Abstract

Fundo

sistema Telomere /telomerase foi recentemente reconhecido como um atrativo alvo para a terapia anti-cancro. Resultados da inibição da telomerase em regressão do tumor e aumentou a sensibilidade a várias drogas citotóxicas. No entanto, não tem sido totalmente estabelecido se o mediador destes efeitos é a inibição da telomerase

per se

ou encurtamento dos telómeros resultante da inibição da actividade da telomerase. Além disso, as características e os mecanismos de sensibilização a fármacos citotóxicos causada pela inibição da telomerase não foi elucidado de uma forma sistemática.

Metodologia /Principais Achados

Neste estudo, caracteriza-se a importância relativa de inibição da telomerase contra o encurtamento dos telômeros em células cancerosas. Sensibilização de células de cancro a drogas citotóxicas foi conseguida por encurtamento dos telómeros de uma forma dependente comprimento e não pela inibição da telomerase

per se

. No nosso sistema Esta sensibilização foi relacionado com o mecanismo de acção do fármaco citotóxico. Além disso, o encurtamento do telômero afetados também outras funções celulares de cancro, como a migração. Encurtamento do telômero induzida danos no DNA cuja reparação foi prejudicada após a administração de cisplatina, enquanto doxorrubicina ou vincristina não afetou a reparação do ADN. Estes resultados foram verificados também no

in vivo

modelo do rato. A explicação putativa subjacente ao fenótipo induzido pelo encurtamento do telômero pode estar relacionada com alterações na expressão de vários microRNAs desencadeadas pelo encurtamento dos telómeros.

Conclusões /Significado

Para nosso melhor conhecimento, este é o primeiro estudo a caracterização o impacto relativo da inibição da telomerase e encurtamento do telómero sobre vários aspectos do fenótipo de células de câncer, especialmente relacionados com a sensibilidade a drogas citotóxicas e seus mecanismos putativos. As mudanças de microRNA em células cancerosas em cima do encurtamento dos telómeros são informações romance. Estes resultados podem facilitar o desenvolvimento de abordagens baseadas dos telômeros em tratamento de câncer

Citation:. Uziel O, Beery E, Dronichev V, Samocha K, Gryaznov S, Weiss L, et al. (2010) encurtamento do telômero sensibiliza células cancerosas para agentes citotóxicos seleccionados:

In Vitro

e

In Vivo

Estudos e putativos mecanismos. PLoS ONE 5 (2): e9132. doi: 10.1371 /journal.pone.0009132

editor: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 30 setembro de 2009; Aceito: 06 de dezembro de 2009; Publicação: 09 de fevereiro de 2010

Direitos de autor: © 2010 Uziel et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi parcialmente apoiado por bolsas de investigação de Rabin Medical Center Authority Research e uma bolsa de investigação Sackler School of Medicine, Tel-Aviv University, Israel. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

telómeros humanos são compostos de repetições em cadeia simples e TTAGGG correspondentes cadeias duplas do presente hexanucleotide localizado em ambas as extremidades do cromossoma linear. Juntamente com o seu complexo específico proteína shelterin que proporcionam estabilidade a todo o genoma, mascarando as extremidades do cromossoma de ser tratada por meio de mecanismos de reparação de ADN como quebras de cadeia dupla [1]. Os telómeros incrementalmente corroer na maioria das células somáticas em cada ciclo de replicação de ADN, até que eles atinjam curto comprimento crítico que eventualmente inicia uma cessação do crescimento celular denominado senescência celular [2]. As células cancerosas usam a enzima telomerase para contornar o encurtamento do telômero, e, assim, alcançar o potencial replicativo sem fim. A telomerase é um complexo ribonucleoproteico transcriptase reversa única que mantém um estado estável de comprimento de telómeros por sintetizar repetições TTAGGG nas extremidades dos cromossomas. É altamente activo em mais do que 90% de todas as malignidades, e, por conseguinte, considerado um marcador de cancro [3]. A telomerase não se expressa na maioria das células somáticas normais mas retém a actividade moderada em células estaminais proliferativas e a uma maior extensão em células germinais masculinas. Devido a esta especificidade e essencialidade para o tempo de vida ilimitado de células cancerosas, a telomerase é considerado um alvo atraente anticancerígeno válido e [4].

De facto, numerosos estudos demonstraram que os resultados da inibição da telomerase na apoptose de células cancerosas, encolhimento de tumores em modelos animais experimentais e o aumento da sensibilidade de células tumorais para várias modalidades anticancerígenos [5]. No entanto, não está claro se esses efeitos “benéficos biologicamente desejáveis” são a consequência de encurtamento dos telômeros ou inibição da telomerase

per se

. Além disso, não foi determinado se o aumento da sensibilidade aos fármacos citotóxicos por inibição da telomerase /encurtamento dos telómeros está dependente do mecanismo ou da classe do agente quimioterapêutico.

A maior parte do ponto de dados para o encurtamento dos telómeros abaixo de um limite crítico como o alvo mais importante conseguida pela inibição da telomerase [6], [7], apoiando a noção de que a realização do encurtamento dos telómeros significativa irá resultar em efeitos anti-câncer clínicos. No entanto, vários estudos implicam actividades adicionais “extracurricular” de telomerase que são independentes da regulação comprimento dos telômeros. Por exemplo, a telomerase tem sido demonstrado que possuem propriedades anti-apoptóticos [8], [9]. Além disso, o seu envolvimento na resposta a danos no ADN [10] ou de protecção de ADN por “capping” [11] foi determinado bem. A telomerase também foi implicada no controlo de expressão de gene independentemente de comprimento do telómero e da contribuição para o crescimento de vários tipos de [12] benignos -. [14] [15], as células malignas e [16]

O objectivo do presente estudo foi elucidar a importância da inibição da telomerase

por si só contra o efeito de encurtamento dos telómeros nas células cancerosas e para avaliar o efeito destas perturbações sobre a sensibilidade das células a várias drogas citotóxicas, com diferentes mecanismos de acção. Além disso, temos o objetivo de descrever os mecanismos pelos quais as células com encurtado o comprimento dos telômeros sensibilidade exposição diferencial a essas drogas.

Nós descobrimos que a inibição da telomerase

per se

não altera a sensibilidade dos vários linhas de células malignas para qualquer dos fármacos testados. inibição da telomerase longo prazo que resultou em encurtamento do telómero sensibilizado as células a cisplatina, um adutos de DNA agente formador e não à doxorrubicina, um duplo rupturas dos filamentos agente ou a vincristina, que o modo de ação não é através de danos no DNA direta produtoras. Estes resultados foram confirmados em modelos animais utilizando ratinhos nus com xenoenxertos de células de carcinoma pancreático, que foram expostas ao inibidor da telomerase e drogas citotóxicas. As células com telómeros mais curtos adquirida danos fenótipo de ADN cuja reparação foi prejudicada depois de apenas cisplatina e expressa miARN que estão associados com a paragem do crescimento de células cancerosas. Estas células também apresentou migração mais lento em comparação com o tipo selvagem (WT) vias. Nós sugerimos que o encurtamento dos telômeros em células de câncer está associada a mudanças na expressão de miRNA e leva a reparação do ADN alterado após a exposição a cisplatina especificamente.

Materiais e Métodos

Linhas Celulares

linha de células SK-N-MC (sarcoma de Ewing) foi gentilmente cedido pelo Dr. Gad Lavie (Sheba Medical Center, Ramat-Gan, Israel). As células MCF-7 (carcinoma da mama) e K562 (leucemia mielóide crónica) foram mantidas em meio RPMI 1640 suplementado com 10-15% de soro inactivado por calor de vitelo fetal (FCS), glutamina (2 mM), penicilina e estreptomicina (Beit Haemek, Israel ). Os ensaios de proliferação, as análises apoptose e ensaios de actividade da telomerase foram realizadas em todas as linhas celulares. A linha SK-N-MC foi escolhido para posterior análise detalhada de vários mecanismos relacionados com o efeito de inibição da telomerase na sensibilidade à cisplatina. As células de controlo foram mantidas em cultura sem inibidor de telomerase, GRN163, em paralelo com as células de telomerase inibida.

A telomerase Inibição

As células foram expostas a duas vezes por semana GRN163 inibidor de telomerase, a segmentação região do molde subunidade de RNA da telomerase (hTR). As células de controlo foram mantidas em cultura sem inibidor de telomerase em paralelo com as células inibidas. Para o

in vivo

inibição da telomerase, os ratos foram injetados com GRN163L, uma palmitoil (C16) N3′-P5 ‘versão fosforamidato de GRN163 anexado-lipídico. Ambos os compostos foram gentilmente cedidas pela Geron Corporation (Menlo Park, CA, EUA)

Tratamento de Drogas e

In Vitro

Protocolo Experimental

Todas as linhas celulares foram expostos às seguintes drogas durante três dias antes da proliferação, ciclo celular e apoptose análises: cisplatina, um aductos de ADN que formam droga, doxorrubicina, um agente de quebra de cadeia dupla e vincristina, que interfere com a formação de microtúbulos do fuso, interrompe, assim, a separação dos cromossomas duplicados e impede a divisão celular. A concentração das drogas é descrita na secção de resultados

Para avaliar o efeito de inibição da telomerase contra encurtamento dos telómeros sobre a sensibilidade das células aos fármacos citotóxicos que inventei quatro condições experimentais:. 1. A telomerase foi inibida na três linhas de células de três dias sem a criação de células a actividade de telomerase e telómeros com intactos (p). 2. inibição a longo prazo (de três a 16 meses), a criação de células sem atividade da telomerase e telômeros mais curtos. 3. A retirada do inibidor de telomerase em células com telômeros mais curtos, criando células com telômeros curtos e atividade da telomerase reconstituído. 4. Como controlo utilizou-se células do tipo selvagem intacto. comprimento dos telómeros e a IC50 dos três fármacos citotóxicos foram determinados após 3 e 16 meses em todas as três linhas de células.

Ensaio de Proliferação

células aderentes (1 × 10

4

-1 SK-N-MC e MCF-7) foram semeadas em quadruplicados em placas de 24 poços. Várias drogas foram adicionadas nas seguintes concentrações variam: vincristina: 0-100 ng /ml, doxorrubicina: 0-1000 ng /ml de cisplatina e: 0-10 ug /ml. Após 3 dias, a proliferação foi determinada com o ensaio de sulfo-rodamina B [17]. A proliferação das células K562 não aderentes foi determinado pelo WST-1 de ensaio que se segue a conversão do sal de tetrazólio em corante formazano por enzimas mitocondriais de acordo com as instruções do fabricante (Roche, Alemanha) e, como descrito anteriormente [17].

TRAP Ensaio

as células (5 × 10

4 /ml) foram plaqueadas em placas de 24 poços e incubadas na presença de GRN163 durante 1-3 dias. Cada tratamento foi realizado em duplicado. Subsequentemente, a medição da actividade da telomerase foi realizado pelo ensaio TRAP com base em PCR, usando o TRAP

EZE kit de detecção da telomerase (Intergene, Nova Iorque, EUA), de acordo com as instruções do fabricante e como descrito anteriormente [17]. Resumidamente, as células foram lisadas com tampão de lise arrefecido com gelo de CHAPS) durante 30 min a 4 ° C e foram subsequentemente centrifugadas a 13000 rpm durante 30 min a 4 ° C. O sobrenadante foi então recolhido e a concentração de proteína foi determinada pelo ensaio de Bradford (Bio-Rad Laboratories, CA, EUA). Os extractos de proteína (0,2 ug) foram ensaiados para a análise de TRAP. Cada reacção foi realizada numa mistura reaccional de 50 ul contendo 10 × tampão TRAP, mistura de dNTP, iniciador TS, TRAP mistura de iniciadores e a polimerase Taq. As reacções foram realizadas a 30 ° C durante 30 minutos e foram então sujeitas a amplificação por PCR durante 30 ciclos de 94 ° C, 58 ° C e 72 ° C durante 30 s cada um, e foram separados por electroforese em géis de poliacrilamida a 12,5% (Acryl /bis 19:01 solução). Os géis foram corados com corante nucleico Verde Syber gel de ácido (Amresco, Ohio, EUA). Quantificações foram realizadas utilizando o software Quantidade-um para sistemas de análise de Imagem da Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Israel). a actividade de telomerase foi calculada de acordo com a seguinte fórmula: TPG = [(X-X

0) /C]: [(R-R

0) /Cr * 100], onde TPG é gerado o produto total, X significa cada amostra, C representa o 36 bp controle PCR interna, r é o controle quantificação TSR8.

TRF comprimento

Terminal fragmento de restrição de comprimento (TRF), correspondente ao comprimento dos telômeros, foi medida por uma técnica de mancha de Southern não radioactivo. As amostras de DNA foram extraídos a partir das células por o estojo de purificação de ADN genómico (Gentra, Minneapolis, MN, EUA) de acordo com as instruções do fabricante, digeridos durante 16 h por

HinfIII

e

RSAI

e separadas em géis de agarose a 0 · 8%. Após a transferência para membrana de nylon carregada positivamente, as amostras foram hibridadas com uma sonda marcada com digoxigenina (TTAGGG)

4 (Roche Applied Science, Mannheim, Alemanha) durante 16-18 h. As membranas foram em seguida expostos a películas sensíveis à quimioluminescência, e os comprimentos médios TRF foram calculados pelo sistema de imagem Versa doe, utilizando Quantity One Software (Bio-Rad Laboratories).

Análises de miR Assinatura

isolamento do RNA.

o ARN foi isolado utilizando o kit comercial de EZ-ARN II (Biological Industries, Beit Haemek, Israel) de acordo com as instruções do fabricante fornecidas. Em geral, as células após os tratamentos relevantes foram lisadas em tampão de lise do kit e armazenado a -70 ° C antes da extracção de ARN que foi feito para todas as células de uma só vez, antes da hibridação com as matrizes de miARN.

MicroRNA microarray.

microarrays

Custom microRNA foram previamente descritos [18]. Resumidamente, ~900 sondas de DNA oligonucleotídeos representando microRNA (Sanger banco de dados versão 10 e microRNAs adicionais previstos e validados pela Rosetta Genomics) foram vistos em triplicado em lâminas de microarray revestidos (Nexterion® Deslize E. Schott, Mainz, Alemanha). Cada amostra de RNA (15 ng de RNA total) foi marcado por ligação de uma ARN-ligante, P-rCru-Cy /corante (Dharmacon Lafayette, CO: Cy3 ou Cy5) à extremidade 3 ‘. As lâminas foram incubadas com o ARN marcado durante 12-16 horas a 42 ° C e depois lavou-se duas vezes. As matrizes foram digitalizadas a uma resolução de 10 um e as imagens foram analisadas usando o software SpotReader (Niles Scientific Portola Valley, CA). Dois tipos de controlos positivos foram incluídos no delineamento experimental: (i) pequenos RNAs sintéticos foram incrementadas em cada amostra de RNA antes da rotulagem para verificar a eficiência de marcação e (ii) sondas para abundantes pequenos RNAs foram vistos para validar a qualidade RNA. manchas de microarray foram combinados e sinais normalizados como descrito anteriormente [18]

análise

Dados

Os dados incluíram duas amostras:.. células SK-N-MC com telômeros intactas e SK-N-MC células com telômeros mais curtos. Um total de 170 sondas microRNA tinha um sinal que passou o limiar mínimo de 300 em pelo menos uma das amostras. Para cada uma dessas moléculas de microRNA calculamos a mudança vezes de sinal entre as amostras com telômeros curtos e a amostra com telômeros intactas.

ciclo celular e Análises apoptose

Células (0,7-1 × 10

4 ml

-1) foram cultivadas durante 3 dias. De flutuação e as células aderentes foram combinadas, lavadas com PBS e núcleos preparados a partir de 5 × 10

5 para 1 × 10

6 células para análise de citometria de fluxo utilizando um método de detergente-tripsina seguido por coloração com iodeto de propidio [19]. teor de ADN foi analisado pelo FACSCalibur (Becton Dickinson, San José, CA, EUA), usando software de análise de ciclo celular ModFitLT (Verity Software House Inc., Topsham, ME, EUA). A apoptose foi avaliada por análise de FACS através da qual as células na fase de pré-G1 do ciclo celular foram definidos como apoptótica.

A detecção de γH2AX Foci

As células foram plaqueadas em lâminas de cobertura e exposta ao drogas durante 24 h, fixadas e processadas como anteriormente descrito [20]. Resumidamente, as células foram fixadas com 4% paraformaldehide, lavou-se três vezes com PBS, e permeabilizadas com 5% de Triton X durante 10 min. Após três lavagens com PBS, as células foram bloqueadas por soro de burro normal a 10% e BSA a 1%, lavou-se novamente com PBS e incubadas com solução de anticorpo γH2AX (1:350, Upstate Biotechnology, Nova Iorque, EUA) durante 16 horas a 4 ° C. O segundo anticorpo CY2 conjugado anti-rato (Jackson Immuno Research Laboratories, PA, EUA) foi adicionado depois de três lavadas com PBS. lâminas de cobertura foram coradas com DAPI e solução de montagem. γH2AX focos foram visualizados sob um microscópio fluorescente (Applied Spectral Imaging, Migdal Haemek, Israel). 50 núcleos foram contados para cada amostra

O Ensaio Cometa

níveis de danos no DNA em células com diferentes comprimentos dos telômeros e danos ocorridos após a exposição a drogas foram avaliados pelo teste do cometa, como descrito [21. ]. Este ensaio segue o nível de fragilidade do ADN através da avaliação fragmentos de ADN de migração (produtos de quebras de cadeia simples e /ou duplas) a partir do núcleo para formar núcleo forma de cometa quando exposta ao campo de electroforese. Após a coloração com brometo de etídio, a extensão do cometa pode ser monitorizada e quantificada. Basicamente, suspensão de células foi misturado com 0,65% baixo ponto de fusão agarose e espalhe sobre uma lâmina de microscópio Star-geada, pré-revestidas com 0,65% de agarose de fusão normal. Uma terceira camada contendo 0,65% de agarose de baixo ponto de fusão foi colocada em cima e as células foram então lisadas por imersão das lâminas durante a noite numa solução de lise preparado de fresco (2,5 M de NaCl, 100 mM de EDTA, 10 mM de Tris, 1% de Triton X-100 , 10% de DMSO, pH 10,0) a 4 ° C. Após a lise, as lâminas foram lavadas três vezes em água fria e colocados num aparelho de electroforese horizontal em gel de electroforese contendo tampão recentemente preparado (1 mM de EDTA, 300 mM de NaOH, pH = 13,0) durante 20 min para permitir o desenrolamento do ADN. A electroforese foi então levada a cabo a 20 V e a uma corrente de arranque de 300 mA durante 20 min a 4 ° C. Em seguida, as lâminas foram neutralizados com três lavagens de 0,4 M de Tris, pH = 7,5, desidratados com etanol e seco. As lâminas foram coradas com 20 ml de solução ug /brometo de etídio e visualizadas sob uma iluminação fluorescente utilizando 530-550 nm e filtro de excitação de 590 nm filtro de barreira (cubo U-MNG, Olympus, Alemanha). Todos os passos foram realizados no escuro para evitar danos de ADN adicional. Para avaliar os parâmetros de cometas, as lâminas foram examinadas na utilização de software de análise de imagem Viscomet paralelo. Um total de 150 células escolhidas aleatoriamente a partir de lâminas foram examinados em triplicado para cada amostra (50 células por lâmina). A análise de imagem foi realizada a 200 × ampliação. As imagens de células foram projetadas em uma alta resolução Heper-HAD ™ (Sony, Japão) câmera CCD (8 bits [APPLITEC, Israel, LIS-700]) e analisados ​​com o software de análise de imagem Viscomet usando o detector de imagens MV Delta (Matrix Visão , Alemanha). danos no ADN foi medido utilizando os seguintes parâmetros: medida cometa (a distância a partir do bordo dianteiro da cabeça ao bordo de fuga da cauda), ADN percentagem cauda (percentagem de ADN de cauda), e cauda medida momento (ADN percentagem cauda cauda comprimento X ). As lâminas foram codificadas e um único investigador analisou todos os slides para minimizar a variação de pontuação

Ensaios de Migração

A migração de células foi avaliada por dois ensaios:. A cura ensaio ferida e um ensaio de câmara de Boyden modificada (Transwell ensaio).

a ferida ensaio de cura foi realizada de acordo com a ref [22]. As células foram semeadas a uma densidade de 0,2 x 10

6 células /poço em placas de cultura de seis poços e deixa-se formar uma monocamada confluente. A camada de células foi depois raspado com uma ponta de pipeta P200 para criar uma ferida de largura ~ 1 mm. Imagens das feridas foram capturados a

t

= 0 e 24 h a 40 × ampliação e a área da ferida foi determinada utilizando o Scion Image para Windows alfa 4.0.3.2 software. A capacidade das células para fechar a ferida, isto é, a sua motilidade, foi avaliada através da determinação da área cicatrizada. Percentagem da área cicatrizada foi calculado da seguinte forma: (área ferida em

t

= área 0 ferida em

t

= 22) /tamanho da ferida em

t

= 0) × 100. As placas foram marcados para assegurar foto-documentação consistente.

A câmara de Boyden modificada foi realizada como descrito anteriormente [23]. As células foram semeadas em triplicado em filtros de policarbonato com poros de 8 um posicionado no compartimento superior de 24 poços Costar Transwell câmaras (, Cambridge, Massachusetts, EUA). A superfície inferior das câmaras Transwell foi revestida com fibronectina (5 ug /filtro). O meio de cultura foi adicionado ao compartimento inferior. As células foram deixadas migrar durante 18 horas a 37 ° C e os filtros foram então fixadas com metanol e coradas com corante de Giemsa. As células na superfície superior do filtro foram removidas com um cotonete. Finalmente, as células que migraram para o lado inferior do filtro foram fotografadas e contadas sob um microscópio.

Animais

sexo feminino ou masculino atímicos BALB /c

nu /nu

ratinhos, 5-6 semanas de idade, foram adquiridos a Harlan Ltd. (Jerusalém, Israel). Os ratos foram alojados em condições específicas isentos de agentes patogénicos no top gaiolas filtradas e alimentados com uma dieta regular. Todos os procedimentos foram realizados utilizando instalações e protocolos aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Animal da Faculdade de Medicina da Universidade de Hadassah-Hebraico.

Modelo murino heteróloga de humano

CRL 1867 células (carcinoma do pâncreas humano) foram colhidas por tripsinização de culturas confluentes, lavou-se e ressuspenderam-se a 1,0 x 10

8 células /ml em meio de crescimento. Os ratinhos foram inoculados com CRL 1687 células em meio 100ul sob a pele dorsal um dia após a irradiação de corpo inteiro a 400 cGy, entregue por um acelerador linear (Varian Climac 6 ×) a uma fonte de distância da pele de 80 cm, e uma taxa de dose de 170 cGy /min. Os ratinhos foram tratados com 30 mg /kg i.p. GRN 163L 3 vezes por semana, durante várias semanas, começando um dia após a injecção do tumor. O grupo de controlo foi injectado com PBS (0,2 ml i.p.). O crescimento tumoral foi monitorizado a cada 6-8 dias por medições calibradas de dois diâmetros perpendiculares de xenoenxertos (D

1, o diâmetro maior e D

2, o diâmetro mais pequeno). O volume do tumor foi medido utilizando a fórmula: n /6 (D

1 × D

2), e expresso como o volume de tumor médio ± EP (em mm

3). Em 41-55 dias após a injecção das células, na altura da morte, os tumores foram excisados ​​livres de tecido conjuntivo, pesado e metade foi congelada em azoto líquido. A outra metade foi utilizada para a determinação do comprimento de telómeros e parâmetros patológicos.

Histologia

No final das experiências, os ratinhos foram sacrificados e o tumor, pâncreas, pulmão e tecido foram removidos. Os tecidos foram fixados em formol 10%, embebidos em parafina, corados com hematoxilina e eosina, e avaliadas por microscopia de luz.

Resultados

In Vitro

Estudos

inibição da telomerase com GRN163 encurta os telómeros.

a administração de GRN163 resultou em% de inibição da telomerase 70-90 (Fig. 1a). Esta inibição persistiu até 72 horas e medições repetidas ao longo dos 16 meses da experiência verificou inibição contínua de telomerase neste intervalo (não mostrado). Em todas as linhas celulares, os telómeros eram reduzidos a uma gama de 20-30% e 40% após 3 e 16 meses, respectivamente (Fig. 1 B).

a. SK-N-MC, MCF-7 e K562 foram expostas a 5uM de GRN163. a actividade de telomerase foi avaliado pelo ensaio TRAP após 24 horas. células não tratadas de controlo C-, M- incompatibilidade inespecífica oligo mexidos, I-telomerase GRN163 inibidor. R8- controle TRAP padrão, controle negativo N- sem extractos celulares, IC- controlo interno da PCR. A extensão da inibição da telomerase é denotado em percentagens abaixo as pistas. b. As células SK-N-MC foram continuamente expostas a 5 uM de GRN163. o comprimento dos telômeros foi medida por Southern blot. células não tratadas de controlo C-, Ia- comprimento dos telómeros de células expostas ao inibidor da telomerase durante três meses, Ib comprimento dos telómeros de células expostas ao inibidor da telomerase durante 16 meses, M- marcador de tamanho molecular. Valor médio do comprimento do telômero é indicado abaixo de cada pista, ea porcentagem de encurtamento dos telômeros é mostrado também. c. apresentação gráfica da extensão do encurtamento dos telómeros após a exposição das células SK-N-MC para GRN163 por 1 ano, medida por Southern blot.

encurtamento do telômero, mas nenhuma inibição da telomerase

per se

sensibiliza células especificamente a cisplatina.

Como se mostra na Fig. 2 e Tabela 1 telomere encurtamento aumentou a sensibilidade das três linhas de células de cisplatina de uma forma dependente comprimento. inibição da telomerase

per se

não teve efeito independente sobre a sensibilidade de células a cisplatina. O IC

50 de cisplatina diminuiu de 0.13μg /ml para 0.07μg /ml após 16 meses. Encurtamento do telômero não afetou significativamente a sensibilidade das células de doxorrubicina e vincristina. A Tabela 1 resume estes resultados e Fig. 2 mostra em detalhes as alterações na sensibilidade das células SK-N-MC com cisplatina. Uma vez que todas as linhas celulares apresentaram comportamento semelhante para este propósito, seleccionámos células SK-N-MC como um modelo para caracterização adicional dos mecanismos subjacentes ao encurtamento dos telómeros sensibilização induzida de células de cancro a quimioterapia e a sensibilidade diferencial a cisplatina.

a. A proliferação de células com telómeros encurtados expostas a cisplatina. As células SK-N-MC foram continuamente expostas a GRN163. A sensibilidade das células à cisplatina foi estimada após três meses e 16 meses de inibição da telomerase. Os números indicam o IC

50 do fármaco nestes pontos de tempo (após 22% e 40% de redução em comprimento do telómero). P valor refere-se à diferença entre WT e curtas tel-16 meses. b. estado do ciclo celular de células SK-N-MC com telómeros encurtados expostos a 0.13μg /ml de cisplatina. As células SK-N-MC com telómeros encurtados foram expostas a cisplatina e o estado do ciclo celular foi avaliada por FACS. + Ou – refere-se à exposição a cisplatina. C. O índice apoptótico das células SK-N-MC com telómeros encurtados expostas a cisplatina. As mesmas células foram analisadas por FACS para o seu índice apoptótico, tal como representado pelo seu estado preG1. Os números indicam a LD

50 de cisplatina em células com telômeros intactas ou encurtados.

encurtamento do telômero não afeta o status do ciclo celular após a exposição a drogas citotóxicas.

Telómero encurtamento não afectar o estado do ciclo celular das células (barras a e C na Fig. 2b). A exposição das células à cisplatina resultou numa diminuição de G0 /G1 e G2 aumento de M /fases do ciclo celular. Estas mudanças não foram afectados pelo encurtamento dos telómeros (Fig. 2b). Além disso, o encurtamento do telômero fez aumentar a taxa de apoptose das células devido à quimioterapia (Fig. 2c).

encurtamento do telômero mais lenta a migração de células cancerosas.

Desde

in vitro

migração de células cancerosas é considerado uma representação válida do seu potencial metastático, foi avaliado o efeito do encurtamento dos telómeros sobre esse recurso também. A migração foi avaliada por membrana Transwell (câmara de Boyden) ensaios (Fig. 3a, b) e a cicatrização de feridas (Fig. 3c, d). Como mostrado na Fig. 3, no ensaio de membrana Transwell com as células migraram telómeros encurtados significativamente mais lento do que as células de controlo. O ensaio de cicatrização também demonstrou tendência de migração mais lenta, mas os resultados não alcançaram significância estatística.

A migração de células com telômeros mais curtos foi avaliada pela transpoço ea ferida ensaios de cura. uma. O ensaio de membrana Transwell. As células intactas ou com telómeros encurtados foram deixadas migrar através de uma membrana, durante 16 horas, Gimza coradas e contadas. A imagem representativa é mostrado. b. Demonstração gráfica da contagem celular média de quatro experiências independentes. c. A ferida ensaio de cura. As células com telómeros encurtados foram plaqueadas em placas de Petri, e a cultura foi “riscado” e seguido por 24 horas. medidas médias dos desvios livres de células foram feito. Um exemplo representativo é mostrado. d. demonstração gráfica das contagens de células média de quatro experiências independentes.

Os estudos subsequentes foram realizados a fim de elucidar os mecanismos possíveis subjacentes às alterações fenotípicas induzidas pelo encurtamento dos telómeros.

encurtamento do telómero está associada ao aumento danos no DNA e capacidade de reparo do DNA prejudicada avaliada pelo teste do cometa. Cisplatina prejudica ainda mais a reparação de ADN em células com telómeros encurtados.

telómeros encurtamento pode intensificar a resposta de dano de ADN devido a perda da sua função protectora. Para avaliar o nível de danos ao DNA em células com telômeros mais curtos, foi empregado o teste do cometa. Como mostrado na Fig. 4a, b encurtamento dos telómeros foi associada a danos no ADN nas células. Cauda parâmetro momento medida (reflectindo ADN da cauda comprimento da cauda percentagem X, enquanto que o comprimento da cauda é a distância em uM do centro da cabeça à extremidade da cauda) foi 30% maior nas células com telómeros mais curtos. Avaliação de todos os outros parâmetros de teste do cometa revelou resultados semelhantes, ea intensidade cometa global aumentou em cerca de 16% nestas células.

a. O princípio do ensaio do cometa. Células núcleos foram expostas a electroforese e coradas com brometo de etídio. DNA quebrado migra para fora dos núcleos e forma o cometa. Três graus de danos no DNA são mostrados: núcleos de controle com o DNA intacto (que representam danos no DNA em células com telômeros intactas, nº 1), estado intermediário em células com DNA parcialmente quebrada (representando células com encurtamento do telómero leve, # 2) e células com encurtado telomeres abrigar DNA danificado quebrado (representando células com telômeros mais curtos, nº 3). b. A quantificação da extensão do estado de danos no ADN de células com telómeros encurtados, realizada por rastreio de 50 imagens por amostra em quádruplos. No parâmetro momento extensão da cauda esquerda, sobre o total de intensidades cometa destros. c. A quantificação da extensão da capacidade das células para reparar danos no ADN aplicadas por doxorrubicina (painel da direita) ou cisplatina (painel da esquerda) e 2 4 horas após o dano induzido de drogas. O ensaio foi realizado por rastreio de 50 imagens por amostra em quádruplos. O estado de danos no DNA foi determinada por meio do cálculo do momento da cauda medida.

Para compreender porque as células com os telómeros mais curtos são mais sensíveis a cisplatina do que a doxorrubicina, as células foram expostas a estes fármacos durante uma hora seguida pela mudando o meio para meio sem drogas. níveis de danos no DNA foram avaliados 2 e 4 horas após a exposição à droga usando o teste do cometa. Como mostrado na Fig. 4c, ambas as drogas induzidos danos no ADN, mas as células com os telómeros encurtados falhou para reparar os danos no ADN causados ​​por cisplatina, ao passo que o dano induzido doxorrubicina foi reparado de uma maneira semelhante por células com ambos os telómeros intactas e encurtados.

encurtamento dos telômeros é associada com a formação de danos dos telômeros focos induzida (TIF), cuja reparação é prejudicada em células com telômeros mais curtos. uma. b. c. FIG.