Abstract

expressão e função de lectina-like oxidado lipoproteína de baixa densidade do receptor-1 alterada (LOX -1) tem sido associado com várias doenças, tais como disfunção endotelial, aterosclerose e obesidade. Nestas patologias, oxLDL /LOX-1 activa as vias que promovem a proliferação celular, motilidade celular e angiogénese de sinalização. Estudos recentes têm indicado que

ROL

1 mRNA é sobre-expresso em estágio III e IV do adenocarcinomas prostáticos humanos. No entanto, a função de LOX-1 na angiogénese do cancro da próstata permanece a ser determinada. Nosso objetivo foi analisar a contribuição de oxLDL e LOX-1 a angiogênese do tumor usando C4-2 células cancerosas da próstata. Analisou-se a expressão de moléculas pró-angiogénicos e a angiogénese em xenoenxertos do tumor do cancro da próstata, usando modelos celulares de cancro da próstata com a sobre-expressão ou knockdown do receptor LOX-1. Os nossos resultados demonstram que a activação da LOX-1 utilizando oxLDL aumenta a proliferação das células, e a expressão das moléculas pró-angiogénicos de VEGF, MMP-2, e MMP-9 de um modo dependente da dose. Visivelmente, esses efeitos foram impedidos no modelo de cancro da próstata C4-2 quando LOX-1 expressão foi derrubado. O efeito angiogénico de LOX-1 activadas com oxLDL foi ainda demonstrada utilizando o ensaio do anel aórtico e o modelo xenoenxerto de crescimento do tumor na membrana corioalantóica de embriões de galinha. Consequentemente, propomos que LOX-1 ativação por oxLDL é um evento importante que aumenta a angiogênese do tumor em células cancerosas humanas da próstata

Citation:. González-Chavarría I, Cerro RP, Parra NP, Sandoval FA, Zuñiga FA, Omazábal VA, et ai. (2014) Como Lectina-LDL oxidada receptor-1 é um potenciador da angiogénese de tumores em células de cancro da próstata humano. PLoS ONE 9 (8): e106219. doi: 10.1371 /journal.pone.0106219

editor: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 07 de fevereiro de 2014; Aceito: 29 de julho de 2014; Publicação: 29 de agosto de 2014

Direitos de autor: © 2014 González-Chavarría et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado por Fondecyt Grant 1121159, Conicyt, Chile. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

semelhantes a lectina a lipoproteína de baixa densidade oxidada do receptor-1 (LOX-1) é um membro da família do receptor eliminador de [1], que medeia o reconhecimento e interiorização de LDL oxidada (ox-LDL) [2 ]. LOX-1 é expresso principalmente em células endoteliais, embora este receptor também podem ser encontrados em muitos outros tipos de células, tais como monócitos, cardiomiocytes, adipócitos, plaquetas, macrófagos e células do músculo liso vascular [3]. A expressão alterada e função do receptor LOX-1 tem sido associado a doenças tais como disfunção endotelial, aterosclerose, obesidade, e, recentemente, também com o desenvolvimento do tumor [4] – [6]. A activação de LOX-1 por oxLDL em células endoteliais humanas induz a expressão de moléculas de adesão; vias de sinalização inflamatórias Pro; e proteínas pró-angiogénicos, tais como metaloproteinase-2 e 9 (MMP-2 e MMP-9), angiotensina II (Ang II) e factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) [7] – [10]. A angiogénese é um processo fisiológico, o qual determina a formação de novos vasos sanguíneos a partir de vasos pré-existentes [11]. É considerado um fenómeno normal durante o desenvolvimento embrionário, o crescimento do organismo e a cura de feridas [12]. No entanto, a angiogénese também é um processo fundamental para o desenvolvimento e progressão de vários tipos de tumores [13]. angiogénese tumoral é regulado pelo balanço entre as moléculas de pro- e anti-angiogénicos libertadas por células de tumor e células do estroma do tumor, tais como fibroblastos e macrófagos, que determinam a activação de angiogénese de tumores [14], [15]. A expressão do gene na angiogénese tumoral é ainda regulada em resposta a vários estímulos, como hipóxia, estresse oxidativo e inflamação. Nesta conexão entre estímulos e expressão de proteínas pró-angiogénico, o VEGF tem sido identificada como um factor importante na angiogénese tumoral [16], [17]. A hipoxia, a secreção de citocinas e stress oxidativo nas células tumorais aumenta a expressão de VEGF, induzindo assim a angiogénese de tumores [18].

LOX-1 foi sugerida como uma possível ligação entre a obesidade, dislipidemia, e cancro [19] . Consistentemente, condições clínicas da aterosclerose e obesidade têm sido associados a progressão tumoral e metástases no cancro da próstata [20] – [22]. Pacientes com diagnóstico de síndrome metabólica, doenças inflamatórias crónicas e doenças auto-imunes mostraram uma alta incidência e agressividade no desenvolvimento do tumor [23]. Com efeito, estudos recentes têm mostrado um aumento da expressão de LOX-1 em adenocarcinomas da próstata humana em fases III e IV [5], o que requer nova vascularização e angiogénese de invasão local. No entanto, ainda não foi descrito o efeito específico de LOX-1 na angiogénese tumoral.

Este trabalho demonstra que a LOX-1 e a sua activação através de oxLDL induzir angiogénese tumoral e estimular a proliferação celular em células de cancro da próstata. Especificamente, foi demonstrado que a activação de LOX-1 utilizando oxLDL promove a proliferação celular, e a expressão de moléculas pró-angiogénicos de VEGF, MMP-2, e MMP-9 de um modo dependente da dose. Notavelmente, estes efeitos foram impedidos no modelo de cancro da próstata C4-2 quando LOX-1 expressão foi derrubado. Além disso, o efeito angiogénico de LOX-1 activada por oxLDL foi demonstrada utilizando o ensaio do anel aórtico e o modelo de xenoenxerto de tumor de crescimento nas membranas corioalantóicas (CAM) de embriões de galinha. Por isso, propomos que LOX-1 ativação por oxLDL é uma via de ativação relevantes necessárias para o reforço angiogênico do desenvolvimento do tumor de células cancerosas humanas da próstata.

Resultados

Geração de linhas de células de câncer de próstata superexpressão LOX-1 e shRNA contra olr1

as linhas celulares de cancro da próstata C4-2 foram transduzidas com o vector de expressão de lentivírus LvCW-LOX-1, que codifica para a

olr1

gene sob o controlo do citomegalovírus promotor (CMVP), e isolado utilizando o método de diluição limitante clonagem. A sobre-expressão de LOX-1 em células C4-2 foi determinada utilizando PCR em tempo real, imunotransferência, e imunofluorescência. Obtiveram-se sete clones com diferentes LOX-1 sobre-expressão, destes, 3 clones foram seleccionados depois de experiências de transferência de Western e analisado utilizando PCR em tempo real (Fig. 1A e D). O clone de células seleccionado C4-2 /​​LOX-1 (+) (clone 5) tinha um 1,2 × 10

3 vezes sobre expressão de LOX-1 basais níveis de mRNA da linha celular nativo C4-2 ou C4-2 /controle superexpressão GFP. Além disso, a sobre-expressão de LOX-1 neste clone foi imunolocalizada na membrana celular usando microscopia confocal (Fig. 1F). Para determinar se a sobreexpressão mediada por partículas lentivirais tinha um efeito sobre a expressão de LOX-1, um controlo sobre-expressão (células C4-2 /​​GFP) foi gerado. Não se observou alterações significativas na expressão de LOX-1 neste controlo em comparação com a linha de células C4-2 nativa (Fig. 1C e F).

A) Western blot para a LOX-1 (40 kDa ) expressão em clones CAP humanos com sobre-expressão de LOX-1. B) Western Blot para a LOX-1 (40 kDa) expressão em clones de células de cancro de próstata humana em LOX-1 knockdown C) PCR em tempo real para a LOX-1, em três clones de expressão com a sobre-expressão de LOX-1. D) PCR em tempo real para a LOX-1 foi determinada a expressão de três clones que expressam shRNA /LOX-1 (A) e três clones que expressam shRNA /LOX-1 (B). Os dados representam as médias ± S.D. de três experiências independentes realizadas em triplicado, e analisados ​​estatisticamente por meio de análise de uma via de variância e pós-teste de Dunnett; (***

p≤0.001

, **

p≤0.01

, *

p≤0.05

).

O LOX- um knockdown em células C4-2 foi conseguida utilizando um shRNA contra o ARNm codificado pelo

olr1

gene. células C4-2 foram transduzidas com vectores lentivirais para a expressão de cada shRNA (LVW-U6 /

ROL

1) sequência contra

olr1

sob o controle do promotor U6. As células transduzidas foram isolados usando o método de diluição limitante clonagem, e LOX-1-para baixo expressão foi analisada utilizando PCR em tempo real, imunotransferência, e imunofluorescência (Fig. 1). Duas sequências diferentes, shRNA shRNA-A e B-shRNA, foram analisados. Três clones diferentes de shRNA-A e shRNA-B-1 LOX knockdown foram obtidos. O clone seleccionado shRNA-B diminuiu de LOX-1 por expressão de 98%, em comparação com LOX-1 basais níveis de ARNm da linha de células C4-2 nativa ou a linha celular de controlo knockdown C4-2 /​​LvEmpty (Fig. 1B-E). Além disso, o baixo-expressão de LOX-1 neste clone foi verificada por meio de imuno-histoquímica (Fig. 1F). Para determinar se o knockdown mediada por partículas lentivirais tinha um efeito sobre a expressão de LOX-1 um controlo knockdown (C4-2 /​​LvEmpty) foi gerado. Não foram observadas alterações significativas na expressão de LOX-1 neste controlo em comparação com a linha de células C4-2 nativa (Fig. 1C e F).

Os modelos de células de cancro da próstata obtido, a saber, C4-2 /LOX-1 (+) [clone 5], C4-2 /​​LOX-1 (-) [clone shRNA-B1] e linha de células C4-2 nativa, foram utilizadas como modelos em todos os ensaios realizados neste trabalho

oxLDL não tem efeitos de citotoxicidade em modelos de células de câncer de próstata

a partir da oxidação da LDL nativa de paciente normolipêmicos obtivemos uma fração do nível médio de LDL oxidada (oxLDL), que foi verificado por geração de dienos conjugados e borato de sódio tampão de electroforese em 1% de agarose (Fig. 2A). Para determinar se a oxLDL obtido tinha algum efeito citotóxico incubámos os modelos de células de cancro da próstata com oxLDL (25 a 150 ug /ml) durante 12 horas. Os resultados não mostraram efeitos citotóxicos de oxLDL em qualquer um dos modelos celulares da próstata para a gama de concentrações testadas (Fig. 2B). No entanto, observou-se um aumento significativo na proliferação de células de C4-2, C4-2 /​​GFP, C4-2 /​​LvEmpty e C4-2 /​​LOX-1 (+) modelos celulares para todas as concentrações de LDL-ox utilizados, em comparação com o mesmo sem tratamento modelos de células de câncer de próstata. Além disso, um aumento significativo na proliferação de células foi observada em C4-2 /​​LOX-1 (+) em comparação com o C4-2, ou a sobre-expressão e controlos knockdown para todas as concentrações analisadas oxLDL. No entanto, o efeito proliferativo foi totalmente evitada no /1-LOX C4-2 (-) modelo de células, a todas as concentrações analisadas (Fig. 2B)

A) de oxLDL obtido a partir de plasma humano foi oxidado com 7. uM de CuSO

4, monitorizado por espectrofotometria a 243 nm e λ a electroforese em géis de agarose a 1% com tampão de borato de sódio. B) Ensaio de citotoxicidade dos modelos celulares de cancro da próstata tratados com 25, 50, e 100 ug /ml de LDL oxidada durante 12 horas. Os dados representam as médias ± S.D. de três experiências independentes realizadas em triplicado e analisados ​​estatisticamente utilizando-se ANOVA e pós-teste de Dunnett (* ou #

p≤0.05

).

O ligando oxLDL aumenta a expressão de marcadores pró-angiogénicos

a linha de células C4-2 cancro da próstata foi incubado com concentrações crescentes de oxLDL (25, 50, 100 ug /ml) durante 12 horas, e a expressão dos marcadores de VEGF pró-angiogénico , MMP-2 e MMP-9, foi analisada utilizando-PCR em tempo real. Os nossos resultados mostraram um aumento significativo na expressão de VEGF, a MMP-2 e MMP-9, proporcional às concentrações utilizadas oxLDL, com um respectivo 3.5-, 2.5-, e aumento de 3 vezes, em que 100 ug /ml de LDL oxidada foi usava. Além disso, a LOX-1 também expressão foi aumentado proporcionalmente com as concentrações de LDL-ox utilizados, mostrando um aumento de 3 vezes a 100 ug /mL (Fig. 3).

A quantificação relativa de LOX-1, VEGF, MMP -2, e MMP-9 de expressão foi realizada utilizando PCR em tempo real em linha de células de cancro da próstata humano C4-2 incubadas com o aumento da concentração de LDL oxidada (25, 50, 100 ug /mL) durante 12 horas. Os dados representam a média ± S.D. de três experiências independentes realizadas em triplicado, e analisados ​​estatisticamente por meio de análise de uma via de variância e pós-teste Dunnet; (***

p≤0.001

, **

p≤0.01

, *

p≤0.05

).

O aumento da expressão marcadores pró-angiogénicos em células de cancro da próstata requer a activação de LOX-1 por oxLDL

Os modelos de células cancerosas da próstata C4-2 /​​LOX-1 (-) e C4-2 /​​LOX-1 (+) foram incubadas com 100 ug /mL de oxLDL durante 12 horas, e a expressão dos marcadores pró-angiogénicos (VEGF, MMP-2 e MMP-9) foi analisada. A expressão do VEGF, MMP-2 e MMP-9 na linha de células C4-2 incubadas com LDL oxidada aumentou significativamente (2-, 2-, e 2,5 vezes, respectivamente), em comparação com células não tratadas C4-2 (Fig. 4A ). Curiosamente, a expressão de marcadores pró-angiogénicas induzidas por oxLDL, foi impedido na LOX-1 C4-2 /​​(-) modelo de células de cancro da próstata. Por outro lado, a estimulação de C4-2 /​​LOX-1 (+) com oxLDL aumentou significativamente a expressão de todos os marcadores analisados ​​pró-angiogénicos (VEGF e MMP-2, 2 vezes; MMP-9, 3 vezes), em comparação com células não tratadas C4-2. A expressão do VEGF, MMP-2, e MMP-9 de células em C4-2 /​​LOX-1 (+) também foi significativamente aumentada (1.6-, 1.5- e 1,4 vezes, respectivamente), mesmo na ausência de oxLDL estimulação, e diminuiu em 20%, 50%, e 20% em C4-2 /​​LOX-1 (-) células, em comparação com a expressão endógena na linha de células C4-2, sem estimulação de oxLDL (Fig. 4A)

C4-2, C4-2 /​​LOX-1 (-), e C4-2 LOX-1 (+) modelos de células de cancro de próstata humana foram incubadas na com ou sem oxLDL [100 ug /ml] para 12 horas. A) A quantificação relativa de VEGF, MMP-2 e MMP-9 de expressão foi analisada utilizando PCR em tempo real. Os dados representam as médias ± S.D. de três experiências independentes realizadas em triplicado e estatisticamente analisados ​​utilizando a análise de variância e pós-teste Dunnet; (***

p≤0.001

, **

p≤0.01

, *

p≤0.05

). B) Western blot para expressão VEGF (30 kDa). C) zimograma para MMP-2 (72 kDa pró-forma; 64 kDa ativa-forma) e MMP-9 (92 kDa pró-forma;. 84 kDa ativa-forma) As actividades em meio condicionado

O meio condicionado a partir de modelos de células de cancro da próstata incubadas com oxLDL [100 ug /ml] foram recolhidas e concentradas. Mais tarde, a expressão de VEGF foi avaliada por imunotransf erência, e a actividade da MMP-2 e MMP-9 foi analisado por zimografia. Os nossos resultados indicaram que a expressão de VEGF foi aumentada em células incubadas com oxLDL C4-2, quando comparando com as células sem C4-2 oxLDL, ao passo que a expressão de VEGF foi impedido em C4-2 /​​LOX-1 (-) células incubadas com oxLDL [ ,,,0],100 ug /mL]. Além disso, a expressão de VEGF foi aumentada em células C4-2 /​​LOX-1 (+) com o tratamento sem oxLDL (Fig. 3B). Análise da actividade de metaloproteinase mostraram um aumento na actividade da gelatinase de MMP-2 e MMP-9 em meio condicionado a partir de células incubadas com oxLDL C4-2, e foi impedido em meio condicionado a partir de C4-2 /​​LOX-1 (-) células incubadas com oxLDL. Além disso, a sobre-expressão de LOX-1 em C4-2 /​​LOX-1 (+) células mostraram um aumento da actividade de MMP-2 e MMP-9 com ou sem estimulação oxLDL (Fig. 4C).

Activação de LOX -1 por oxLDL promove a geração de broto em anéis de aorta de rato

Foram analisados ​​C4-2 células incubadas com oxLDL modelo para determinar se a geração de brotos endoteliais pode ser estimulada no ensaio do anel aórtico, através da secreção de diferencial marcadores pró-angiogénicos. O C4-2, C4-2 /​​LOX-1 (-) e C4-2 /​​LOX-1 (+) modelos de células foram incubadas com 100 ug /ml de LDL oxidada durante 12 horas, e o meio condicionado foi recolhido, concentrado e usado para o tratamento dos anéis aórticos de rato.

a estimulação dos anéis de aorta a partir de meios condicionados com C4-2 e células tratadas com oxLDL C4-2 /​​LOX-1 (+) aumentou significativamente a produção de brotos em comparação com a linha não tratada células C4-2. No entanto, as diferenças entre a geração anel broto aórtica por meio condicionado a partir de C4-2 /​​LOX-1 (-) com ou sem estimulação oxLDL, não foram significativas. Assim, a sobre-expressão de LOX-1 promoveu geração brotos com ou sem estimulação oxLDL (Fig. 5A).

A). Fotomicrografia de anéis aórticos de rato e quantificação de brotos por anel incubadas com meio condicionado de cancro da próstata C4-2, C4-2 /​​LOX-1 (-), e as células C4-2 de LOX-1 (+) previamente estimuladas com ou sem oxLDL [100 ug /mL]. B) LOX-1 ativação por oxLDL promove a angiogênese tumoral em modelos de xenotransplante PAC na membrana corioalant�ca de embriões de galinha. Fotomicrografia e quantificação de vasos sanguíneos tumorais de xenoenxertos em C4-2, C4-2 /​​LOX-1 (-), e as células C4-2 de LOX-1 (+), previamente incubadas com ou sem oxLDL [100 ug /ml], nas membranas corioalantóicas de embriões de galinha de 10 dias de idade. Os dados representam as médias ± S.D. de três experiências independentes realizadas em triplicado, e foram analisados ​​estatisticamente por meio de análise de uma via de variância com pós-teste de Dunnett (***

p≤0.001

, **

p≤0.01

, *

p≤0.05

).

Ativação da LOX-1 por oxLDL promove a angiogênese em xenoenxertos de células de câncer de próstata na membrana corioalant�ca de embriões de galinha

para estudos de angiogênese em membrana corioalantóide (CAM) de embriões de galinha, os clones de células do cancro da próstata C4-2, C4-2 /​​LOX-1 (-), e C4-2 LOX-1 (+) foram pré-incubadas com oxLDL 100 ug /mL para 2 horas. Cerca de 1 × 10

6 células foram então inoculadas em CAM de embriões de galinha de 10 dias de idade. Cinco dias após a inoculação, os tumores foram extraídos a partir das CAMs e analisou-se a extensão da vascularização tumoral. C4-2 células pré-incubadas com oxLDL mostrou um aumento significativo da vascularização do tumor em comparação com as células não tratadas C4-2. Além disso, a sobre-expressão de LOX-1 em C4-2 /​​LOX-1 (+) células também mostrou um aumento da vascularização do tumor quando as células foram incubadas com ou sem oxLDL em comparação com as células não tratadas C4-2. Notavelmente, C4-2 /​​LOX-1 (-) células tratadas com LDL oxidada não apresentou variações significativas na vascularização do tumor, em comparação com ambos C4-2 e C4-2 /​​LOX-1 (-) células não tratadas (Fig. 5B).

o

olr1

gene é sobre-expresso em conjuntos de dados de matriz públicas de câncer de próstata metastático

com o objectivo de determinar se os efeitos observados sobre a angiogênese tumoral mediadas por oxLDL /LOX-1 em C4-2 células cancerosas da próstata tinha qualquer relevância clínica em pacientes, foi utilizado Omnibus banco de dados Gene Expression NCBI (GEO) para determinar a expressão de

olr1

receptor no conjunto de dados GDS2545, que tem diferentes fases de progressão do câncer de próstata . Estes dados permitem a análise comparativa dos tumores humanos metastáticas da próstata, tumores da próstata primários e tecido de um doador normal. Neste contexto, a expressão de

OLR-1

foi encontrado para ser significativamente aumentada em tumores da próstata e tumores primários da próstata metastático, quando comparada com tecido normal da próstata (Fig. 6).

A expressão de

olr1

em diferentes fases da progressão do tumor do cancro da próstata foi determinada utilizando a base de dados pública GDS2545 no Gene Expression Omnibus NCBI (GEO). Os dados representam as médias ± D.P. de tecido humano normal de doadores n = 17, os tumores de próstata primários n = 64 e metastáticos tumores de próstata n = 50, que foram analisados ​​estatisticamente usando um

t

teste (

* p≤0.05

).

Discussão

neste trabalho demonstramos, pela primeira vez, o papel do receptor LOX-1 e sua ativação usando oxLDL, sobre a proliferação e angiogênese de C4 humana 2 células cancerosas da próstata. Especificamente, foi demonstrado que um aumento das concentrações de LDL-ox promoveu a proliferação de células e significativamente aumenta proporcionalmente e a expressão do VEGF marcadores pró-angiogénicos, e as metaloproteinases MMP-2 e MMP-9. Além disso, a estimulação celular de LOX-1 com oxLDL também aumentou a expressão do receptor LOX-1, gerando um retorno de circuito positivos de LOX-1.

A associação de LOX-1 e oxLDL com doenças , tais como disfunção endotelial, aterosclerose, enfarte agudo do miocárdio, acidente vascular cerebral, diabetes, hipertensão, obesidade e síndrome metabólica, tem sido extensivamente estudado [3], [5], [24]. A obesidade, em si, também tem sido associada como um importante factor de risco para aterosclerose, diabetes mellitus tipo 2 e o cancro, bem como outras doenças [25]. Estudos clínicos sugerem uma associação entre as concentrações de LDL-ox alta de soro e um aumento do risco de desenvolver câncer de cólon [26]. Além disso, as concentrações de LDL-ox também ter sido demonstrado que o aumento em pacientes obesos [27].

De acordo com estes resultados, os relatórios anteriores tinham demonstrado que a obesidade é associada com um risco aumentado de desenvolver cancro da próstata metastático e maligno altamente [21 ], [28]. Além disso, no Transgénicos Adenocarcinoma do rato próstata (TRAMP) modelo de ratinho, a alimentação dos ratos com uma dieta hipercalórica, aumenta o grau histológico dos tumores da próstata, o número de metástases, massa de tumor, e o grau de vascularização, em comparação para TRAMP camundongos alimentados com dieta normal [29].

Há uma especial relevância na relação entre colesterol e câncer de próstata, porque andrógenos e outros hormônios esteróides são sintetizados a partir do colesterol, e são fundamentais para o desenvolvimento e manutenção do cancro da próstata [30]. Sob condições fisiológicas androgénios estão envolvidos na aquisição de características sexuais secundárias, crescimento e desenvolvimento normal da próstata. No entanto, eles também têm sido associados com a progressão do tumor no cancro da próstata [31]. Assim, muitos dos cancros da próstata refractário a privação de androgénio, a entrada de colesterol aumento, que é o principal substrato para a síntese de androgénio [31], [32]. A este respeito, a principal fonte de colesterol para as células tumorais é de LDL, que é endocyted principalmente pelos receptores de LDL (LDLR) [33], [34]. No entanto, consideramos que o oxidante e microambiente do tumor pró-inflamatório rico em ROS [35] poderia estar promovendo modificação LDL por lipoperoxidação [36], evitando o reconhecimento por LDLR e favorecendo a sua captação por receptores de catadores de LDL-ox. De acordo com isso, analisou-se a expressão de receptores para lipoproteínas sequestrantes modificados e a expressão do receptor de LDL no conjunto de dados GDS2545, obtidos a partir da base de dados pública (perfil GEO) [37]. Nesse sentido, observou-se um aumento significativo na expressão dos receptores scavenger

olr1, lenço

e

SCARB1

em tumores primários e metástases de cancro da próstata, e um aumento significativo na expressão do

CD36 Comprar e

olr1

receptor na metástase do câncer de próstata em comparação com o tecido da próstata normal. Curiosamente, a expressão de LDLR mostrou uma diminuição significativa na sua expressão em metástase de tumores e não foi observada nenhuma diferença significativa entre os tumores da próstata primários e tecido da próstata normal (dados não mostrados).

Considerando isto, elevadas concentrações de LDL circulante em pacientes obesos com cancro da próstata pode contribuir para a progressão do tumor através de LOX-1 por activação da oxidação de LDL modificado (oxLDL) gerado no microambiente oxidante, presente no estroma do tumor da próstata. A este respeito, é gerado um nível médio de LDL oxidado, o qual deve ser representativa da oxLDL presentes no microambiente tumoral. Os nossos resultados demonstraram que a oxLDL usadas neste estudo não tem efeito citotóxico em qualquer uma das células de cancro da próstata modelos C4-2 ensaiadas. A este respeito, tem sido relatado que a oxLDL tem um efeito citotóxico diferencial dependendo do tipo celular. Células cancerosas linhas K562 /SA2 (leucemia) e EC9706 (carcinoma esofágico) tratou-se com oxLDL apresentar uma taxa mais elevada de viabilidade celular comparada Whit células não tumorais, tais como células endoteliais HUVEC (veia umbilical humana) [38].

Curiosamente, observou-se um aumento significativo na proliferação de células da C4-2, C4-2 /​​GFP, C4-2 /​​C4-2 LvEmpty e /LOX-1 (+) modelos celulares, ao longo de toda a gama de concentrações ensaiadas oxLDL em comparação com as linhas de células não tratadas. Além disso, o modelo de célula C4-2 /​​LOX-1 (+) mostraram uma proliferação maior em comparação com os modelos de células de controlo C4-2, C4-2 /​​GFP, e C4-2 /​​LvEmpty, para todas as concentrações ensaiadas. No entanto, o efeito proliferativo de oxLDL foi impedido na LOX-1 C4-2 /​​(-) modelo de células, indicando que este efeito está intimamente relacionada com a activação do receptor LOX-1 por oxLDL. Neste sentido, o efeito proliferativo promovido por oxLDL /LOX-1 foi descrita em células musculares, células endoteliais e, recentemente, no cancro da mama células através de vias que envolvem activação de p38 (MAPK), p44 /42 MAPK, e NF-KB [6 ], [39]. No entanto, ainda não tinha sido descrita os efeitos proliferativos sobre as células de cancro da próstata.

In vitro

estudos mostraram que a estimulação de oxLDL de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) activa a expressão do LOX -1 receptor, gerando uma sobre-expressão de moléculas de adesão, proteínas inflamatórias, e as MMP-2 e MMP-9 metaloproteinases, [8], [40], [41]. Por outro lado, células endoteliais de aorta bovina tratada com Ox-LDL promover a formação capilar regulada pela LOX-1, e a activação da NADPH-oxidase /MAPKinase /NF-kappa B, com um aumento na expressão de VEGF [9], [42]. Os nossos resultados demonstraram que a expressão de VEGF, e a activação de MMP-2 e MMP-9, está intimamente mediada por oxLDL /LOX-1 na linha celular de cancro da próstata C4-2.

também confirmar, utilizando o ensaio do anel aórtico e o modelo xenoenxerto de CAM de embrião de galinha, que o aumento do VEGF, MMP-2 e MMP-9 de expressão mediada pela LOX-1 /oxLDL tem um efeito angiogénico tumoral, tanto in

in vivo e

ex vivo

em C4-2 modelos células cancerosas da próstata. Isto é consistente com anteriores

ex vivo

estudos, onde os fatores pró-angiogênicos como angiotensina II não induziu capilar formação de broto em anéis de aorta isolados de

KO

ratos ROL-1 [10]. Da mesma forma, a ablação do gene

OLR-1 diminuiu marcadamente a neovascularização coroidal em modelos murinos de lesão induzida por laser [43]. A sinalização induzida por oxLDL /LOX-1 pode ter um papel crítico no processo da angiogénese do tumor porque a densidade de microvasos é um indicador importante de prognóstico no cancro da próstata, e está associado com o estágio clínico, progressão, metástase, e a sobrevivência do cancro da próstata [44], [45].

em conclusão, nós demonstram uma relação directa entre factores tais como a obesidade, a LOX-1 /oxLDL e o aumento da expressão da proliferação e pró-angiogénicos marcadores, que têm um efeito biológico na angiogénese tumoral

ex vivo

e

in vivo

em C4-2 modelos células cancerosas da próstata. Por isso, sugerimos que LOX-1 poderia ser um regulador essencial em células de câncer de próstata, com a capacidade de aumentar a angiogénese tumoral em direção malignidade e metástases em pacientes obesos.

Materiais e Métodos

cultura celular

cancerosas

C4-2 próstata humano [46], [47] e HEK-293 FT células foram cultivadas em meio RPMI 1640 e meio DMEM, respectivamente, suplementado com 2 mM de L-glutamina (Hyclone), 10% fetal de soro de bovino (FBS) e 1% de penicilina estreptomicina (GIBCO).

Animais

Homem ratinhos BALB /c foram obtidos da Harlan Winkelmann GmbH (Borchen, Alemanha) e alojados sob condições ambientes controlada e estéril condições. Quatro ratinhos (8-12 semanas de idade) foram utilizados para os experimentos.

Ovos de

Gallus gallus domesticus

foram obtidos de ISP (Instituto de Salud Pública, Chile), foram lavadas com um 7 uM solução de sulfato de cobre para evitar a contaminação fúngica, e foram incubados a 37,5 ° C e 80% de humidade relativa durante 10 dias. Os ovos foram capotou periodicamente com um turner dupla automática (GQF Hova-Bator Manufacturing Co. EUA) para impedir a adesão e ruptura do CAM da casca de ovo. Os embriões inoculados com as células C4-2 modelos foram incubados a 37,5 ° C, 80% de humidade e 5% de CO

2 durante 5 dias.

Todos os estudos envolvendo experiências com animais foram em conformidade com as directrizes e as recomendações do Guia NIH para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório (edição atual) e seguiu as políticas indicadas no manual do Chile Biossegurança da Conicyt (Agência Nacional para a Ciência e Tecnologia). Os protocolos experimentais foram elaborados pelos autores e aprovado pelo Comitê de Ética Institucional. Em todos os casos, a fiscalização das autoridades veterinárias da Escola de Ciências Biológicas, Universidad de Concepción, Chile, estava garantida. Quando os ratos foram utilizados para a experimentação, eles foram alojados em quartos individuais e alimentação adequada, abastecimento de água e vigilância da saúde foi permanentemente fornecido. Os animais sacrificados foram humanamente tratadas. Eles foram submetidos a anestesia inicial e injeção de cloreto de potássio por via intravenosa para evitar sofrimento.

Preparação

ox-LDL

As amostras de sangue (20 ml) foram obtidos a partir de quatro voluntários, que assinaram um termo de consentimento. Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade de Concepción, Chile. LDL humana (1,019-1,063 g /mL) foi isolada a partir do plasma de sangue de sujeitos humanos saudáveis ​​por ultracentrifugação sequencial a 4 ° C. A LDL foi dialisada contra tampão filtrada (0,45 um) de LDL (150 mmol /L de NaCl; 0,24 mmol /L de EDTA, pH 7,4), mudada três vezes, durante 36 horas a 4 ° C. Após diálise extensa contra PBS, com 3 mudanças, durante 36 horas a 4 ° C, LDL oxidada foi preparado por incubação de LDL purificado com 7 uM CuSO

4 durante 3 horas a 37 ° C. Modificação das LDL foi monitorizado por espectrofotometria de mediante a geração de dienos conjugados em λ 243 nm, e, em seguida, uma electroforese em gel de agarose a 1% em tampão de borato de sódio foi realizada para determinar a alteração na migração eletroforética de oxLDL em comparação com a LDL. O gel foi corado com 0,25% de azul de Coomassie R-250, durante 2 horas, e descorados durante 4 horas usando 5% de MeOH, 7,5% de HOAc, 87,5% H

2O. As bandas de LDL e oxLDL foram analisados ​​com o instrumento Odyssey CLX (LI-COR, EEUU).

citotoxicidade avaliação

Os modelos de células de câncer de próstata foram incubadas com 25, 50 e 100 ug /mL oxLDL durante 12 horas. Depois disso, o meio foi removido, as culturas foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato, e a viabilidade celular foi medida incubando as culturas com 10 mg /ml de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5- brometo difenil tetrazólio (MTT) a 37 ° C durante 30 min, e medindo a absorvância a 570 nm, em células solubilizado usando um UV-visível SPECTROstar

Nano

espectrómetro (BMG LABTECH, Alemanha).

vectores lentivirais que expressam ORL-1 ou shRNA contra olr1

a sequência de LOX-1 humana foi sub-clonado no vector lentiviral pLCW, gerando o construto pLCW-LOX-1.