Abstract

epitelial-mesenquimal de transição (EMT) é um dos mecanismos de resistência adquirida aos inibidores de do factor de crescimento epidérmico tirosina-quinases de receptor-(EGFR-TKI) no cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC). Os mecanismos precisos de resistência adquirida relacionada EMT-a EGFR-TKI em NSCLC permanecem obscuros. Geramos células HCC4006 resistentes ao erlotinib (HCC4006ER) por exposição crônica de

EGFR

células HCC4006 -mutant a concentrações crescentes de erlotinib. células HCC4006ER adquiriu um fenótipo de EMT e ativação do TGF-β /via SMAD, ao faltar tanto T790M secundário

EGFR

mutação e

MET

amplificação do gene. Nós empregamos microarrays expressão gênica em HCC4006 e células HCC4006ER para entender melhor o mecanismo de resistência adquirida EGFR-TKI com EMT. Ao nível do ARNm,

ZEB1 (TCF8)

, conhecido um regulador de EMT, foi 20 vezes mais elevadas do que nas células HCC4006ER HCC4006 em células, e aumentou ZEB1 nível de proteína também foi detectada. Além disso, numerosos

ZEB1

genes sensíveis, tais como

CDH1 (E-caderina)

,

ST14

, e

vimentina

, foram coordenadamente regulada juntamente com aumento

ZEB1

em células HCC4006ER. Também identificamos superexpressão ZEB1 e um fenótipo de EMT em várias células NSCLC e amostras de NSCLC humanas com a resistência adquirida EGFR-TKI. Curto-RNA de interferência contra a

ZEB1

inverteu o fenótipo EMT e, sobretudo, restaurado sensibilidade erlotinib em células HCC4006ER. O nível de micro-ARN-200c, que pode regular negativamente ZEB1, foi significativamente reduzida em células HCC4006ER. Nossos resultados sugerem que o aumento da

ZEB1

pode dirigir resistência adquirida relacionadas com a EMT de EGFR-TKI em NSCLC. Devem ser feitas tentativas para explorar a segmentação

ZEB1

para resensitize tumores resistentes-TKI

Citation:. Yoshida T, Song L, Bai Y, Kinose F, Li J, Ohaegbulam KC, et al. (2016) ZEB1 Medeia resistência adquirida ao Fator de Crescimento Epidérmico Receptor-tirosina-quinase Inibidores em Non-Small Cell Lung Cancer. PLoS ONE 11 (1): e0147344. doi: 10.1371 /journal.pone.0147344

editor: Pier Giorgio Petronini, Universidade de Parma, Itália

Recebido: 23 Março, 2015; Aceito: 01 de janeiro de 2016; Publicação: 20 de janeiro de 2016

Direitos de autor: © 2016 Yoshida et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação. O conjunto de dados microarray foi submetido a Gene Expression Omnibus (GEO) com o número de acesso GSE71587

Financiamento:. O trabalho foi parcialmente financiado por doações do SPORE Moffitt Cancer Center no cancro do pulmão (P50-CA119997), NCI 1R01 CA121182, eo Colorado Lung Cancer SPORE NCI-CA58187 (HD, PN, RMG). Este trabalho também foi apoiado em parte pela Biologia Molecular e Sequenciamento Core, o Core Tissue, eo Core Microarray no H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, um Comprehensive Cancer Center NCI designado (P30-CA076292). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Apesar do benefício de inibidores de fator de receptor de tirosina-quinase de crescimento epidérmico (EGFR-TKI) no cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC pacientes) com

EGFR

mutação [1], a resistência adquirida aos estas terapias é um problema clínico importante. Embora o T790M secundário

EGFR

mutação [2] e

MET

amplificação do gene [3] podem, juntos, respondem por 70% dessa resistência, mecanismos para os restantes 30% não são claras. A transição epitelial-mesenquimal (EMT) foi negativamente associado com a sensibilidade EGFR-TKI em NSCLC [4-7]. Em linha com estes resultados, estudos recentes relataram EMT como um possível mecanismo de resistência adquirida EGFR-TKI em modelos de linha celular NSCLC [8,9]. Além disso, EMT foi observada num subgrupo de doentes com NSCLC, que desenvolveram resistência EGFR-TKI [10,11]. No entanto, os mecanismos detalhados dos relacionados com a resistência adquirida EMT a EGFR-TKI em NSCLC, bem como as estratégias para superar isto, permanecem incertos [8,9]. factores de transcrição de várias vias de sinalização, tais como FGFR [6,12], o TGF-p [8,9], e Wnt [13], bem como, tais como o dedo de zinco de E-box de ligação a uma caixa homeo (ZEB1) [ ,,,0],14], têm sido implicados no processo de EMT.

o EMT permite que as células epiteliais para obter um fenótipo mesenquimal associada com o aumento da migração (para revisões [15-20]). É um mecanismo essencial para a plasticidade durante o desenvolvimento e reparação de tecidos. Ele está envolvido na cicatrização de feridas, fibrose, e biologia das células estaminais e contribui para a progressão da fibrose de órgão doenças similares e cancro. EMT é activado em células de cancro e envolvidas na invasão, metástase, propriedades estaminais semelhante, e resistência a terapias antineoplásicas convencionais [15,21,22]. EMT é induzida por TGF-p, outros factores de crescimento, e hipoxia e envolve factores de transcrição, como caracol, torção, ZEB1 /ZEB2, e E12 /E47 para modificar a maquinaria transcricional, alteração da tradução e estabilidade da proteína, a expressão de RNAs não-codificantes, e splicing alternativo [16,23,24]. características clássicas de EMT são a perda de adesão celular e reprogramação do citoesqueleto. Baixa E-caderina e alta vimentina e N-caderina expressões são marcadores clássicos EMT. No promotor E-caderina, os associados LSD1 histona desmetilase com caracol, o fator de transcrição envolvido nas etapas iniciais de indução EMT, sugerindo modificações epigenéticas durante EMT [25,26]. Com efeito, H3K27 acetilação foi diminuída em EMT induzida por ZEB1 em células de cancro pulmonar [27]. Recentemente, características moleculares associados a EMT foram definidos por uma abordagem integrativa no adenocarcinoma de pulmão e apontou para uma associação entre citoesqueleto e proteínas de ligação de actina, o fenótipo EMT e propriedades invasivas [28]. Curiosamente, EMT é terapêutica clínica transitórias e reversíveis, e novas dirigidas EMT estão em desenvolvimento [29].

Nós estabelecemos células HCC4006ER (erlotinib resistente) como um modelo de resistência adquirida relacionadas com a EMT de EGFR-TKI por exposição crónica de células sensíveis HCC4006 NSCLC contendo um

EGFR

mutação (exon 19; L747-A750del INSP) a concentrações crescentes de erlotinib. Nós examinamos as mudanças globais na expressão do gene para identificar moléculas e caminhos que possam contribuir para EMT-relacionada a resistência adquirida EGFR-TKI em NSCLC. Além disso, o nível de micro-ARN-200c (miR-200c) foi examinada a expressão baseado em relatórios que o miR-200c regula negativamente ZEB1 e o processo de EMT [30-32].

Materiais e Métodos

Reagentes

LBH589, erlotinib, BIBW2992, WZ4002, BEZ235 e AZD6244 foram adquiridos da Chemie Tek (Indianapolis, IN). PD173074, LY364947, salinomicina, e IWP2 foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). CNTO328 foi fornecida pela Centocor, Inc. (Horsham, PA). CL-387785 foi adquirido a AXXORA (San Diego, CA). As soluções de reserva destes reagentes em DMSO a 100% foram diluídos diretamente para a mídia para concentrações indicadas. Humana TGF-β1 foi adquirido a R .; D Systems (Minneapolis, MN)

cultura celular

células

HCC4006, H1975 e H358 foram obtidas a partir de ATCC (American Type Culture Collection). identidade da célula foi verificada por análise de STR (ACGT, Inc., Wheeling, IL), e as células foram confirmadas como sendo negativo por micoplasma PlasmoTest Detecção de Mycoplasma (Invivogen, San Diego, CA). As células foram mantidas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS; Invitrogen, Carlsbad, CA) a 37 ° C e 5% de CO

2 células resistentes a EGFR-TKI

Geração de.

HCC4006ER células (erlotinib resistente) foram gerados pela exposição de HCC4006 células contendo um

EGFR

mutação (exon 19; L747-A750del INSP) para aumentar gradualmente as concentrações de erlotinib, com início às 3 nM , durante 3 meses. Após a adaptação inicial, a concentração erlotinib foi gradualmente aumentada para 4 uM. células H1975 BIBW-R e H1975 WZ-R foram gerados pela exposição de H1975 células contendo um

EGFR

mutação (exon 21; L858R e exon 20; T790M) para aumentar gradualmente as concentrações de BIBW2992 (irreversível EGFR-TKI afatinib ) ou WZ4002 (T790M seletiva EGFR-TKI), com início às 3 nM, durante 3 meses. Após a adaptação inicial, a concentração ou BIBW2992 WZ4002 foi gradualmente aumentada para 3? M ou 15? M, respectivamente. clones de células individuais de estas células foram obtidas por semeadura a muito baixa densidade.

Status da

EGFR

e

KRAS

mutações

O ADN genómico total de parental e células resistentes foi preparado utilizando o DNeasy Blood Kit de tecido (Qiagen, Valencia, CA) de acordo com o manual do produto. seqüenciamento direto do DNA foi usado para detectar

EGFR

e

KRAS

mutações como descrito anteriormente [33]. Nós também aplicado o ensaio de PCR-invasor de olhar para as populações menores de células mutantes T790M, como descrito anteriormente [34].

A viabilidade celular ensaio

A viabilidade celular foi determinada utilizando o CellTiter-Glo

® celular luminescentes Viabilidade Assay (Promega, Madison, WI) de acordo com as recomendações do fabricante. Resumidamente, as células foram colocadas em placas a 3×10

3 células por poço em placas de parede negra de 96 poços (NUNC, catálogo n ° 165305;. Rochester, NY) e incubadas durante a noite em RPMI com 5% de FBS. As células foram então expostas a diluições em série de inibidores durante 72 horas. Cinquenta microlitros de Cell-Titer Glo Reagente foram adicionados a cada poço, e a luminescência foi registada usando um leitor de placa Victor (PerkinElmer, Waltham, MA). Os resultados foram convertidos para a viabilidade celular por cento através da comparação com as culturas tratadas (100%) não tratados viáveis ​​a partir de três experiências independentes realizadas em triplicado. Índice de combinação (IC) na dose de IC50 de tratamento de combinação foi calculada pelo software CompuSyn (https://www.combosyn.com/; ComboSyn, Paramus, NJ). CI 1, CI = 1 e CI . 1 indicam, aditivos e sinérgicos efeitos antagônicos, respectivamente [35]

matriz RTK

células

HCC4006 e HCC4006ER foram incubadas em meio RPMI com 5 % de FBS durante 24 horas, até que ~ 80-90% de confluência de células. níveis de fosforilação de várias tirosina-quinases receptoras (RTK), incluindo aqueles do EGF, FGF, PDGF, insulina, VEGF, Eph, famílias AXL, e mer (entre outros), foram examinadas utilizando o kit de matriz proteoma Profiler humano Phospho-RTK ( R D Systems) como anteriormente descrito [3]

análise de expressão proteica

As células foram cultivadas até à confluência ~ 80-90% antes da colheita e lise.. A análise Western blot de lisados ​​de células inteiras foi realizada como descrito anteriormente [36]. Os extractos nucleares para detecção de factores de transcrição foram preparados como anteriormente descrito [37]; Prepararam-se 25 ug de proteína para cada amostra. Os anticorpos primários para EGFR (# 2232), MET (# 3127), pY1234/Y1235-MET (# 3129), Y1289-Her3 (# 4791), pT705-STAT3 (# 9131), pS536-NFkB-p65 (# 3031) , pS465 /467-Smad2 (# 3101), Akt (# 9272), pS473-Akt (# 9271), Erk (# 9102), pT202 /T204-Erk (# 4377), e PARP (# 9542) foram obtidos a partir de Cell Signaling (Beverly, MA). Os anticorpos primários para pY1068-EGFR (# 44-788G) foram obtidos de Invitrogen. Os anticorpos primários para vimentina (BDB550513) foram adquiridos a BD Biosciences (San Diego, CA). Os anticorpos primários para ZEB1 (sc25388), fibronectina (sc29011), Her3 (sc285), E-caderina (sc8426), N-caderina (sc7939), PTEN (sc7974), Caracol (sc28199), Slug (sc15391), Twist (sc6269 ), e lamina A /C (sc20681) foram obtidos de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Os anticorpos primários de p-actina (SigmaA-1978) foram adquiridos a Sigma-Aldrich. Peroxidase de rábano conjugado de cabra anti-ratinho (NXA931) e anti-coelho (NA934V) os anticorpos secundários foram obtidos da Amersham Biosciences (Piscataway, NJ).

Criação das células com sobre-expressão de Her3 HCC4006ER estável

A proteína fluorescente (GFP) plasmídeo retroviral verde foi generosamente fornecidos pelo Dr. Florian Grebien e Dr. Oliver Hantschel (Instituto CEMM, Viena, Áustria). Subclonagem de Her3 no plasmídeo retroviral e estabelecimento de linhas celulares estáveis ​​com sobreexpressão foram realizados como previamente descrito [36,38]. Resumidamente, o ADNc de Her3 humana foi comprado de Addgene (Cambridge, MA) e amplificada por PCR utilizando o iniciador de sentido directo 5′-CACCATGAGGGCGAACGACGCTCT-3 ‘e iniciador 5′-CGTTCTCTGGGCATTAGCCTT-3 inverter’. O produto de PCR foi inserido Her3 em pENTR D-TOPO vector e, em seguida, introduzido no vector pfMSCV C-Strep-HA IRES GFP-GW por Kit gateway LR ClonaseTM mistura de enzima II (Invitrogen). Os retrovirus foram empacotados em células HEK293 Phoenix a partir de ATCC (Manassas, VA) e utilizados para infectar células HCC4006ER. Duas semanas após a infecção, as células HCC4006ER GFP positivas foram classificadas segundo a FACSVantage (BD Biosciences) na Moffitt Citometria de Fluxo Core.

Migração (zero) de ensaio e microfotografia

HCC4006 e as células foram semeadas HCC4006ER em placas de 6 cm e incubadas durante a noite em meio RPMI com 10% de FBS para criar monocamadas confluentes. As monocamadas de células foram raspadas em linha recta com uma ponta de pipeta de 1000 mL e foram incubadas durante um período adicional de 12 horas. aparência celular foi visto com um microscópio invertido Olympus CKX41 (Olympus, Center Valley, PA) e fotografado com uma infinidade Uma câmera com captura Infinito /Analisar software (Lumenera Corp., Ottawa, ON).

TGF-β1 ELISA

HCC4006 ou HCC4006ER células (5 x 10

5) foram semeadas em placas de 6 poços e incubadas durante a noite em RPMI com 10% de FBS. O meio foi substituído com meio RPMI isento de soro com ou sem erlotinib (1 uM) e incubou-se durante mais 24 horas. Os sobrenadantes foram recolhidos para ELISA para TGF-β1 humano (R D Systems). Seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante

Plasmídeos e mediada por lipossomas transferência de genes

O repórter de luciferase p3TP-Lux contém três repetições do elemento de TPA-responsivo fundido com uma porção do promotor de PAI-1 (fornecido por J. Massagué, Sloan Kettering Cancer Center, Nova Iorque, Nova Iorque). pSBE4-Luc contém quatro cópias do elemento de ligação de Smad (SBE). As transfecções transientes foram realizados como descrito anteriormente [12], com algumas modificações. Resumidamente, o ADN plasmídico (1,7 ng de um plasmídeo repórter da luciferase) foi misturado com 10 uL de reagente de Fugene (Roche Diagnostic) e incubou-se durante 15 minutos à temperatura ambiente antes da adição às culturas semiconfluentes células em pratos de cultura de tecidos de 60 mm. Quatro horas após a transfecção, as células foram tratadas com 5 ng /mL de TGF-β, 1 uM de erlotinib, ou ambos. Quarenta e oito horas após a transfecção, a quantidade de actividade enzimática de luciferase nos extractos celulares foi determinada utilizando o Sistema de Ensaio de Luciferase (Promega Corporation). Vinte microlitros de extractos de células foram adicionados a 100 ul de reagente de Luciferase, e a quantidade de luz produzida foi medida utilizando um Luminómetro Barthold (Wallac, Inc., Gaithersburg, MD). A quantidade de proteína presente nos extractos celulares foi determinada utilizando o ensaio da Bio-Rad Bradford.

Isolamento de ARN e purificação

As células foram incubadas em meio RPMI com 10% de FBS durante 48 horas a ~ 80-90% de confluência de células. O ARN total foi recolhido via RNeasy Mini Kit (Qiagen) seguindo o manual do produto. Para garantir mRNA de alta qualidade para microarrays expressão gênica, HCC4006 e RNA total HCC4006ER foi examinado por Bioanalyzer no tecido Núcleo Moffitt.

Gene expressão microarray e bioinformática análise

Para cada linha celular, o total ARN a partir de amostras em triplicado foi preparada e misturada de forma igual. As amostras de ARN (10 ug para cada linha celular; 500 ng /mL) foram analisadas pela Affymetrix Gene Profiling chip de matriz HG-U133 (Affymetrix, Santa Clara, CA) na Moffitt Microarray Core. Os dados foram normalizados utilizando MAS5, e as diferenças na fold-change foram calculadas entre HCC4006ER e HCC4006 células (HCC4006ER /HCC4006). Uma dobra-mudança positiva indicou um rácio mais elevado em células HCC4006ER, enquanto que um fold-variação negativa indicaram maior expressão em HCC4006 células. As alterações na expressão do gene ± 1,5 vezes foram consideradas significativas [39]. conjuntos de genes foram analisados ​​por MetaCore (https://portal.genego.com; MetaCore, CA) [40]. Os dados de rede foram integrados e visualizados por Cytoscape (https://cytoscape.org/) [41]. O nosso conjunto de dados de microarray foi submetido a Gene Expression Omnibus (GEO) com o número de acesso GSE71587.

quantitativo em tempo real de RT-PCR A análise

Após o isolamento de ARN como acima, quantitativo em tempo real de RT -PCR foi realizada como previamente descrito [14,42]. primers previamente relatados foram utilizados para ZEB1, Caracol, Lesma, E-caderina, EpCAM, ESRP1, ST14, vimentina, N-caderina, e FGFR1 [14].

ZEB1 superexpressão em H358 células

O gene foi clonado no ZEB1 pcDNA5-FRT-TO e transfectado em células H358-TRex FlpIn seguido de selecção para resistência a 5 ug /ml de blasticidina e 100 ug /ml de higromicina, como previamente descrito [14]. 6-myc-ZEB1 sobre-expressão foi induzida em células transfectadas de forma estável utilizando 10 ng /mL de doxiciclina durante 5 dias.

A análise imuno-histoquímica de ZEB1

foi realizada coloração imuno-histoquímica para ZEB1 como previamente descrito [14] . Resumidamente, fatias de tumores embebidos em parafina foram desparafinados em Histoclear e reidratadas seguido de recuperação antigênica em ebulição Antígeno Unmasking Solution. As amostras de tumor foram coletados a partir de amostras cirurgicamente ressecados, conforme relatado anteriormente [10]). aprovados consentimentos informados por escrito a revisão do conselho institucional para a utilização de amostras de tecidos tumorais foram obtidos de todos os pacientes ou de seus responsáveis ​​legais (Institutional Review Board da Universidade de Saúde Ocupacional e Ambiental, Japão, número IRB 08-05). peroxidases endógenas foram inibidas (0,3% H

2O

2) e os tecidos foram permeabilizadas com 0,5% de Triton (20 minutos). As lâminas foram bloqueadas com soro de BSA /5% de cabra a 3%, incubou-se durante 2 horas com primário de coelho anti-ZEB1 (1:50), e lavou-se extensivamente. As lâminas foram então incubadas durante 1 hora com anticorpos anti-coelho biotinilado, lavadas, desenvolvidas e com Vectastain ABC, de acordo com o protocolo do fabricante (Vector Laboratories, Inc.).

A quantificação de miR-200c

O ARN total foi extraído por TRIzol (Invitrogen). A transcrição reversa para madura miR-200c e RNU6B foi realizada com 20 ng de ARN total com o kit TaqMan MicroRNA transcrição inversa que inclui a transcriptase reversa MuLV (Applied Biosystems, Foster City, CA). O ensaio TaqMan MicroRNA correspondente quantitativo foi usado para PCR em tempo real com o sistema GeneAmp 7500 (Applied Biosystems). Os dados são expressos como a percentagem de RNU6B, 100×2

-ΔCt, onde ΔCt = Ct

miR-200c- Ct

RNU6B.

A transfecção de curto interferindo RNA

pré-validado curto-ARN interferente (siRNA; Invitrogen, catálogo n ° HSS110549.) foram utilizados para inibir a ZEB1 endógena. Em-alvo mais não-Targeting piscinas de controlo negativo foram obtidos a partir de Dharmacon (Lafayette, CO) e utilizado como controlo negativo. A transfecção foi realizada com Lipofectamina RNAiMAX de Invitrogen utilizando o procedimento de transfecção inversa, tal como recomendado pelo fabricante.

Resultados

erlotinib exposição crónica de células HCC4006 gera resistência da célula-autónoma estável ao EGFR-TKI sem T790M ou

MET

amplificação

Para gerar clones resistentes EGFR-TKI-a partir de um

EGFR

-mutant linha de células NSCLC, que expuseram células HCC4006 EGFR-TKI-sensíveis com

EGFR

mutação (exon 19; L747-A750del INSP) a concentrações crescentes de erlotinib (até 4 M) durante 3 meses. HCC4006ER células tornou-se altamente resistentes à erlotinib e irreversível da EGFR-TKI, CL387,785 (Fig 1A). Esta resistência era estável, uma vez que não foi revertida por cultura de células para HCC4006ER até 6 meses em meio isento de erlotinib (Fig S1). Nós também estabelecida 5 clones de células únicas de células HCC4006ER (HCC4006ER-S1 para -S5 células), que foram, cada um individualmente resistentes ao erlotinib no mesmo grau que a população HCC4006ER grandes quantidades (Fig S2A). Assim, o fenótipo de resistência à célula era estável e autónoma.

A, células HCC4006 HCC4006ER e foram tratadas durante 72 horas com concentrações crescentes de erlotinib ou CL387,785. Os dados gerados pelo ensaio de viabilidade celular (CellTiter-Glo) são expressos como uma percentagem do valor para as células não tratadas. As barras de erro representam SEM de 3 experiências independentes. As células B, HCC4006 HCC4006ER e foram incubadas durante 24 horas a ~ 80-90% de confluência de células. lisado de células totais de cada linha de células foi recolhido e submetido a matriz Kit proteoma Profiler humano Phospho-RTK para examinar os níveis de fosforilação de várias RTKs. Detectados fosfo-RTKs na matriz estão circulados. As manchas nos quatro cantos da matriz RTK são controlos positivos. células C, HCC4006 HCC4006ER e foram incubadas durante 6 horas ± erlotinib (1 uM). lisados ​​celulares foram submetidos a análise de expressão de proteína com anticorpos para pEGFR, EGFR, PMET, MET, pHer3, Her3, PTEN, pAkt, Akt, Perk, Erk, e β-actina.

Foi examinada a

EGFR

estado do gene de ambas as células sensíveis e resistentes para a mutação T790M secundária no exão 20. Embora as células HCC4006ER retido exão 19 L747-A750del INSP, T790M não foi detectada mesmo com o ensaio de PCR-invasor [34], o que é mais sensível do que a sequenciação directa (dados não mostrados). Além disso, não encontramos

KRAS

mutações hotspot (exão 1 G12V e exão 2 Q61H; dados não mostrados), que está associado com a resistência EGFR-TKI primária em NSCLC [43]. Para investigar outros mecanismos relatados de resistência EGFR-TKI tais como

MET

amplificação [3], a ativação do IGFR sinalização [44], ou a perda de proteína PTEN [45], examinamos as moléculas-chave da via EGFR por western blot e empregou uma matriz fosfo-RTK para o levantamento de vários RTKs ativadas. No entanto, não observamos mecanismo de resistência previamente identificados para EGFR-TKI, incluindo regulada MET ou atividade IGFR (Fig 1B) ou perda de proteína PTEN em células HCC4006ER (Fig 1C). Em termos de sinalização de EGFR, a capacidade de erlotinib de inibir a fosforilação do EGFR foi retida em ambas as células e HCC4006 HCC4006ER. No entanto, os níveis de fosfo-Akt e Erk foram sensíveis à do erlotinib apenas nas células parentais HCC4006, em contraste com HCC4006ER células (Fig 1C).

Um estudo anterior relatou que Her3 medeia a sinalização de PI3K /AKT em gefitinib- linhagens de células NSCLC sensíveis [46]. No entanto, a nossa análise de transferência de Western demonstrou que as células HCC4006ER completamente perdido a expressão da proteína em comparação com Her3 HCC4006 células, explicando a perda de Her3 fosforilação nestas células observadas na matriz de RTK e análise de Western (Figura 1B e 1C). Para determinar se a perda de HER3 poderia explicar a resistência ao erlotinib em células HCC4006ER, geramos Her3 superexpressando (células HCC4006ER-Her3) utilizando infecção por lentivírus para examinar os efeitos de erlotinib sobre a proliferação celular e da via EGFR. células HCC4006ER-Her3 mantiveram a sua resistência ao erlotinib (Figura 2A), bem como a persistência de fosfo-Akt e fosfo-Erk (Figura 2B), semelhante às células HCC4006ER originais e controlo sobre-expressão de GFP derivadas de lentivírus (HCC4006ER-GFP). Estes resultados indicam que a perda de Her3 não conduzir erlotinib resistência em células HCC4006ER.

a, células HCC4006ER com GFP estável ou a sobre-expressão de Her3 (HCC4006ER-GFP e células HCC4006ER-Her3), bem como HCC4006 e as células originais HCC4006ER foram tratadas durante 72 horas com concentrações crescentes de erlotinib. Os dados gerados pelo ensaio de viabilidade celular (CellTiter-Glo) são expressos como uma percentagem do valor para as células não tratadas. As barras de erro representam SEM de 3 experiências independentes. B, HCC4006, HCC4006ER, HCC4006ER-GFP, e HCC4006ER-Her3 células foram incubadas durante 6 horas ± erlotinib (1 uM). Os lisados ​​celulares foram sujeitos a análise de expressão de proteína com anticorpos para Her3, pEGFR, EGFR, PTEN, pAkt, Akt, PERK, Erk, e β-actina. C, as células foram tratadas HCC4006ER durante 72 h com concentrações crescentes de erlotinib isoladamente, BEZ235 sozinho, AZD6244 sozinho, ou BEZ235 e AZD6244 em combinação. HCC4006 células foram tratadas durante 72 horas com concentrações crescentes de erlotinib, durante 72 horas, para traçar uma curva de referência. Os dados gerados pelo ensaio de viabilidade celular (CellTiter-Glo) são expressos como uma percentagem do valor para as células não tratadas. As barras de erro representam SEM de 3 experiências independentes. índice de combinação (IC) na dose de CI50 BEZ235 combinado com AZD6244 foi calculada pelo software CompuSyn. CI 1, CI = 1 e CI 1 indicam, aditivos e efeitos sinérgicos antagônicas, respectivamente. D, HCC4006 Ambos e células HCC4006ER foram incubadas durante 6 ou 24 horas ± erlotinib (1 uM), BEZ235 (500 nM), ou AZD6244 (1 uM) como indicado. Os lisados ​​celulares foram sujeitos a análise de expressão de proteína com anticorpos para pEGFR, EGFR, pAkt, Akt, vantagens, e Erk (amostras de 6 horas) ou para PARP juntamente com anticorpos para P-actina como um controlo de carga (amostras de 24 horas).

com a fosforilação persistente de Akt e Erk em células HCC4006ER, examinámos os efeitos do inibidor de PI3K /mTOR, BEZ235, e o inibidor de MEK, AZD6244. Observou-se que a fosfo-Akt estava activado por inibição fosfo-Erk com AZD6244 em ambas as células e HCC4006 HCC4006ER. Esta activação fosfo-Akt induzida por AZD6244 não foi completamente inibida por BEZ235 em células HCC4006 e HCC4006ER (Fig 2D). A combinação de BEZ235 e AZD6244 não restaurou a inibição da proliferação celular ou a clivagem de PARP em células HCC4006ER induzida por erlotinib em HCC4006 células, embora índice de combinação (IC) de esta combinação indica efeito sinérgico (CI 1) (fig 2C e 2D ). Estes resultados demonstram que a inibição dupla de Akt e Erk não superar a resistência erlotinib em células HCC4006ER, embora fosfo-Akt e Erk foram persistentemente activados independente da via EGFR.

HCC4006ER células mostram um fenótipo de EMT com a activação do TGF-β /SMAD via

Para determinar se a resistência em células HCC4006ER foi associado com um processo de TEM, nós testamos a migração de células usando ensaios de zero. Em células HCC4006ER, a diferença foi completamente fechada no prazo de 12 horas, enquanto que foram necessárias mais de 12 horas nas células parentais HCC4006 (Fig 3A). Descobrimos também que a proliferação de células HCC4006ER foi significativamente mais lento do que as células parentais (Fig 3B), de acordo com estudos recentes que sugerem um crescimento mais lento de células resistentes aos medicamentos [47]. Vários relatórios têm indicado que EMT está associada com primário e a resistência adquirida a EGFR-TKI em NSCLC [4-11]. O aumento da migração, resistência erlotinib, e a proliferação reduzida de células HCC4006ER foram consistentes com um processo de TEM. Continuar a analisar esta possibilidade, nós olhamos para as moléculas relacionadas com a EMT em células HCC4006 e HCC4006ER. É importante ressaltar que encontramos perda de E-caderina e regulação positiva de N-caderina, vimentina, e fibronectina em células HCC4006ER, que não foram afetados pelo tratamento erlotinib (Fig 3C). Além disso, verificou-se que todos os clones de células resistentes individuais (HCC4006ER-S1 para -S5) haviam sido submetidos a EMT, bem como a perda de proteína HER3, semelhante aos resultados observados nas células originais (HCC4006ER S2B FIG). estudo anterior indicou que a manutenção de gefitinib impedido o processo EMT e inibiu a migração celular em células NSCLC resistentes a gefitinib com

TEM

-amplification (mas sem EMT fenótipo) [48]. No entanto, os níveis de marcadores de EMT (E-caderina, N-caderina, vimentina e fibronectina) expressão não foram afetados pela continua exposição do erlotinib por 72 horas em células HCC4006ER (S3A FIG). Além disso, a capacidade de migração em células HCC4006ER foram ainda superior ao do mesmo HCC4006 células incubadas com erlotinib (Fig S3B). Estes resultados sugerem que EMT fenótipo em células HCC4006ER mantiveram-se estáveis, independentemente da presença de erlotinib.

A, monocamadas de HCC4006 e células HCC4006ER foram raspadas em uma linha reta com uma ponta de pipeta de 1000 mL. fotos monocamada com arranhões foram tomadas após 12 horas de incubação. B, células HCC4006 HCC4006ER e foram colocadas em placas a 1×10

3 células /cavidade em placas de parede negra de 96 poços, incubadas em meio RPMI com 10% de FBS e deixadas a crescer durante dias indicados. Os dados gerados pelo ensaio de viabilidade celular (CellTiter-Glo) são expressos como uma percentagem do valor para as células não tratadas. As determinações foram realizadas em triplicado. Bares, SEM. * P 0,0001 para HCC4006 contra HCC4006ER (Student

t

teste). células C, HCC4006 HCC4006ER e foram incubadas durante 6 horas ± erlotinib (1 uM). Os lisados ​​celulares foram sujeitos a análise de expressão de proteína com anticorpos para E-caderina, N-caderina, vimentina, fibronectina, e β-actina. D, HCC4006 HCC4006ER e as células foram incubadas durante 6 horas ± TGF-β1 (10 ng /ml) ou erlotinib (1 uM), como indicado. Os lisados ​​celulares foram sujeitos a análise de expressão de proteína com anticorpos para pSMAD2 e a p-actina. E, HCC4006 ou HCC4006ER células foram incubadas durante a noite. O meio foi substituído com meio RPMI isento de soro com ou sem erlotinib (1 uM) e incubou-se durante mais 24 horas. Os sobrenadantes foram recolhidos e submetidos a TGF-β1 ELISA. As determinações foram realizadas em triplicado. Bares, SEM. *

P Art 0,0001 contra HCC4006 células com ou sem tratamento erlotinib (Student

t

teste). F, a transcrição induzida por TGF-β é aumentada por co-tratamento com TGF-β e erlotonib em transfecções transientes e com construções de luciferase-TGF-p responsivo. células HCC4006 e HCC4006ER foram transientemente transfectadas com o repórter p3TP-Lux ou pSBE4 e tratou-se com DMSO, 5 ng /mL de TGF-β1, 1 uM de erlotinib, ou uma combinação de 5 ng /mL de TGF-β1 e um erlotinib uM durante 48 horas. Após 48 horas, a actividade da luciferase foi determinada como descrito em Materiais e Métodos.

De acordo com estudos anteriores que mostraram que a via de TGF-β é crítica para relacionadas com a resistência adquirida EMT EGFR-TKI em NSCLC [8 , 9], encontramos níveis basais mais elevados de Smad2 fosforilação em células HCC4006ER. Como esperado, Smad2 fosforilação aumentada após o tratamento com TGF-β, e este aumento foi independente de erlotinib (Fig 3D). Além disso, em comparação com HCC4006 células, a quantidade de TGF-β1 no meio foi regulada positivamente em células independentes de HCC4006ER (erlotinib) (Fig 3E), sugerindo que a via de TGF-β foi activada secundária ao aumento da expressão do ligando. A activação da via de TGF-β em células HCC4006ER foi confirmada através de transfecção dos plasmídeos-TGF-p responsivo repórter de luciferase, pSBE4 e p3TPlux, em ambas as células HCC4006 e HCC4006ER tratados com 5 ng /mL de TGF-β e /ou 1 uM erlotinib .