em comparação com os do HNOKs. dados de proteínas densitométrica KIF4A são normalizados para os níveis de proteína GAPDH. Os valores são expressos como uma percentagem dos HNOKs (

P Art 0,05, Mann-Whitney U).

Estabelecimento de células KIF4A knockdown

Desde expressão KIF4A foi regulada nas linhas celulares de CCEO, estabelecemos células knockdown KIF4A utilizando tecnologias shRNA. células HSC-3 e Ca9-22 foram transfectadas com KIF4A shRNA (shKIF4A) eo controle shRNA (shMock) plasmídeos. Os níveis de expressão de ARNm e proteína KIF4A nas células shKIF4A foram significativamente mais baixos do que aqueles em que as células shMock (HSC-3 e Ca9-22 transfectantes derivados) (Figura 2A, B) (

P

0,05) .

(a) qRT-PCR demonstra que a expressão de ARNm nas células KIF4A shKIF4A transfectantes (HSC-3-e-Ca9-22 derivados; 2 clones cada uma) é significativamente menor do que nas células shMock (

P Art 0,05, teste de Mann-Whitney U). Análise (B) de imunotransferência mostra que os níveis de proteína em células KIF4A shKIF4A-transfectadas (transfectantes HSC-3- Ca9-22 e derivados; 2 clones cada) também diminuiu acentuadamente em comparação com o que as células em shMock (

P

. 0,05, teste de Mann-Whitney U)

a activação do SAC

para investigar o mecanismo pelo qual KIF4A está relacionado com o SAC, foi realizada uma análise de imunofluorescência para a proteína do fuso-checkpoint (BUB1) ea proteína sensor de ponto de verificação (MAD2). BUB1 foi encontrado em cromossomas condensados ​​nas células shKIF4A mas não foi localizada em cinetócoros nas células shMock (Figura 3A). MAD2 foi localizada em cinetócoros nas células shKIF4A, enquanto cinetócoro localização não foi observado nas células shMock (Figura 3B). O alvo directo de activação SAC é CDC20, que é o activador do complexo de promoção da anafase /ciclossoma (APC /C) [23-26]. Além disso, a ciclina B1 é um regulador essencial da progressão G2 /M e M-transição G1 [27]. Para avaliar a captura de fase M por activação do SAC, também realizado imunotransferência de CDC20 e ciclina B1, e análise de citometria de fluxo. Como esperado, enquanto CDC20 foi significativamente regulada para baixo, ciclina B1 foi regulada em shKIF4A células (Figura 4A). Além disso, a percentagem da fase G2 /M em Células shKIF4A foi significativamente (P 0,05) mais elevada do que nas células shMock (Figura 4B). Estes resultados indicaram que a sub-regulação de KIF4A pode induzir a paragem do ciclo celular ou atraso na fase M por meio de activação SAC.

Localização dos BUB1 e MAD2 aos cinetócoros é comparado em células shKIF4A e shMock por imunofluorescência. (A) BUB1 em cinetócoros aumentada em células shKIF4A comparada com a das células shMock (verde, KIF4A; vermelho, BUB1; azul, ADN). (B) apropriado de localização de MAD2 é visto em células shKIF4A, ao passo que a localização kinetochore não é visto nas células shMock. (Verde, KIF4A; vermelho, MAD2; azul, ADN)

Para investigar a ativação SAC e progressão do ciclo celular, foram determinados os níveis de CDC20 e ciclina B1, e o conteúdo de ADN de expressão na G0-G1, S e G2-M fases. células shKIF4A (A) mostrou a sub-regulação de CDC20 e a sobre-regulação da ciclina B1 (HSC-3- Ca9-22 e derivados de transfectantes; 2 clones cada) em comparação com células shMock (

P

0,05 , Mann-Whitney U test). A análise por citometria de (B) de fluxo foi realizada para investigar o ciclo celular em células shKIF4A e shMock. A percentagem do /fase G2 M em células transfectantes shKIF4A (HSC-3- Ca9-22 e derivados; 2 clones cada) aumentou marcadamente em comparação com células shMock (

P

0,05, teste de Mann-Whitney U test).

crescimento celular reduzida em células KIF4A knockdown

Para avaliar o efeito da KIF4A knockdown no crescimento celular, foi realizado um ensaio de proliferação celular. células shKIF4A shMock e foram semeadas em placas de seis poços a uma densidade de 1 x 10

4 células viáveis ​​/poço que foram contadas durante 168 horas. Houve um aumento significativo (

P

0,05). Diminuição no crescimento celular das células shKIF4A em comparação com as células shMock (Figura 5)

Para determinar o efeito de shKIF4A sobre a proliferação celular, células shKIF4A shMock e foram semeadas em placas de seis poços a uma densidade de 1 x 10

4 células viáveis ​​/poço. Ambos os transfectantes foram contados em sete dias consecutivos. O crescimento celular de células shKIF4A-transfectadas (HSC-3- e transfectantes Cas9-22-derivados; 2 clones cada uma) foram significativamente inibido em comparação com as células shMock após 7 dias (168 horas). Os resultados foram expressos como a média ± SEM de valores a partir de três ensaios. Os asteriscos indicam diferenças significativas entre as células shKIF4A e shMock (

P Art 0,05, Mann-Whitney U)

Avaliação da expressão da proteína KIF4A na primária CCEO

.

Os resultados representativos para IHC proteína KIF4A em tecido oral normal e CEB primária são apresentados na Figura 6A-C. A coloração positiva foi observada predominantemente nos núcleos de amostras CEs primárias (Figura 6A, B). As pontuações KIF4A IHC em carcinoma epidermóide estudados primárias (62.3-188 com mediana de 131) foram significativamente maiores do que aqueles em tecidos normais (26.5-103, mediana, 66,5) (Figura 6C) (

P Art 0,05). Definimos casos com uma pontuação superior a 95 IHC (score 3 SD para o tecido normal) como KIF4A-positivo. As correlações entre as características clinicopatológicas dos pacientes com CEB e o estado da expressão da proteína KIF4A estão apresentados na Tabela 1. Entre os parâmetros clínicos, a expressão KIF4A foi significativamente relacionada (

P

0,05) para o tamanho primário os tumores de CEs. Estes resultados sugeriram que KIF4A pode ser relacionado de perto a progressão tumoral. resultados

Representante de IHC para a proteína KIF4A em tecido normal oral (A) e CCEO primário (B). A, B: Original ampliação, × 400. As barras de escala, 10 | im. imunorreactividade KIF4A forte foi detectada no carcinoma epidermóide estudados primárias; tecidos orais normais apresentam imunocoloração quase negativa. C: O estado da expressão da proteína KIF4A no carcinoma epidermóide estudados primários (n = 106) e as contrapartidas normais. As pontuações KIF4A IHC foram calculados como se segue: Pontuação IHC = 0 × (número de células não coradas no campo) + 1 × (Número de células fracamente coradas no campo) + 2 x (Número de células moderadamente coradas no campo) + 3 × (número de células intensamente coradas no campo). As pontuações KIF4A IHC para tecidos e carcinoma epidermóide estudados orais normais variou de 26,5-103 (mediana, 66,5) e 62,3-188 (mediana, 131), respectivamente. KIF4A níveis de expressão de proteínas em carcinoma epidermóide estudados são significativamente (

P Art 0,05, U de Mann-Whitney). Maior do que em tecidos orais normais

Resultados da imunocoloração

classificação clínica

No. pacientes (%)

total

KIF4A- negativo

KIF4A positivo

P

valor

a

idade na cirurgia (anos) 603914 (36) 25 (64) ≧ 60, 702212 (55) 10 (45) 0,121

b

≧ 704510 (22) 35 (78) Sexo Male7529 (39) 46 (52) 0,122

c

Female31 7 (23) 24 (77) T-primário tumor T19 5 (56) 4 (44) 0,005

d

T25825 (43) 33 (57) T319 3 (16) 16 (84) T420 3 (15) 17 (85) T1 + T26730 (45) 37 (55) 0,010

c

T3 + T439 6 (15) 33 (85) N-regional linfonodo N (-) 4515 (33) 30 (67) 0,920

c

N (+) 6121 (34) 40 (66) Stage I9 5 (56) 4 (44) 0,121

d

II3814 (37) 24 (63) III11 4 (36) 7 (64) IV4813 (27) 35 (73) tipo de histopatológico Well6123 ( 38) 38 (62) 0,352

d

Moderately3711 (30) 26 (70) Poorly8 2 (25) 6 (75) local tumoral Gingiva32 9 (38) 23 (63) 0,861

d

Tongue6527 (42) 38 (58) Bucal mucosa6 0 (0) 6 (100) floor3 Oral 0 (0) 3 (100) Tabela 1. Correlação entre a expressão KIF4A e classificação clínica no carcinoma epidermóide estudados.

a

P Art 0,05 foi considerado significativo,

b

χ

2 teste,

c

teste exato de Fisher,

d

teste U de Mann-Whitney. CSV Baixar CSV

Discussão

Desde KIF4A foi overexpressed frequentemente em linhas de células de CCEO derivados, estabelecemos células KIF4A knockdown para ver se ou não KIF4A tem funções críticas em carcinoma epidermóide estudados. shKIF4A células mostraram diminuição no crescimento celular por activação SAC que conduz a paragem do ciclo celular da fase M. Além do

in vitro

de dados, também descobrimos que KIF4A foi regulada em amostras de CCEO clínicos em comparação com tecidos normais e que os casos de CCEO KIF4A-positivos foram estreitamente relacionadas com o tamanho tumoral. Estes resultados indicaram que KIF4A está ligada à regulação do ciclo celular na fase M e desempenha um papel importante na progressão tumoral no carcinoma epidermóide estudados.

Muitos estudos têm indicado que KIFS desempenham papéis críticos, incluindo o desenvolvimento e progressão tumoral, em cancros [12-14,31,32]. Entre eles, KIF2C, KIF18A, KIF20A e KIF20B foram regulados positivamente em várias malignidades e associada com a progressão tumoral [51-56]. Em contraste, KIF1A foi regulada para baixo no carcinoma da nasofaringe e relatado como um potencial supressor tumoral [57]. KIF4A foi sobre-expresso em cancros do colo do útero e pulmão [58,59], enquanto KIF4A foi regulada para baixo em cancros gástricos [60]. Além da corrente de dados que KIF4A foi significativamente regulada para cima no carcinoma epidermóide estudados, Castillo et ai. relataram que a sobre-expressão de alguns cinesinas a motor, incluindo KIF4A, as quais geram forças externas adicionais durante a mitose, induz a separação do fuso excessiva conduzindo a uma distribuição desigual de material genético em anafase e, eventualmente, o desenvolvimento de células filha afectada por aneuploidia [61]. Por outro lado, vários estudos têm relatado que a perda de KIF4A pode afetar a proliferação tumoral e carcinogênese [34,62]. Devido a resultados conflitantes como estes, são necessários mais estudos para compreender melhor os papéis complexos KIF4A desempenha no desenvolvimento e progressão do câncer.

As novas descobertas no estudo são a correlação entre KIF4A knockdown e interromperam a mitose resultante da activação SAC. A via de activação do SAC está rigidamente controlado por proteínas do checkpoint do fuso, tais como BUB1 e MAD2 [17-22]. Em resposta ao apego inadequado de cromossomos a fuso microtúbulos, que causam divisão celular anormal, BUB1 está concentrada nas cinetócoros em células mitóticas e ajuda a localizar MAD2 em cinetócoros [62-64]. MAD2 activado localizada corretamente em cinetócoros pode inibir CDC20, que ativa a ubiquitina ligase conhecido como APC /C [65-67]. Assim, esta evidência indica que KIF4A knockdown pode causar activação SAC através da APC /C inativação [23-27].

Verificou-se que níveis elevados de ciclina B1 e de captura de fase M, foram observadas nas células KIF4A knockdown. Durante a fase de indução da paragem G2 /M, após o tratamento de células com inibidores de microtúbulos que activam o SAC, interferindo com a dinâmica dos microtúbulos e estabilidade, tais como o paclitaxel e nocodazol, um aumento acentuado nos níveis de proteína ciclina B1 foi também observada [65-69]. Portanto, a regulação negativa de KIF4A induziu a paragem do ciclo celular de células de CCEO por funções semelhantes dos inibidores de microtúbulos

Os níveis de expressão de proteína KIF4A em carcinoma epidermóide estudados primários foram correlacionadas com o tamanho tumoral.; isto implica fortemente que KIF4A pode desempenhar um papel importante na progressão e desenvolvimento de carcinoma epidermóide estudados. Tomados em conjunto, a estratificação de pacientes com CEB com base no status KIF4A pode proporcionar uma abordagem mais personalizada para a terapia do cancro oral humana.

Conclusão

Os resultados atuais mostraram, pela primeira vez fi que KIF4A é sobre-expresso com frequência em CEB, o que sugere que a interferência na função das proteínas do eixo do checkpoint, tais como BUB1, MAD2, e CDC20. KIF4A expressão foi correlacionada com o tamanho tumoral em casos KIF4A-positivo, sugerindo que a activação SAC desempenha um papel importante na proliferação celular em CEB. expressão KIF4A é provável que seja um regulador chave da progressão tumoral no carcinoma epidermóide estudados.

Informações de Apoio

Figura S1.

KIF4A imunoatividade nos controlos negativos e positivos. Para avaliar a especificidade do anticorpo KIF4A, examinámos a intensidade da coloração de controlos negativos e positivos. ampliação original, × 400. As barras de escala, 10 | im. (A) como um controlo negativo, as amostras foram imunocoradas primárias CEs sem exposição a anticorpos primários. Não havia células marcadas. (B) o tecido do músculo esquelético é um controlo positivo para KIF4A. imunorreactividade KIF4A forte foi especificamente detectado no núcleo das células.

doi:. 10.1371 /journal.pone.0085951.s001

(TIF)

Reconhecimentos

Agradecemos Ms. Lynda C. Cartas da International Medical para a edição deste manuscrito