Abstract

Apesar de mutações somáticas recorrentes no fator de splicing

U2AF1

(também conhecido como

U2AF35

) foram identificados em vários tipos de câncer, os efeitos dessas mutações sobre o transcriptoma do câncer ainda não foram completamente elucidados. Aqui, identificamos alterações splicing associados com

U2AF1

mutações em todo cancros distintos usando DNA e RNA de dados de sequenciação de The Cancer Genome Atlas (TCGA). Usando dados de RNA-Seq entre 182 e 167 adenocarcinomas do pulmão leucemias mielóide aguda (AML), em que

U2AF1

está somaticamente mutado em 3-4% dos casos, foram identificadas alterações 131 e 369 de splicing, respectivamente, que eram significativamente associada com

U2AF1

mutação. Destes, 30 alterações de splicing foram estatisticamente significativos em ambos os adenocarcinoma de pulmão e AML, incluindo três genes no gene Census câncer,

CTNNB1,

CHCHD7

, e

PICALM

. experimentos linha de células que expressam

U2AF1

S34F em células HeLa e 293T células fornecer um apoio adicional que estes eventos de splicing alterados são causados ​​por

U2AF1

mutação. Consistente com a função de U2AF1 em 3 ‘reconhecimento de local de splicing, descobrimos que mutações S34F /Y causar preferências para CAG sobre UAG 3’ sequências de locais de emenda. Este relatório demonstra efeitos consistentes de

U2AF1

mutação no splicing em tipos de células cancerígenas distintas

Citation:. Brooks AN, Choi PS, de Waal L, Sharifnia T, Imielinski M, Saksena G, et ai. (2014) A Pan-Cancer Análise do transcriptoma mudanças associadas com Somatic Mutações no

U2AF1

revela Comumente Altered emenda Eventos. PLoS ONE 9 (1): e87361. doi: 10.1371 /journal.pone.0087361

Autor: Gil Ast, Universidade de Tel Aviv, Israel

Recebido: 28 de junho de 2013; Aceito: 20 de dezembro de 2013; Publicação: 31 de janeiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Brooks et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por um dos Institutos Nacionais de Saúde Grant 5U24CA143867-03. ANB é uma Merck Fellow da Fundação Damon Runyon Cancer Research (DRG-2138-12). JC é apoiado por um American Cancer Society AstraZeneca pós-doutorado. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

recentes estudos de sequenciamento de todo o exome identificaram mutações somáticas recorrentes em fatores de splicing em síndromes mielodisplásicas [1], leucemia linfocítica crónica [2], leucemia mielóide aguda [3], o cancro da mama [4], adenocarcinoma de pulmão [ ,,,0],5], e o melanoma uveal [6]. Muitos destes factores de splicing estão mutados ponto de ramificação ou factores de reconhecimento do sítio 3 ‘de splicing (por exemplo,

SF3B1

e

U2AF1

) e estão envolvidos na regulação da remoção intrão de pré-ARNm. A 3 ‘complexo de reconhecimento de local de splicing é composto por U2AF1 e U2AF2 (também conhecido como U2AF65), onde U2AF1 é importante para o reconhecimento do AG em 3’ locais de splice [7] e U2AF2 reconhece o tracto polipirimidina a montante do AG [8 ].

U2AF1

foi relatado para ter mutações hotspot significativas na posição do aminoácido 34 em síndromes mielodisplásicas [1], adenocarcinomas pulmonares [5], e AML [3].

U2AF1

mutações co-ocorrer com mutações em oncogenes driver conhecido em adenocarcinoma de pulmão [5] e ainda não está claro se essas mutações são oncogenicamente transformando. Para elucidar ainda mais os efeitos centrais do

U2AF1

mutações na biologia do câncer, que teve como objetivo identificar alterações transcriptoma comuns associados com o

U2AF1

mutações em tipos de câncer distintas.

Resultados

mutações somáticas no

U2AF1

em 12 tipos de câncer

Para verificar as mudanças transcriptoma associados com

U2AF1

mutações em diferentes tipos de câncer, foi utilizado o Cancer Genome Atlas ( TCGA) fornecer dados que ambas as mutações somáticas ao nível do ADN e de alto rendimento de sequenciação de ARNm (ARN-SEQ) nos mesmos espécimes individuais através de vários tipos de cancro. Usando os dados disponíveis a partir de 12 tipos de câncer TCGA [9], identificamos câncer de abrigar mutações somáticas no

U2AF1

. Do outro lado 2.979 espécimes de câncer com sequenciação de todo o exome e RNA-Seq, 26 tinham mutações missense em

U2AF1

-17 na posição de aminoácido 34 (Tabela S1 no Documento S1, Figura 1).

U2AF1

mutações S34F foram encontrados em oito adenocarcinomas pulmonares (4%), quatro amostras de LMA (2%), dois carcinomas do endométrio (1%), e uma amostra de cancro da bexiga (1%). Havia também dois

U2AF1

amostras S34Y AML (1%).

U2AF1

foi relatado para ser significativamente mutado em ambos os adenocarcinomas pulmonares [5] e AML [3]; No entanto, não significativamente mutado em carcinomas do endométrio [10], provavelmente devido à baixa frequência dentro deste tipo de cancro. Além de mutações S34F /Y, outras oito mutações somáticas foram observados em

U2AF1

. Para identificar alterações transcriptoma associados com

U2AF1

mutação, nós nos concentramos em adenocarcinoma de pulmão e AML como esses tipos de câncer têm uma maior frequência de mutações e, portanto, teria mais poder para detectar alterações estatisticamente significativas associadas com a mutação e controle para as diferenças entre o tecido de origem. As mutações S34F e S34Y resultar em aminoácidos aromáticos; Por isso, consideramos mutações S34F e S34Y ser funcionalmente semelhantes.

(A) Representação de mutações somáticas no

U2AF1

observada em 12 tipos de câncer TCGA [9]. Cinco tipos de câncer não tinha mutações somáticas no

U2AF1

. As posições dos aminoácidos estão indicados. Zn, de dedo de zinco; UHM, U2AF motivo homologia. (B) Análise JuncBASE dos dados de RNA-Seq identificados 131 e 369 eventos de splicing significativamente diferencialmente emendado no adenocarcinoma de pulmão e AML exemplares portando

U2AF1

mutações S34F /Y, respectivamente.

transcriptoma alterações associadas com o

U2AF1

mutações S34F /Y no adenocarcinoma de pulmão e leucemia mielóide aguda

Nós usamos JuncBASE [11] para identificar eventos de splicing alternativo que foram significativamente diferencialmente emendados entre

U2AF1

amostras de câncer de tipo selvagem e

U2AF1

amostras S34F /Y. identifica JuncBASE e classifica formas de splicing alternativo (por exemplo, exão cassete, 5 ‘locais de splicing alternativos 3’ alternativos locais de splicing), quantifica a abundância de inclusão ou exclusão de cada exão alternativa, então calcula uma “percentagem emendados in” (PSI ) O valor para cada evento splicing em cada amostra câncer. Um teste de soma de postos de Wilcoxon foi realizada em valores PSI entre os cancros com ou sem

U2AF1

mutações S34F /Y para identificar eventos de splicing que foram significativamente diferentes entre os dois grupos. Para controlar para o tecido de origem, foram comparados

U2AF1

de tipo selvagem e as amostras S34F /Y dentro do mesmo tipo de cancro. O

U2AF1

adenocarcinomas pulmonares S34F foram encontrados entre os três subtipos de expressão (TCGA,

apresentada

) e

U2AF1

espécimes S34F /Y LMA ocorreu através de cinco Francês-America- Britânica subtipos (FAB) LMA [3]; portanto, nós não controlar ainda mais para o subtipo. Mutações somáticas em

U2AF1

foram encontrados para ser mutuamente exclusivo com outros factores de splicing [1], [3], [5], sugerindo que as mutações pathway spliceosome pode ter o mesmo efeito funcional na oncogénese. Para remover potenciais fatores de confusão de mutações em outros factores de splicing, nós olhamos para eventos diferencialmente emendados entre amostras com

U2AF1

S34F mutação e amostras que abrigam nenhuma mutação em qualquer gene fator de splicing que tem sido relatado anteriormente /Y a ser significativamente alterada no câncer (Tabelas S1-S2 no Documento S1).

Usando JuncBASE, identificamos 131 e 369 eventos de splicing alternativo que foram significativamente diferencialmente emendados na presença de um

U2AF1

mutação S34F /Y no adenocarcinoma de pulmão e AML (False Descoberta Rate (FDR) 5%), respectivamente. Além disso, esses eventos de splicing têm um diferença de 10% no PSI mediana de cancros sem mutação do gene fator de splicing e os cancros com

U2AF1

mutações S34F /Y (Arquivo S1-S3). Comparando

U2AF1

mutação S34F /Y com

U2AF1

amostras do tipo selvagem (alguns com mutações em outros factores de splicing) produziram resultados semelhantes em adenocarcinoma de pulmão (TCGA,

apresentada

) e AML (S4 Arquivo). JuncBASE quantificação de

U2AF1

S34F /Y-associado eventos de splicing na AML foram consistentes com uma análise de

mutações U2AF1

em 20 amostras de LMA [12] (r

2 = 0,84, Figura S1 no Documento S1).

Como tanto um controlo positivo e negativo para esta análise, foram comparadas 10 amostras de adenocarcinoma de pulmão com um

MET

exão 14 mutação de recomposição ou exclusão com todos os outros adenocarcinoma de pulmão amostras de olhar para o splicing diferencial significativa entre os dois grupos.

MET

exão 14 alterações ocorrem com uma frequência semelhante à

U2AF1

mutações no adenocarcinoma pulmonar (TCGA,

apresentada

). Esta análise serve como um controlo positivo, porque o acontecimento de processamento diferencial mais fortemente associado deve ser

TEM

exão 14. Esta análise também serve como um controlo negativo como não se espera que as alterações de causar alterações globais no splicing desde as mutações ocorrem em

cis

actuando alterações do site emenda. De fato, a análise JuncBASE identificado apenas o splicing de

MET

exão 14 como significativamente diferencialmente emendados com uma diferença em PSI . 10%

Como um controle adicional, identificamos eventos de splicing alternativo significativamente associados com

STAG2

mutações no adenocarcinoma de pulmão e AML, como

STAG2

não é esperado para ser um regulador de splicing e é transformado em uma freqüência semelhante em ambos os tipos de câncer. Somente um evento de splicing foi significativamente associada com

STAG2

mutação no adenocarcinoma de pulmão e nenhum na AML.

À semelhança do que foi observado em uma caracterização completa de adenocarcinoma de pulmão (TCGA,

apresentada

), os eventos de splicing associados com

U2AF1

mutações S34F em AML também mostram enriquecimento de exons cassete e locais alternativos 3 ‘splicing (Figura 1B). Não observar os efeitos gerais no intrão retenção, que se pensa ocorrer na presença de uma mutação spliceosome. Se

U2AF1

mutações causam muitos íntrons a ser unspliced, talvez não seja de uma forma consistente e essas instâncias são removidos pela decomposição mediado por mutações nonsense (NMD). Para ver se o exão cassete e 3 ‘viés local de splicing é uma característica geral do splicing alternativo nestes tipos de câncer ou específico para splicing alterada pela

U2AF1

mutação, identificamos as proporções de cada tipo de evento splicing alternativo os 10% mais eventos de splicing mais altamente variáveis ​​em adenocarcinomas do pulmão sem mutações fator de splicing (Figura S2 no Documento S1).

U2AF1

cancros S34F /Y preferencialmente apresentam alterações no exon cassete e 3 locais de splicing ‘em comparação com o conjunto de eventos de splicing altamente variáveis ​​(teste qui-quadrado, P = 6.6e-26).

Embora existam alterações de splicing que estão associados com

U2AF1

mutação S34F /Y nesses espécimes de cancro, não é claro se as mudanças de splicing são causados ​​pela mutação ou se houver alterações genómicas desconhecidos que são também correlacionados com as mudanças de splicing. Para melhor avaliar a relação entre as mudanças de splicing e

U2AF1

S34F mutações, analisamos publicado anteriormente dados de RNA-Seq comparando expressão ectópica de

U2AF1

S34F ou

U2AF1

wild- tipo de expressão em células HeLa [1]. análise JuncBASE comparando controles sem indução com

U2AF1

do tipo selvagem ou

U2AF1

indução S34F identificados 1.221 e 5.399 mudanças de emenda significativos, respectivamente (S5 Arquivo e S6). Nós encontramos uma sobreposição significativa de 165 mudanças de emenda após indução de

U2AF1

S34F em células HeLa e mudanças splicing em cancros humanos com

U2AF1

mutações S34F /Y (Figura 2, o teste exato de Fisher, P 2.2e-16). Em contraste, encontramos uma proporção menor de mudanças de emenda sobre

U2AF1

indução de tipo selvagem para ser semelhante a alterações em cancros humanos (15/1221, exato de Fisher, P = 0,72). No total, 35% do

U2AF1

alterações splicing S34F /Y-associados visto no adenocarcinoma de pulmão ou LMA são suportados por alterações causadas por splicing

U2AF1

S34F expressão em células HeLa. Não seria de esperar que todas as alterações de splicing para ser observada nas experiências com células HeLa como alterações de splicing são conhecidos como sendo dependente do contexto (revisto em [13]) e

U2AF1

indução faz com que a sobre-expressão do gene de [1], que pode afetar a formação do complexo spliceosome.

Uma comparação das mudanças no splicing associados com

U2AF1

mutação somática em cancros humanos e

U2AF1

indução S34F em células HeLa.

U2AF1

S34F /Y preferencialmente a emendas em vez de CAG UAG ‘sequências de locais de splice

U2AF1 é a pequena subunidade do heterodímero U2AF que reconhece o consenso AG da 3′ 3 locais de splicing. Um estudo anterior que identificou splicing diferencial de 35 exons associados com

U2AF1

mutação identificada uma assinatura sequência em 3 sites de emenda dos exons alternativos [12]. Dadas as mudanças significativas em exons cassete e 3 alternativas ‘eventos do site emenda associados com

U2AF1

mutação S34F /Y, nós examinamos as sequências de 3′ locais de splicing que foram preferencialmente utilizadas no

U2AF1

S34F /Y cancros mutado. Para simplificar, nós só examinou mudanças splicing entre dois locais de splicing alternativo 3 ‘.

Como splicing factor de ligação pode variar de acordo com a ativação de emenda ou de repressão (revisto em [14]), nós olhamos sequências de locais de splicing do exão de inclusão e exclusão eventos, separadamente. A partir do conjunto de

U2AF1

S34F /Y-associado exons cassete e alternativas “alterações 3 sites de emenda na AML, encontramos um viés significativo para pular de um exão (69% dos exons cassete) ou uso de uma forma mais ‘local de splicing (75% das alternativas 3’ distal 3 locais de splicing) (teste binomial, P 1e-4, Figura 3A). Encontramos uma tendência semelhante para salto de exon e uso local de splicing distal do

U2AF1

S34F associada eventos de splicing em adenocarcinoma de pulmão (Figura S3 no Documento S1). Como comparação, identificamos eventos alternativos de splicing significativamente associados com

RBM10

mutação no adenocarcinoma pulmonar (S7 Arquivo). A proteína de ligação RNA

RBM10

foi encontrado para ser significativamente mutado em adenocarcinomas pulmonares com recorrentes mutações frameshift, absurdo, ou do site emenda [5]. O salto de exon observado é específico para

U2AF1

eventos de splicing S34F-associado como o viés oposto é observado em

RBM10

perda de função (LOF) eventos de splicing -associated (Figura S4A-B no Documento S1).

(a) Proporção de eventos local alternativo 3 ‘splicing exão e cassete alterado que mostram salto de exon contra a inclusão do exão. motivos (B) sequência de consenso identificados na proximal (3’ss prox) e locais 3 ‘splicing distais (3’ss dist) de eventos de exão pular. (C) sequência de consenso motifs nas extremidades proximal e distal locais 3 ‘de splicing exão de eventos de inclusão. mudanças de emenda de “escolhas local de splicing expressas e anotados 3 onde a escolha local de splicing é TAG vs. CAG ou TAG vs. AAG em (D) células HeLa + induzidas

U2AF1

células (E) HeLa S34F ou + induzida

U2AF1

de tipo selvagem.

de acordo com os achados anteriores [12], encontramos uma sequência TAG trinucleotide consenso na proximais locais 3 ‘splicing de exons cassete ignorados. Além disso, nós também encontrar este motivo em locais de splicing proximais dos eventos 3 ‘do sítio de splicing alternativos em

U2AF1

amostras S34F /Y AML (Figura 3B). Além disso, um local de união de consenso CAG no local 3 ‘de união mais distai é observado, que não foi previamente relatada (Figura 3B). Uma preferência semelhante de locais de splicing CAG (com uma sequência AAG menor) sobre locais de splicing TAG é observada em exons preferencialmente incluídos no

U2AF1

amostras S34F /Y AML (Figura 3C). Estes sites emenda motivos de sequências preferenciais diferem dos motivos do site emenda observados perto proximal e distal 3 dos locais de splicing de eventos controle alternativo de splicing (Figura S4C no Documento S1, Wilcoxon teste rank-sum, FDR 95%).

Surpreendentemente, vemos as mesmas preferências de seqüência no exão cassete e “mudanças no site alternativos 3 de emenda em

U2AF1

adenocarcinomas S34F pulmão (Figura S3 no Documento S1) e em células HeLa transduzidas com

U2AF1

S34F construções mutantes (Figura S5A-B no Documento S1). Além disso, não vemos esse consenso 3 ‘emenda sequência do local em splicing

RBM10

LOF-associado de adenocarcinoma de pulmão (Figura S4A-B no documento S1), nem em mudanças splicing em células HeLa transduzidas com o tipo selvagem

U2AF1

(Figura S5C-D no documento S1), apoiando que a preferência sequência é específico para

U2AF1

mutações S34F /Y.

Estes motivos de sequências de consenso foram gerados a partir de splicing eventos que foram fortemente associados com

U2AF1

mutação e não resolvem as preferências de sequência entre duas escolhas do site emenda de um evento splicing indivíduo. Para investigar mais as preferências do site CAG emenda mais locais de splicing UAG, examinamos sequência local de splicing alterna entre todos os pares de expresso e anotado CAG contra TAG locais 3 ‘da emenda. Usando um limiar para identificar interruptores splicing, descobrimos que 57% dos CAG contra TAG locais de splicing 3 ‘foram alterados em células HeLa expressando o

U2AF1

mutação S34F, enquanto 36% foram alterados quando expressando um

U2AF1

construção de tipo selvagem (Figura 3D). De

U2AF1

interruptores do site emenda S34F-associados, 83% (884 /1.065) foram um TAG para um site de CAG emenda, enquanto apenas 53% (347/660) mudou de um TAG para um CAG ao expressar U2AF1 do tipo selvagem (teste exato de Fisher, P 2.2e-16). Observou-se uma tendência semelhante de comutadores de TAG para locais de splicing AAG 3 ‘(teste exato de Fisher, P = 2.518e-5, a Figura 3D).

A nossa análise mostra que o

U2AF1

S34F /mutação Y provoca alterações no ‘o uso do site emenda onde um [C /a] AG 3’ 3 local de splicing é preferível a um site UAG emenda. Nós não observamos splicing alterado de locais de splicing todos UAG 3 ‘; No entanto, é difícil distinguir entre splicing ou degradação do transcrito aberrante por decaimento mediado por mutações nonsense inalterado, aparecendo assim, manter-se inalterado.

transcriptoma alterações nos genes do ciclo celular e outros genes do cancro está associado com

U2AF1

mutação

mutação somática em

U2AF1

pode causar alterações de splicing de genes-chave de câncer, resultando em função de gene alterado ou vias alteradas. Para identificar potenciais consequências biológicas a jusante de

U2AF1

mutação, foi realizada uma Gene Set Análise de Enriquecimento (GSEA) [15], [16] para identificar conjuntos de genes positivamente correlacionada com a

U2AF1

S34F /Y mutação no adenocarcinoma de pulmão e em AML. Sem conjuntos de genes atingiu significância estatística dada um corte FDR de 25%. Foi relatado anteriormente que a transdução de

U2AF1

S34F mutações em células HeLa causada regulação positiva de componentes da via de decaimento mediado por mutações nonsense (NMD) [1]. Nós não observamos uma regulação positiva significativa na expressão de fatores de NMD associados com

U2AF1

mutação no adenocarcinoma do pulmão ou AML.

Apesar de não conjuntos de genes passou FDR significado, o gene ontologia top-Two-Go enriquecido conjuntos em AML com as maiores pontuações de enriquecimento normalizados eram “ciclo celular mitotitc” e “fase M do ciclo celular mitótico” (Figura S6 no Documento S1, P nominal 0,05). Um subconjunto desses genes do ciclo celular foram upregulated em amostras de LMA com

U2AF1

mutação S34F /Y. Consistente com o efeito de

U2AF1

mutação no ciclo celular, esgotamento RNAi de

U2AF1

[17] e

U2AF1

expressão S34F em células HeLa [1] resulta em um aumento da fracção de células na fase G2 /M. Nós não vemos qualquer associação com conjuntos de genes do ciclo celular em

adenocarcinomas U2AF1

S34F pulmonares. Isso pode ser explicado pelo alto grau de contaminação tecido normal neste tipo de câncer [18], que pode afetar as assinaturas de expressão gênica.

De acordo com estas observações, há 31 genes com

U2AF1

S34F /Y-associado eventos de splicing representados no “ciclo mitótico celular” e “fase M do ciclo celular de mitose” conjuntos de genes, incluindo

CHEK2

,

CDC27

, e várias subunidades do anaphase- promover complexo (Tabela S3 no Documento S1).

alterações emenda associados com

U2AF1

mutação S34F /Y em ambos os adenocarcinoma de pulmão e AML são de particular interesse uma vez que estes genes comumente alterados podem fazer contribuições fundamentais a seletiva vantagem nestes cancros. Encontramos uma sobreposição significativa de 30 eventos de splicing alterados que foram associados com

U2AF1

mutações S34F /Y em ambos adenocarcinoma de pulmão e AML (Figura 2 e Tabela 1, de Fisher teste exato de p 2.2e-16). Para todos os 30 eventos de splicing, a direcção de splicing foi a mesma em ambos os tipos de cancro, em que

U2AF1

mutação causou uma mudança para o salto de exon ou inclusão exão para o mesmo acontecimento de processamento. A maioria (63%) dos eventos comumente alterados mostraram um uso mais distal local 3 ‘tala no

U2AF1

amostras mutantes. Além disso, 17/30 eventos de splicing foram significativamente afectadas por indução de

U2AF1

S34F em células HeLa, mas não apresentou alterações na indução de

U2AF1

de tipo selvagem (Tabela 1). 60% destes eventos de splicing comumente alterados mostrar 3 ‘local de splicing preferência sequência de uma CAG, ou AAG, local de união ao longo de um site de TAG emenda (Tabela 1, a ou b), consistente com o observado preferência sequência local de splicing geral do

eventos U2AF1

S34F /Y-associado. Além disso, procuramos genes com eventos de splicing alterados que também estavam no Gene Census Cancer [19] (Tabela S4 no Documento S1). Três genes Cancer Gene Censo estavam entre os 30 eventos de splicing comumente alteradas e são de particular interesse:

CTNNB1

(TCGA,

submetido),

CHCHD7

, e

PICALM

(Tabelas 1 e S4 no Documento S1).

O evento splicing alterado no

CTNNB1

em

U2AF1

cancros mutantes resulta em uma mudança para o splicing de um local de junção mais proximal na UTR 3 ‘de

CTNNB1

(Figura 4A-B). Também foi observado regulação positiva significativa de uso do site emenda proximal em células HeLa expressando

U2AF1

S34F (Figura 4C). A isoforma regulada positivamente tem sido mostrado para ser um ARNm menos estável em células HeLa [20]; por conseguinte, o acontecimento de processamento alterado pode resultar numa redução dos níveis de proteína CTNNB1. Embora,

CTNNB1

activação é uma mutação condutor canónico, uma diminuição nos níveis normais de CTNNB1 pode também ser vantajoso para as células de cancro como a depleção de ARNi

CTNNB1

tem sido demonstrado que o aumento da migração de células [21 ].

“Percent emendados em” (PSI) valores do proximal ‘local de splicing do

CTNNB1 Sims 3′ 3 evento UTR emenda no (a) adenocarcinoma de pulmão e (B) AML. (C) RNA-Seq ler a cobertura do evento 3 ‘UTR em células HeLa com dois

U2AF1

controles não-induzida, indução de

U2AF1

do tipo selvagem, e indução de

U2AF1

S34F.

Para outro teste experimentalmente se os eventos de splicing observado em

U2AF1

cancros mutantes são causados ​​diretamente pelo

U2AF1

mutação, nós transfectadas 293T células com ambos os

U2AF1

de tipo selvagem ou

U2AF1

construções S34F e ensaiadas mudanças em cinco eventos de splicing usando RT-PCR quantitativo (Figura 5, Figura S7 no Documento S1). Fomos capazes de validar mudanças no splicing em

CTNNB1

,

CHCHD7

, e

PTBP1

em células transfectadas com

U2AF1

construções S34F e não em células transfectada com

U2AF1

de tipo selvagem (Figura 5, teste t não emparelhado, P 0,1). eventos de splicing em

KARS

e

CHEK2

não validar e pode ser dependente do contexto, falso-positivos na análise de transcriptoma, falsos negativos na experiência de transfecção, ou alvos atrasadas indiretos de

U2AF1

actividade.

uma diferença de dobragem entre a expressão do gene total e a isoforma inclusão de cada acontecimento de processamento foi normalizada pela diferença vezes de uma amostra de controlo não-transfecção, para se obter um nível de inclusão relativa para cada amostra. As coordenadas genômicos de eventos de splicing testados em (A)

CTNNB1

, (B)

CHCHD7

, e (C)

PTBP1

são apresentados na Tabela 1.

Discussão

a nossa análise das mudanças de emenda e de expressão de genes associados com

U2AF1

mutação em vários tipos de câncer, revelou alterações na 3 ‘local de splicing de reconhecimento da sequência e destaca consequências biológicas potenciais através de genes do cancro alterados, tais como

CTNNB1,

PICALM

, e

CHCHD7

. Além disso, temos validado que pelo menos algumas dessas alterações splicing são consequências directas da

U2AF1

mutação em experiências de transfecção.

Muitos fatores estão envolvidos no reconhecimento correto local de splicing em complexo com U2AF1, incluindo U2AF2. Tem sido bem conhecido que local de união de consenso motivo a 3 ‘inclui um C ou L nucleótidos antes do AG na extremidade de intrões e mutações em

U2AF1

dar a primeira indicação de que um factor tem uma preferência específico para este posição -3 [12]. U2AF1 tem sido demonstrado que se ligam fracamente a ARN é através UHM domínio [22]. Talvez a mutação S34F no domínio de dedo de zinco a montante afecta local de splicing de reconhecimento da sequência 3 ‘através da interacção directa com o pré-mRNA ou através de interacções proteína-proteína com U2AF2, hnRNP A1 [23], ou DEK [24]. Além disso caracterização bioquímica da proteína U2AF1 S34F em complexo com outras proteínas pode levar a uma compreensão mais geral do «reconhecimento 3 sequência do local de união.

Em resumo, encontramos vários genes, incluindo vários genes de câncer conhecidos com splicing alterada em a presença do

U2AF1

mutação tanto no câncer humano e no

U2AF1

mutantes células transfectadas. O impacto destas alterações splicing em função do gene é um tópico importante para futuras investigações. Nossa identificação de alterações de emenda significativamente e consistentemente associada a mutações somáticas no

U2AF1

fator de splicing destaca a necessidade de estudos futuros para a função de formas de splicing alternativo de genes, a fim de compreender totalmente as alterações genômicas associadas ao câncer.

Métodos

mutações somáticas

chamadas mutação somática dos 12 tipos de câncer TCGA Pan-CANCER foram utilizadas (doi: 10,7303 /syn1710680.4), com excepção do pulmão adenocarcinoma. chamadas de mutações somáticas Adenocarcinoma pulmonar foram retirados do grupo TCGA análise de adenocarcinoma de pulmão de trabalho (TCGA,

submetido)

processamento de RNA-Seq

arquivos de alinhamento de RNA-Seq para 230. adenocarcinomas do pulmão e 173 leucemias mielóide aguda (LMA) estavam disponíveis através CGHub (https://cghub.ucsc.edu). alinhamentos AML baixados da CGHub usou uma versão mais antiga do genoma humano de referência (hg18); Assim, os ficheiros LMA BAM foram convertidos para FASTQ usando SamToFastq [25] e, em seguida, realinhados contra hg19 usando TopHat [26] com os seguintes parâmetros: “-G [transcritos Gencode V7 [27]] -mate-interno 300 dist–mate -std-dEV 500 “. Uma amostra AML falhou RNA-Seq re-alinhamento e de processamento e foi excluído: TCGA-AB-2977. alinhamentos de RNA-Seq de amostras de adenocarcinoma de pulmão usado MapSplice [28].

arquivos de RNA-Seq FASTQ de experimentos com células HeLa foram baixadas a partir do repositório DDBJ com os números de adesão DRR001796-DRR001799. Lê foram alinhadas usando TopHat [26] usando Gencode v7 [27] como um guia transcrição.

emenda análise

amostras de adenocarcinoma pulmonar, amostras de LMA, e amostras dos experimentos de linhas de células HeLa (HeLa +

U2AF1

não-induzido, HeLa +

U2AF1

S34F não-induzido, HeLa +

U2AF1

do tipo selvagem induzida, HeLa +

U2AF1

S34F induzida pelo tipo selvagem ) foram executados através JuncBASE v0.6 [11] como três conjuntos de análise separados. Para adenocarcinoma de pulmão e as amostras de LMA, os parâmetros JuncBASE usados ​​para identificar eventos de splicing alternativo e calcular “por cento emendados in” (PSI) valores foram os seguintes:

-c 2 -j [íntrons do Gencode v7

[27]

] -jcn_seq_len 88

. Para os experimentos com células HeLa, os parâmetros JuncBASE utilizados foram os seguintes:

-c 2,5 -j [íntrons do Gencode v7

[27]

] -jcn_seq_len 202

. Para adenocarcinoma de pulmão, Abotoaduras [29]

de novo

anotações de transcritos estavam disponíveis para incorporar potencialmente novos exons na análise splicing (TCGA,

apresentada

). UCSC knownGenes hg19 anotação transcrição foi utilizado para definir exons anotados [30].

Para identificar

U2AF1

S34F /Y-associados eventos de splicing diferencial em adenocarcinoma de pulmão e AML,

compareSampleSets.py

do pacote JuncBASE v0.6 foi usada com os seguintes parâmetros:

10 -thresh -mt_correction BH -which_test Wilcoxon -delta_thresh 5,0

. eventos de splicing com uma diferença significativa (FDR 5%) em valores PSI entre as amostras sem a mutação do fator animar e amostras com

U2AF1

S34F /Y mutação foram posteriormente filtrada para eventos com uma diferença no PSI média superior a 10%. Para identificar eventos de splicing afetadas pela expressão de

U2AF1

S34F em células HeLa,

pairwise_fishers_test_getASEvents_w_reference.py

foi utilizado para comparar inclusão e exclusão isoforma ler as contagens entre o HeLa +

U2AF1

selvagem -tipo biblioteca não-induzida sequenciado e HeLa +

U2AF1

induzida S34F biblioteca sequenciado com os seguintes parâmetros:

-thresh 25 -min_dpsi_threshold 5.0 -method BH -sign_cutoff 0,05

. Para identificar eventos de splicing específicos para

U2AF1

indução S34F, o evento não poderia também ser significativamente diferente entre os dois controles ou quando se compara o

U2AF1

tipo selvagem não-induzido a

U2AF1

do tipo selvagem induzido. Esta última restrição foi imposta para distinguir mudanças splicing devido à mutação S34F em vez de sobre-expressão de

U2AF1

. Em alguns casos, tais como o ‘UTR de eventos de splicing 3 de

CTNNB1

,

U2AF1

indução de tipo selvagem provocou uma mudança no splicing mas na direcção oposta como o

U2AF1

indução S34F. Para ser conservador, consideramos um

U2AF1

evento splicing S34F-afetada que tenha qualquer mudança sobre

U2AF1

indução de tipo selvagem para ser não-específico para o

U2AF1

mutação ; no entanto, nós fazer a anotação na Tabela 1 do

CTNNB1

evento que também mostrou uma mudança splicing em

U2AF1

do tipo selvagem de indução, mas na direção oposta.

Em casos