Sumário
Novas terapias para fase tardia e câncer de próstata resistente à castração (CRPC) dependem definir propriedades únicas e vias de células sub-populações capazes de sustentar o crescimento líquido do câncer. Um dos melhores esquemas de enriquecimento para isolar as células-tronco /progenitoras putativo da próstata murino é Lin
-; Sca1
+; CD49f
oi (LSC
oi), o que resulta numa mais de enriquecimento de 10 vezes para o
in vitro
atividade de formação de esfera. Nós temos mostrado previamente que o LSC
subpopulação oi é necessária e suficiente para a iniciação câncer no
Pten
modelo de cancro da próstata -null. Para melhorar ainda mais este esquema de enriquecimento, temos procurado por moléculas da superfície celular upregulated sobre castração de próstata murino e identificou CD166 como um gene candidato. CD166 codifica uma molécula de superfície celular que pode enriquecer ainda mais a atividade de formação de esfera de WT LSC
oi e
Pten
nula LSC
oi. Importante, CD166 poderia enriquecer capacidade de formação de esfera de células da próstata humanas primárias benignas
in vitro
e induzir a formação de estruturas tubulares-como
in vivo
. expressão CD166 é regulada em cancros da próstata humanos, especialmente amostras CRPC. Embora eliminação genética de CD166 de murino em
Pten
modelo de cancro da próstata nulo não interfere com a formação de esfera ou bloqueiam a progressão do cancro da próstata e desenvolvimento CRPC, a presença de CD166 na haste da próstata /progenitores e resistente à castração sub-populações sugerem que é uma molécula de superfície de células com o potencial para entrega direccionada de agentes terapêuticos do cancro de próstata humanas
citação:. J Jiao, Hindoyan a, Wang S, Tran LM, Goldstein aS, Lawson D, et al. (2012) Identificação de CD166 como um marcador de superfície para o enriquecimento da próstata tronco /progenitoras e células cancerosas de iniciação. PLoS ONE 7 (8): e42564. doi: 10.1371 /journal.pone.0042564
editor: Dean G. Tang, da Universidade do Texas M.D. Anderson Cancer Center, Estados Unidos da América
Recebido: 08 de março de 2012; Aceito: 09 de julho de 2012; Publicação: 03 de agosto de 2012
Direitos de autor: © Jiao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte por um prêmio da Fundação do cancro da próstata (para OW, IPG e HW), Jean Perkins Foundation e do Departamento de Defesa (a IPG) e uma concessão do National Institutes of Health (R01 CA107166 e SR1 CA121110 a HW ). PEIN é um investigador do Howard Hughes Medical Institute. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Apesar dos avanços na detecção e tratamento do câncer de próstata precoce, câncer de próstata resistente à castração (CRPC) continua a ser a segunda causa mais comum de mortalidade masculina nos Estados Unidos [1]. provas crescentes sugerem que uma subpopulação de células da próstata pode iniciar o cancro da próstata e podem ser responsáveis pela resistência à castração [2], [3], [4], [5]. Portanto, estas células cancerosas iniciar [6] pode servir alvos celulares como promissoras para câncer de próstata e identificação desta subpopulação tornou-se o passo necessário para a futura terapia eficaz.
As origens do cancro da próstata células que iniciam são controversos [7 ], [8]. próstata normal de rato ou humano contém três tipos diferentes de células secretoras, nomeadamente luminal, basal e células neuroendócrinas. Uma vez que o cancro da próstata humana é caracterizada por perda de células basais e expansão de células luminais, vários modelos animais postular que progenitores específica-luminais são as fontes de iniciação cancro da próstata [9], [10], [11]. No entanto, utilizando a abordagem de regeneração dos tecidos, células basais provaram ser mais eficientes para alvos oncogénicos tanto iniciação da próstata do rato humano e cancro [12], [13]. Curiosamente, o grupo de Xin demonstrado que basal adulto de murídeo da próstata e células luminais são linhagens auto-sustentada que ambos podem servir como alvos para a iniciação oncogénicos cancro da próstata [14].
PTEN desempenha um papel importante no cancro da próstata humana e CRPC desenvolvimento [15] e é inactivado em 20% de primário e 60% de lesões metastáticas [16]. O murino
Pten
modelo de cancro da próstata (
Pb-Cre
+; Pten
L /L
) recapitula a progressão da doença observada em humanos, incluindo CRPC [17], [ ,,,0],18], [19], [20], e compartilha muitas de assinatura mudanças genéticas com doença humana [17]. Importante, o
Pb-Cre
+; Pten
L /L
modelo fornece uma ferramenta única para estudar células tumorais iniciando como a maioria das células luminais e subpopulações de células basais têm
Pten
exclusão [17], [18]. Usando esse modelo, demonstramos que
Pten
exclusão provoca uma expansão do basal e subpopulações amplificadoras transitórias e subsequente iniciação do tumor
in vivo
[18]. Nós mostrou ainda Lin
-Sca-1
+ CD49f
oi (LSC
oi) estaminais da próstata /células progenitoras do
Pten
próstata nula são capazes de iniciar um fenótipo canceroso que imita o câncer primário no
Pten
modelo de próstata nula [19].
Aqui, nós relatamos a identificação de um marcador da superfície celular, CD166 ou ativado celular de leucócitos molécula de adesão (CD166 /ALCAM ) que é altamente regulada positivamente em amostras CRPC humanos e murinos. CD166 pode ser utilizada para enriquecer para estaminais /progenitoras de células formadoras de esfera a partir de ambos WT e
PTEN
nulos próstatas rato mutante. Além disso, CD166 pode separar LSC
estaminais oi mouse /células progenitoras em CD166
subpopulações lo hi e CD166
, com a LSC
oi; CD166
oi subpopulação ter muito mais elevado de formação de esfera atividade. Demonstramos ainda que a CD166 pode ser utilizado como uma máquina de enriquecimento para isolar próstata humana células formadoras de esfera e células de formação de túbulos.
Resultados
CD166 expressão é regulada positivamente em Murino Castrado prostática epitélio e pode ser usados para enriquecer as células-tronco /progenitoras
Rodent próstata contém haste-como células que são enriquecidos na próstata castrados e podem sofrer mais de 15 ciclos de involução-regeneração em resposta a retirada de andrógeno e substituição [21] . Nós fundamentado que a castração pode também levar a regulação positiva ou enriquecimento dessas moléculas da superfície da célula-tronco que pode potencialmente servir como marcador para isolar células estaminais /progenitoras e para a entrega de drogas específicas. Nós, portanto, extraído publicamente bases de dados disponíveis descrevendo os perfis de expressão gênica de próstatas murino no dia 0 e no dia 3 pós-castração [22], [23]. Estamos focados nesses genes que caíram na categoria ontologia gene de “membrana plasmática” e identificados CD166 /ALCAM como uma das duas únicas moléculas da superfície celular enriquecida com castração comuns (Tabela S1). CD166 foi significativamente aumentada (1-cauda teste t 0,015) 3 dias após a castração, em comparação com ratos intactos. Enquanto CXCL12 também é regulada, optamos por não focar esse gene, pois é uma quimiocina e não passível de enriquecimento de células tronco /progenitoras FACS mediada.
CD166 é um tipo I proteína transmembranar da superfamília Ig que medeia interacções célula-célula através heterofílica (CD166-CD6) e /ou homofica (CD166-CD166) mecanismos de [24], [25]. Verificou-se que nos ratos intactos, CD166 é preferencialmente expresso na região do tronco /progenitoras enriquecidas com proximal [21], mas baixa na região do tronco /progenitoras-pobre distal da próstata WT (painéis superiores Figura 1A). Os níveis de proteína CD166 também são up-regulada imediatamente após a castração (Figura 1A painéis inferiores, comparando dia 0 e no dia 3 pós-castração)
(A) superior:. Comparação de p63 (vermelho) e CD166 (verde) coloração de co-SE entre próstata região proximal e a região distai. Resumindo: IHC para a expressão CD166 de intacta vs. próstata do rato castrado. Barra de escala: 50 ^ m. (B) Lin
-; CD166
oi, Lin
-; CD166
lo, LSC
oi; CD166
oi, e LSC
oi; CD166
Lo células foram isoladas por FACS de 8 a 12 ratinhos semanas de idade. O gráfico mostra a percentagem de células formadoras de esfera, com base nas esferas a partir de cada população por 2500 células plaqueadas após 8 dias de crescimento. Dados apresentados como média +/- DST (**, p 0,001, n = 3). (C) Dobre mudança de LSC
oi; CD166
conteúdo oi baseado em WT intacta a partir da análise FACS. (*, P 0,05, n = 3)
estaminais da próstata /progenitor As células são caracterizados pela sua capacidade de formar esferas
in vitro
[26]. Foi realizado o ensaio de formação de esfera usando CD166
células lo hi e CD166
ordenados e descobriu que CD166
células hi têm aumento significativo da actividade de formação de esfera em comparação com CD166
células lo (Figura 1B, para a esquerda ). Uma vez que tinha anteriormente desenvolvido o LSC
oi esquema de enriquecimento [26], que produz enriquecimento de 10 vezes de células formadoras de esfera WT, testámos se CD166 podem ser utilizadas para a actividade de formação de esfera mais enriquecedor. Nós fechado LSC
células hi de acordo com a sua expressão CD166 e descobriu que LSC
oi; CD166
células hi têm 5 vezes mais elevada actividade de formação de esfera, em comparação com o seu LSC
oi; CD166
lo homólogo (Figura 1B, à direita). Portanto, CD166 pode ser usado como um marcador para enriquecer ainda mais células formando esfera dentro da próstata WT. passagens em série das esferas geradas a partir LSC
oi; CD166
células hi demonstrado que esta atividade de formação de esfera reforçada poderia ser mantida
in vitro
por pelo menos três passagens (Figura S1A). Em contraste, menos esferas foram geradas a partir LSC
oi; CD166
células lo (P0-P2) e não podem ser submetidos a passagem contínua devido ao número de células limitado. Nós não houve diferença significativa na distribuição de tamanho de esfera entre LSC
oi; CD166
oi gerado esferas e LSC
oi; CD166
lo esferas (Figura s1b e s1c) gerado. Semelhante ao LSC
subpopulação oi [26], a castração também leva ao aumento significativo do LSC
oi;. CD166
oi sub-população (Figura 1C)
CD166
oi células da próstata humana têm esfera superior Forming e potencial de regeneração
certos marcadores da superfície celular, tais como Sca-1, são expressos apenas no ratinho e, portanto, não pode ser usado para isolamento de células estaminais /progenitoras humanas. CD166, por outro lado, é expressa em vários órgãos humanos e regulada positivamente em cancros humanos, incluindo o cancro da próstata [27]. Para determinar se CD166 pode ser utilizado para o enriquecimento da próstata humana estaminais /progenitores, examinamos primeiro a sua expressão e descobriram que CD166 é altamente expresso no epitélio fetal humano em desenvolvimento da próstata (Figura 2A, painel da esquerda) e focalmente expressa na próstata adulta benigna, que se sobrepõe com um subconjunto de TROP2 e CD49f -. células positivas (Figura 2, painéis do meio e direita)
(a) coloração IHC de CD166 em tecido da próstata fetal humano e tecidos de cancro da próstata de pacientes. Barra de escala: 50 ^ m. (B) Total dissociada células da próstata, CD166
hi e CD166
populações lo foram isoladas por FACS a partir de 6 amostras de doentes. O gráfico mostra a percentagem de células formadoras de esfera, com base nas esferas a partir de cada população por 5.000 células plaqueadas após 7 dias de cultura. Dados apresentados como média +/- DST (**, p 0,001). (C) CD166
oi, e CD166
populações lo foram isoladas por FACS a partir de 3 amostras de pacientes. CD166
hi e CD166
células lo (2 × 10
5) foram implantadas subcutaneamente no NOD ratinhos-SCID /IL2rγ nulos, em combinação com 2 × 10
5 rUGSM células mesenquimais indutivo. Os enxertos foram colhidas, fixadas e analisadas após 8-16 semanas. À esquerda, o gráfico mostra que CD166
células da próstata humanos hi podem formar mais túbulos em ensaio de enxerto de regeneração em comparação com CD166
células da próstata humanos lo. Certo, H E coloração de enxerto representive. Barra de escala: 100? m. parcelas (D) Esquerda, FACS mostram portas desenhadas para classificação de LTC (TROP2
oi; CD49f
oi) CD166
oi e LTC; CD166
lo subpopulações de um paciente. Direita, o gráfico representativo mostra que LTC; CD166
células da próstata humanos hi podem formar mais túbulos em ensaio de enxerto de regeneração em comparação com LTC;. CD166
células da próstata humanos lo
Em seguida, avaliamos se CD166 pode ser usado como um marcador para o enriquecimento de células estaminais /progenitoras humanas. regiões benignos do tecido da próstata foram coletadas a partir de vários pacientes submetidos à prostatectomia radical e dissociadas de células individuais. Consistente com os nossos estudos anteriores [13], [28], as percentagens de CD166
+ células variar de paciente para paciente (dados não mostrados). No entanto, a maioria da actividade de formação esfera foi identificado no CD166
oi população (Figura 2B), semelhante aos nossos resultados com as células da próstata de murideo. Os dados são apresentados a partir de 6 pacientes representativas.
Para avaliar se CD166 pode enriquecer a capacidade de regeneração dos tecidos da próstata humana
em
vivo
, células da próstata humanos benignos foram dissociadas e classificado de acordo com a níveis de expressão de CD166 de superfície celular. O mesmo número de CD166
hi e CD166
células lo viáveis (2 × 10
5) foi implantado por via subcutânea em NOD-SCID /IL2rγ camundongos nulos, em combinação com 2 × 10
5 rUGSM mesenquimais indutiva células. Após 8-16 semanas, os enxertos foram recolhidas, fixadas e incluídas em parafina para a quantificação e análise. CD166
células hi têm mais capacidade de regeneração de tecidos como evidenciado pelo aumento do número de estruturas epiteliais do túbulo-like encontrado nos enxertos, o que raramente é visto nas CD166
enxertos lo (Figura 2C). Outras análises mostraram que as estruturas tubulares semelhantes iniciadas por CD166
células hi conter CK5 e p63 expressando células basais, as células luminais CK8 e células AR positivos (Figura S2).
Combinação de marcadores TROP2 e CD49f lata celas separadas linhagem negativa humanas epiteliais de próstata em várias sub-populações, com TROP2
oi; CD49f
oi (Lin
-T
hic
oi ou LTC) células que possuem a mais alta esfera formando capacidade
in vitro
[29]. Além disso, as células LTC podem desenvolver câncer-como fenótipo
in vivo
seguinte transformação oncogénica [13]. Testamos se CD166 pode segregar ainda mais essa população LTC. A análise FACS das células da próstata humanos benignos indicou que mais de 50% de LTC células estaminais /progenitoras também expressam o marcador de superfície CD166 (Figura 2D, à esquerda e o painel do meio). Além disso, nós examinamos se existem diferenças de potencial de regeneração entre estas duas subpopulações. Classificadas LTC; CD166
oi e LTC; CD166
células lo foram injetados subcutaneamente em NOD-SCID /IL2rγ
– ratinhos nulos com 2 × 10
5 células rUGSM e analisados 8-16 semanas mais tarde. Nosso
in vivo
dados sugerem que a LTC; CD166
células hi pode induzir mais estruturas tubulares-like, enquanto LTC;. CD166
células lo têm menos capacidade de regeneração (Figura 2D, painel da direita)
CD166 pode ser usado para enriquecer tumor células formadoras de esfera no
Pten
Null Cancro da próstata
para examinar se CD166 pode enriquecer células tumorais iniciar após a castração, comparou-se a percentagem de CD166
subpopulação oi entre
ratinhos mutantes PTEN
inteiros e castrados e observou a expansão do CD166
subpopulação oi após a castração (Figura 3A). Em seguida, foram comparadas as capacidades de formação esfera de LSC
oi; CD166
oi, LSC
oi; CD166
lo, LSC
lo; CD166
oi, e LSC
lo; CD166
subpopulações lo no PIN pré-câncer (6 semanas) e estágios do câncer (11 semanas). Descobrimos que o LSC
oi; CD166
subpopulação oi tem muito maior capacidade de formação de esfera, e quase toda a atividade de formação de esfera no estágio do câncer reside no LSC
oi; CD166
subpopulação oi (Figura 3B). Consistente com nossa observação anterior de que
PTEN
esferas mutantes são maiores do que as esferas de controle WT [19], ambos os LSC
oi; CD166
hi e LSC
Hi; CD166
subpopulações lo formar grandes esferas próstata (Figura S3). Nosso estudo anterior sugeriu que
Pten
eliminação promove a expansão da LSC
oi próstata células estaminais /progenitoras [18], [19]. Dentro do LSC
população oi, observou-se expansão seletiva da LSC
oi; CD166
células hi.
ratinhos mutantes PTEN
ter mais do que um aumento de 3 vezes na percentagem de LSC
oi;. CD166
subpopulação oi, em comparação com ninhadas WT (Figura 3C)
( a) borrões FACS mostram aumento Lin
-CD166
população oi após a castração de
PTEN
ratinhos mutantes em comparação com ratos mutantes PTEN
intactas
. (B) Quatro subpopulações (LSC
hiCD166
oi, LSC
hiCD166
lo, LSC
loCD166
oi, LSC
loCD166
lo) foram isolados a partir de
Pten
próstata mutante a partir de qualquer 6 semanas ou ratos velhos 11 semanas. O gráfico mostra a percentagem de células formadoras de esfera. Os dados de várias experiências foram reunidas. Dados apresentados como média +/- DST (*, P 0,05, n = 3). (C) Esquerda: gráfico de barras mostra dobrar mudança de
Pten
mutante LSC
hiCD166
oi conteúdo em comparação com WT; direita, borrões de FACS mostram a expansão da LSC
oi CD166
células hi na população LSC em
Pten
mutante em comparação com WT. (D) RNA foi isolado de não-LSC, LSC
hiCD166
oi, e LSC
hiCD166
frações lo em experiências duplicadas. O ARN foi sintetizado em ADNc e submetido a qRT-PCR. O gráfico mostra dobrar-enriquecimento sobre as células não-LSC para cada gene. GADPH foi usado como gene de referência (*, p 0,05; ** p 0,01; ns, não significativo).
Para aprofundar o estudo do LSC
oi; CD166
oi subpopulação, nós isolado RNA de LSC
oi; CD166
oi, LSC
oi; CD166
subpopulações LO e a fração de células esgotado de células LSC (não-LSC
oi) e comparados suas expressões de genes por análise de RT-PCR. LSC
oi; CD166
subpopulação oi expressa níveis semelhantes de marcadores de células basais
CK5
e
p63
como o LSC
oi; CD166
lo subpopulação (Figura 3D, painel esquerdo). No entanto, LSC
oi; CD166
oi subpopulação expressa muito mais elevado nível de marcador luminal
Ck8
e
Trop2
, um novo marcador de superfície epitelial que recentemente identificados para enriquecer as atividades de células-tronco em ambos murino e próstatas humanas [13], [29] (Figura 3D, painel da direita). Uma análise mais aprofundada de vários outros marcadores de células-tronco de células epiteliais [10], [30], [31], [32], [33] mostrou que LSC
oi; CD166
células hi têm significativamente mais elevada
CD44 Comprar e
NKX3.1
expressão em comparação com LSC
oi; CD166
células lo. Embora em comparação com a população não-LSC, LSC
oi; CD166
células hi expressar menos
NKX3.1
. Nenhuma diferença significativa foi encontrada em
CD117
, e
CD133
expressões entre estas duas populações (Figura 3D, painel da direita).
CD166 expressão é regulada positivamente em Castração Humano próstata resistente cancer
Tendo verificado que CD166 podem ser usados para enriquecer as células LTC humanos e tumor de rato em células itiating, que, em seguida, examinaram a relação entre a expressão de CD166 e progressão do câncer de próstata humano. Nos dados clinicamente anotadas de 218 tumores de próstata [34], a expressão do gene CD166 correlaciona-se significativamente com o aumento da agressividade do câncer de próstata, como indicado pela pontuação de Gleason, com maior expressão em amostras de metástases (Figura 4A). Foram pesquisados ainda mais expressão CD166 em microarrays de tecido de câncer de próstata humanas, que consistem em 14 de castração resistentes (CRPC) amostras de metástase e 98 hormona amostras de câncer primário ingênuos de pacientes que receberam um ou outro tratamento neoadjuvante hormonal (NHT) para vários períodos ou que não receberam tratamento. CD166 é significativamente aumentada nas amostras CRPC (Figura 4B para imagens representativas). Em comparação com a localização da membrana predominante de CD166 em amostras de câncer primário ingênuos hormonais, observou-se intensa localização citoplasmática de CD166 em amostras CRPC metástase óssea (Figura 4B, alta ampliação). níveis de expressão de CD166 foram marcados e os valores de p são calculados pelo teste de Mann-Whitney. CD166 nível de expressão da proteína é significativamente mais elevada em amostras CRPC, em comparação com cancros primários com (p 0,0001) ou sem (p 0,02) NHT (Figura 4C). Estes dados sugerem que a CD166 é um marcador enriquecido com castração tanto para murino e cancro da próstata humano.
(A) CD166 expressão do gene a partir de 147 tumores de próstata humana foi analisado por comparação de diferentes grupos de classificação de Gleason para o normal /benigna (NL /BN) da próstata. (B) coloração IHC representativas da expressão de CD166 de próstata humana TMA. Top: hormônio de câncer de próstata primário ingênua; câncer de próstata resistente à castração mostrando imunocoloração altamente intensiva: Low. Barra de escala: 100 mm (à esquerda); 10