Abstract

Fundo

A superexpressão do fator de transcrição ERG devido à genômica

ERG

-rearrangements define um subtipo molecular separada de tumores de próstata. Uma das consequências da acumulação ERG é a modulação do perfil de expressão do gene da célula. Tudor proteína 1 gene (

TDRD1

) foi relatado para ser diferencialmente expressos entre contendo domínio

TMPRSS2: ERG

-negative e

TMPRSS2: ERG

cancro da próstata -positivo. O objetivo do nosso estudo foi o de fornecer uma explicação mecanicista para a ativação da transcrição do

TDRD1 Online em tumores de próstata rearranjo positivo ERG.

Metodologia /principais conclusões

medições de expressão gênica por PCR em tempo real quantitativa revelou uma co-expressão notável de

TDRD1

e

ERG

(r

2 = 0,77), mas não

ETV1

(r

2 0,01) no câncer de próstata humano

in vivo

. análise de metilação do DNA por MEDIP-Seq e seqüenciamento bissulfito mostrou que

TDRD1

expressão é inversamente correlacionada com a metilação do DNA no

TDRD1

promotor

in vitro

e

in vivo

(ρ = -0,57). Assim, desmetilação do

TDRD1

promotor em

TMPRSS2: ERG

células cancerosas da próstata -negative por inibidores metiltransferase de ADN resultou em

TDRD1

indução. Pela manipulação de

ERG

dosagem através de silenciamento de genes e expressão forçada mostramos que ERG governa perda de metilação do DNA no

TDRD1

ilha CpG associada ao promotor, levando a

TDRD1

superexpressão.

Conclusões /Significado

Nós demonstramos que a ERG é capaz de interromper um padrão de metilação do DNA específico do tecido no

TDRD1

promotor. Como resultado,

TDRD1

se torna transcricionalmente activados em

TMPRSS2: ERG

cancro da próstata -positivo. Dada a prevalência de fusões ERG,

TDRD1

superexpressão é uma alteração comum no câncer de próstata humano que podem ser explorados para procedimentos diagnósticos ou terapêuticos

Citation:. Kacprzyk LA, Laible M, Andrasiuk T, Brase JC, Bornø ST, Fälth M, et al. (2013)

ERG

Induz epigenética Ativação de Tudor Domínio contendo proteína 1 (

TDRD1

) em Câncer de Próstata

ERG

Rearranjo-positiva. PLoS ONE 8 (3): e59976. doi: 10.1371 /journal.pone.0059976

editor: Bandana Chatterjee, Universidade do Texas Saúde Science Center, Estados Unidos da América

Recebido: 04 de setembro de 2012; Aceito: 19 de fevereiro de 2013; Publicação: 29 de março de 2013

Direitos de autor: © 2013 Kacprzyk et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Ministério Federal Alemão de Educação e Pesquisa (https://www.bmbf.de/en/), no âmbito do Programa de Medicina Genome Research (NGFNplus; IG-Prostate Cancer, 01GS0890 e 01GS0891; IG-Mutanom , 01GS08107; intestinal Modifier, 01GS08111), bem como a Escola de Pós-graduação Internacional de Helmholtz para Pesquisa do Câncer da DKFZ ((www.dkfz.de/phd/)). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Cerca de metade dos casos de cancro da próstata humanas identificadas por rearranjos genómicos harbor-PSA rastreio em que elementos reguladores responsivos aos andrógenos são justapostas a genes que codificam para factores de transcrição da família ETS [1] – [3]. Como resultado, os genes ETS tornar-se acoplado ao receptor de androgénio (AR) e de sinalização são sobre-expressos em tumores da próstata de fusão-positivos [4] – [6]. O mais comum destes rearranjos genómicos,

TMPRSS2

:

ERG

fusão do gene, conduz a uma forte sobre-expressão do factor de transcrição que é de outra forma ERG ausente em células do epitélio da próstata [7] ; sob condições fisiológicas

ERG

exibe um padrão de expressão restrita a um tecido e é transcrito na linhagem hematopoiética [8] e células endoteliais [9]. A questão de como a acumulação ERG influencia a biologia das células de câncer de próstata

in vitro

e

in vivo

ganhou um interesse significativo. Até agora, ERG foi sugerido para modular o fenótipo de células de cancro da próstata por uma vasta gama de processos, incluindo: a interrupção da AR sinalização [10], a activação de c-myc de sinalização [11] e a rede de receptor de estrogénio [12], a activação de a via Wnt e indução da transição epitelial-mesenquimal-a [13], a promoção da invasão celular [14], a interacção física com PARP1 [15] e a activação de TGF-β /BMP de sinalização [16]. Tumores abrigando a fusão ERG também foram encontrados para ser enriquecido para a perda do

PTEN

supressor de tumor [17], [18]. Por conseguinte, em modelos de ratinho de cancro da próstata ERG foi mostrado para cooperar com a via PI3K para conduzir carcinogénese [19], [20]. A acumulação de ERG foi encontrado para ser associado com um padrão alterado de metilação do DNA em células de cancro da próstata [10], [21], [22]. A análise do transcriptoma do câncer de próstata realizada por nós e outros demonstraram que os tumores abrigando o

TMPRSS2

:

ERG

quota de fusão um perfil de expressão genética única que difere significativamente dos perfis de tecido benigno da próstata e tumores malignos falta a fusão [1], [10], [12], [13], [16], [23]. Especificamente, os tumores que sobre-expressam ERG são caracterizados por modulação da transcrição de genes envolvidos nas vias de Wnt e TGF-β /BMP [16], rede β-estradiol [12], [23] e do NF-kB via [24].

entre genes desregulados em

ERG

cancro da próstata -rearranged, pelo menos, dois estudos independentes identificados Tudor proteínas contendo domínio 1 (

TDRD1)

como o gene mais diferencialmente expressos entre

ERG

cancro da próstata rearranjo positivos e negativos, além de

ERG

si [16], [23]. Da mesma forma que

ERG

,

TDRD1

não é transcrita no epitélio normal da próstata [25], [26].

TDRD1

foi inicialmente identificada como um antigénio de cancro /testículo, isto é, um gene que é expresso nos testículos e cancro, mas silenciosa em tecidos somáticos adultos [26]. Sua ortholog rato,

Tdrd1

, é expresso durante a espermatogênese onde actua na via piRNA conservada para reprimir a atividade de retrotransposons Linha1 por metilação [27]. Um estudo recente no peixe-zebra sugeriu que Tdrd1 age como um andaime molecular para proteínas Piwi, piRNAs e metas Pirna [28]. Em ambos mouse e peixe-zebra, Tdrd1 é necessário para um funcionamento correcto da via piRNA e

Tdrd1

nocaute no resultado de rato em um espermatogênese com defeito [28], [29].

Aqui, nós relatório que

ERG

e

TDRD1

são co-expresso em cancros da próstata humanos e nós fornecemos uma explicação mecanicista para a co-expressão observado. Nós demonstramos que ERG ativa

TDRD1

transcrição através da indução de perda de metilação do DNA no

TDRD1

ilha CpG associada ao promotor. Propomos que esta consequência epigenética dos

TMPRSS2: ERG.

Fusão representa um novo mecanismo que pode explicar parte da modulação da transcrição induzida pelo ERG no câncer de próstata humano

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

amostras de tecido da próstata foram obtidas a partir do University Medical Center Hamburg Eppendorf. Aprovação para o estudo foi obtido a partir da comissão de ética local e todos os pacientes concordaram com a amostragem de tecido adicional para fins científicos.

As amostras de tecido da próstata, Genome-wide Expression Profiling e análise de metilação

Detalhes de humano recolha de amostras, a extracção de ARN, a conversão para ADNc e perfil de expressão do genoma são descritos noutro local [16]. extracção de ADN e análise de metilação do genoma por MEDIP-Seq são descritos noutro local [22]. Os dados do perfil de expressão do genoma e análise de metilação do genoma estão disponíveis ao público na base de dados Omnibus Gene Expression (números de acesso GSE29079 e GSE35342).

TMPRSS2: ERG

estado de fusão foi determinada por PCR utilizando iniciadores previamente descritos [30] e por qPCR [16]. As amostras, para os quais estavam disponíveis tanto a expressão e metilação do DNA de dados de mRNA, foram incluídos na análise.

Cultura de Células

VCaP, NCI-H660, LNCaP, DU145, PC-3, e RWPE -1 células foram obtidas de ATCC (Manassas, VA, EUA). células BPH-1 foram um presente tipo de Doris Mayer (DKFZ, Heidelberg). K-562 e células KG-1 foram fornecidos por Christoph Plass e Peter Krammer, respectivamente (DKFZ, Heidelberg). células Molt4 e CMK foram obtidos a partir de DSMZ (Braunschweig, Alemanha). VCaP células foram mantidas em meio DMEM (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) suplementado com 10% FBS (Gibco). as células NCI-H660 foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Gibco) suplementado com 5% de FBS (Gibco), 2 mM de L-gluatmine, 0,005 mg /ml de insulina, 0,01 mg /ml de transferrina, 30 nM de selenito de sódio, 10 nM de hidrocortisona e 10 nM de beta-estradiol (todos de Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA). LNCaP e DU145 foram mantidas em meio RPMI-1640 (Gibco) suplementado com FBS a 10%. As células de PC-3 foram cultivadas em meio F12-K (ATCC) suplementado com FBS a 10%. RWPE1 células foram cultivadas em meio livre de soro de queratinócitos suplementado com 0,05 mg /ml de extracto pituary bovino e 5 ng /ml de EGF recombinante (Gibco). BPH1 células foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Gibco) suplementado com 10% FBS e 20 ng /mL 5α-di-hidrotestosterona (Sigma). As células K-562 e MOLT-4 foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com FBS e inactivado pelo calor 10%, KG-1 e células CMK foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com 20% de FBS.

Geração de clones estáveis ​​LNCaP e indução da expressão do transgene

ERG sequência de codificação (exões 4-11 do NM_004449.3), o que corresponde a TMPRSS2: ERG fusão T1 /E4 [31], foi amplificado a partir de NM_004449. -3 contendo o plasmídeo (Facilidade genómica e proteómica core, DKFZ) por PCR utilizando os iniciadores: GCAGGCTCCACCATGACCGCGTCCTCCTCCAG para a frente, reverso CAAGAAAGCTGGGTCTTAGTAGTAAGTGCCCAGAT. clones de LNCaP transfectadas estavelmente foram geradas como previamente descrito [32]. expressão do transgene foi induzida com 50 doxiciclina ng /ml (Sigma).

Extração de RNA e Transcrição Reversa

O ARN total foi isolado a partir de linhas celulares em crescimento exponencial utilizando RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha ) seguindo as instruções do fabricante. síntese de cDNA foi performend usando SuperScript III transcriptase reversa (Life Technologies) e iniciadores de oligo-dT (Sigma-Aldrich) seguindo as instruções dos fabricantes. Para a medição de LINHA1-ORF2 do ARNm, ARN total foi tratado com ADNase Turbo (Life Technologies) para remover o ADN genómico contaminante. RNA foi então purificado utilizando Kit de Limpeza RNeasy MinElute (Qiagen) e submetido a transcrição reversa usando RevertAid H Minus Kit First Strand cDNA Synthesis (Fermentas, Burlington, Canadá) e primers hexâmeros aleatórios tratados com DNase.

quantitativa RT- PCR

os níveis de expressão de genes foram medidos no real-Time System LightCycler 480 PCR (Roche, Mannheim, Alemanha). ADNc equivalente a 10 ng de ARN total foi usada por poço. Todas as medições foram realizadas em triplicado. ensaios Taqman (Applied Biosystems) foram executados com 2x Mix absoluta QPCR (ABgene, Thermo Fischer, Epsom, UK). Ensaios Universal Probe Library (UPL) sistema (Roche) foram executados com 480 Sondas Master (Roche). valores Cp-primas foram calculados pelo software 480 Roche LightCycler utilizando o segundo método de máxima derivado. Os ensaios e as sequências dos iniciadores estão listadas na Tabela S1 em conjunto com os números das figuras correspondentes. Os níveis de expressão são apresentados como valores absolutos (Cp) ou como expressão relativa a um gene de referência interna (usando ΔCp método).

Western Blot

células exponencial de crescimento foram lisadas com tampão RIPA (50 mM de Tris-HCl a pH 8, NaCl 150 mM, 1% de NP-40, 0,5% de desoxicolato de sódio, 0,1% de SDS) suplementado com EDTA 5 mM e Halt Cocktail de Inibidor de Protease (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL). As concentrações de proteína foram determinadas com o kit BCA Protein Assay (Pierce). A menos que indicado de outra forma, 30 ug de proteína de lisados ​​foram separados em géis de 10% SDS-PAGE e transferidas para membranas de nitrocelulose (Macherey-Nagel, Düren, Alemanha) e sondados com os anticorpos listados na Tabela S1. Os sinais foram detectados utilizando solução de substrato ECL [33] e gravou com Fusion-SL 3500 WL sistema de aquisição de imagem (Vilber Lourmat, Marne-la-Vallée, França).

Gene mediada por siRNA Silenciando

Todos os siRNAs utilizados no estudo foram sintetizados por Dharmacon (Thermo Fisher Scientific, Epsom, Reino Unido) e ressuspensas em tampão 1 x o siRNA (Dharmacon). Salvo indicação em contrário, as células foram semeadas um dias antes da transfecção na confluência de 50-70%. siRNA transfecção foi efectuada utilizando Lipofectamina ARNi Max (Life Technologies) de acordo com as instruções do fabricante. complexos de transfecção foram preparadas em meio OptiMEM sem soro (Gibco) e adicionado a um meio de crescimento completo em 20:80 v /v proporção. concentrações finais de siRNAs foram de 50 nM (não-alvo piscina siRNA, ERG siRNA) ou 25 Nm (TDRD1 siRNAs). Todos siRNA usada no estudo estão listados na Tabela S1.

CpG Ilha Definição e bissulfito de DNA Sequencing

TDRD1

-promoter ilha CpG associado foi definida de acordo com o padrão critérios fornecidos pelo UCSC Genome browser de (https://genome.ucsc.edu/). O ADN genómico foi extraído de células utilizando QIAamp DNA Mini Kit sangue (Qiagen). Conversão de sódio bissulfito de ADN foi realizada com o EpiTect Bissulfito Kit (Qiagen) utilizando 1 jig de DNA genómico. O fragmento de ADN de 525 pb contendo o CpG-island-TDRD1 promotor associado foi amplificado com HotStarTaq Polimerase de ADN (Qiagen) utilizando os iniciadores listados na Tabela S1. O produto de PCR foi clonado no vector pCR2.1 usando o kit de clonagem TOPO TA (Life Technologies). TOP10 quimicamente competentes células (Life Technologies) foram transformadas com o produto de ligação. Depois de rastreio azul-branco, a partir de plasmídeos das colónias contendo a inserção foram submetidos a sequenciação de Sanger (GATC, Konstanz, Alemanha). Raw seqüenciamento Sanger leituras foram analisadas para eventos de metilação usando a ferramenta on-line Bisma [34].

5-aza-2′-desoxicitidina Tratamento

células LNCaP ou VCaP foram semeadas em poli-L- lisina (Sigma-Aldrich) revestidas placas de 12 poços a uma densidade baixa. A partir do dia seguinte, as células foram tratadas com veículo (0,1% DMSO, Applichem, Darmstadt, Alemanha) ou nas concentrações indicadas de 5-aza-2′-desoxicitidina (Sigma-Aldrich) durante cinco dias consecutivos. A cada 24 horas, o meio de crescimento foi substituído com um meio recém-preparado contendo ou 5-aza-2′-desoxicitidina ou veículo.

Ensaio de viabilidade celular

Para o ensaio de viabilidade, 2,5×10

4 VCaP células foram semeadas em placas pretas de fundo placas de 96 poços (Perkin Elmer, Waltham, MA, EUA) em 80μl do meio de crescimento normal. Após 24 h, as células foram transfectadas com ARNsi como descrito acima e este foi dia referido como “Dia 1”. A viabilidade celular foi avaliada com o celular CellTiter-Azul Viabilidade Assay (Promega Corporation, WI, EUA) nos dias 1, 3, 5, 7 e 9 de acordo com as instruções do fabricante. A fluorescência foi registada com Tecan Infinito M200 leitor de placas (Tecan Group Ltd, Männedorf, Suíça).

Statistical Data Analysis

Todos os dados foram analisados ​​utilizando GraphPad Prism 5.04. Os dados quantitativos são apresentados como média ± EPM (erro padrão da média) calculado a partir de todas as experiências efectuadas, a menos que indicado de outra forma. Todas as comparações entre os grupos experimentais foram realizadas pelo teste de Mann-Whitney-Wilcoxon com correcção de Bonferroni (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001, **** P 0,0001). Spearman (

ρ

) e Pearson (r) coeficientes de correlação foram calculados com GraphPad Prism 5.04.

Resultados

TDRD1

é co-expressa com

ERG

mas não com

ETV1

no câncer de próstata humano

a nossa expressão anterior profiling estudo de espécimes de câncer de próstata humanas revelaram que

TDRD1

é, para além de

ERG

, o gene mais diferencialmente expressos entre

TMPRSS2

:

ERG

-negative e tumores -positivas [16]. Nós, assim, realizada uma análise de correlação dos dados de amostras de tecido da próstata 93 (46 benigna, 30

TMPRSS2: ERG

-negative, 17

TMPRSS2: ERG

tumores de próstata -positivas) e descobriu que mRNA níveis de

ERG

e

TDRD1

medido pela Exon Human 1.0 ST matriz são notavelmente correlacionados em todas as amostras (r

2 = 0,84), sugerindo uma ligação mecânica entre os dois genes. Em contraste,

TDRD1

não foi co-expressa com

ETV1

(r

2 = 0,05), que é um fator de transcrição ETS encontrado para ser esporadicamente reorganizados no câncer de próstata. Para corroborar estas observações, medimos

TDRD1

,

ERG

e

ETV1

níveis de mRNA com RT-PCR quantitativo no mesmo conjunto de amostras. Mais uma vez,

TDRD1

expressão foi encontrada uma correlação com o

ERG

(r

2 = 0,77), mas não com

ETV1

(r

2 0,01 ) expressão (Fig. 1a). Para fornecer uma validação independente dos nossos achados, consultado o banco de dados Oncomine [35] utilizando “TDRD1” e “câncer de próstata”, como termos de pesquisa. A análise de dois estudos identificados apoia nossas observações: nos dados de Grasso et al. [36]

ERG

foi o mais alto co gene expresso com

TDRD1

. Nos dados de Taylor et ai. [17],

TDRD1

foi encontrado para ser co expressas com

ERG

(r

2 = 0,55), mas não com o

ETV1

(r

2 = 0,02) em 149 tumores de próstata primários. Para explicar a co-expressão observado, foram empregados modelos celulares de cancro da próstata, incluindo células representando benigna (RWPE-1, HBP-1), a fusão-negativa (PC-3, DU145),

ERG

-rearranged (VCaP, NCI-H660) e câncer de próstata

ETV1

-rearranged (LNCaP). medições de expressão genética em linhas de células de próstata mostrou que, enquanto

TDRD1

níveis de mRNA foram independentes da

ETV1

expressão, existe uma associação evidente entre

TDRD1

e

ERG

expressão

in vitro

(Fig. 1b). Nenhuma das linhas celulares sem

ERG

superexpressão expresso

TDRD1

, enquanto que as linhas de células NCI-H660 e VCaP, os quais abrigam o

TMPRSS2: ERG

fusão, expressa alta níveis de

TDRD1

(Fig. 1b). Em seguida, perguntou se os altos níveis de

TDRD1

e

ERG

RNA mensageiro nas células prostáticas ERG-positivas traduzir em quantidades consideráveis ​​das respectivas proteínas e descobriram que as células VCaP expressar ERG e TDRD1 em níveis detectáveis ​​por transferência de western (Fig. 1C). Com base nestes resultados iniciais, decidimos usar células CV como um

in vitro

modelo para estudar a relação entre mecanicista

ERG

e

TDRD1

genes em

ERG –

reorganizados cancro da próstata

(a) análise da correlação entre os níveis de mRNA medidos por qRT-PCR em

TMPRSS2: ERG

-negative (ERG-, n = 30) e

TMPRSS2: ERG cancros

-positivo (ERG +, n = 17) da próstata, bem como o tecido da próstata benigna adjacente (n = 46). Pearson coeficiente de correlação é mostrado. (B) Análise de expressão de ARNm em linhas de células de próstata por qRT-PCR. Duas experiências independentes foram realizados em triplicado. RNA testículo humano foi utilizada como controle positivo para a expressão

TDRD1

. (C) Análise de expressão de proteínas em linhas de células de próstata por Western blotting. (D) Análise de expressão de ARNm em linhas de células de cancro hematopoiéticas por qRT-PCR. Dois experimentos independentes foram realizadas em triplicado.

TDRD1

não é co-expressa com

ERG

em cancros hematopoiéticos

Alguns tipos de câncer hematopoiéticas superexpressam proteína ERG [37], [38] e é sabido que mielóide, T e leucemias Bcell dependem ERG para a sua manutenção [39], [40]. Nós, portanto, investigado

ERG

e

TDRD1

co-expressão por qRT-PCR em um painel de linhas celulares representativas de vários cancros hematopoiéticos. Embora nós detectados elevados níveis de

ERG

ARNm em várias linhas celulares de cancro derivadas da linhagem hematopoiética, a expressão correspondente de

TDRD1

ARNm foi de aproximadamente 50 vezes menor do que em células de capnografia, (Fig. 1d). Para estender a nossa análise para além das linhas celulares, comparamos

ERG

e

TDRD1

expressão de mRNA em tecidos da próstata e leucemia mielóide aguda citogeneticamente anormal (CA-AML) medido pela mesma plataforma (Exon Humano 1.0 ST array) [41]. Em contraste com as nossas observações no câncer de próstata (r

2 = 0,84),

ERG

e

TDRD1

não foram co-expressos em CA-AML (r

2 = 0,07 ).

ERG

tem também sido relatada a ser sobre-expressos em sarcomas de Ewing [42] – [45]. Analisamos assim a expressão do gene disponíveis profiling estudos de tumores sarcoma de Ewing para

TDRD1

e

ERG

expressão [46], [47]. Em contraste com o cancro da próstata, não houve co-expressão de

ERG

e

TDRD1

em qualquer um destes estudos (R

2 = 0,03 e 0,02, respectivamente). Isto sugere que a co-expressão de

ERG

e

TDRD1

é específico para o câncer de próstata.

ERG Fator de Transcrição é necessária para manter alta

TDRD1

expressão em

TMPRSS2: ERG

células -positivas

co-expressão de dois genes pode ser explicado por, entre outros, a regulação de um dos genes pelo outro ou por sua regulação mútua numa feed-forward loop. Para testar estas possibilidades, empobrecido, quer ERG ou proteína em células TDRD1 VCaP por interferência de ARN e determinado ARNm e a expressão da proteína de ambos os genes. Silenciamento de

ERG

com uma eficiência de 80% resultou em regulação baixa de 3,9 vezes de

TDRD1

mRNA 72 h pós-transfecção (P . 0,0001, Fig 2a). Em contraste, o silenciamento de

TDRD1

não resultou em qualquer alteração no

ERG

expressão de mRNA. A análise dos níveis de proteína correspondentes por Western blot revelou que o silenciamento de

ERG

e

TDRD1

genes foi muito eficaz, levando a uma depleção completa de ambas as proteínas a partir das células (Fig. 2b). Enquanto knockdown de

ERG

causou uma profunda regulação negativa da proteína TDRD1 às 72 h, não foram detectadas tais efeitos sobre ERG após o silenciamento do gene

TDRD1

. Um padrão de expressão semelhante foi também observada às 48 h após a transfecção (dados não mostrados). Em conclusão, uma presença constante de ERG é necessária para manter uma elevada expressão de

TDRD1

em células VCaP e a co-expressão observada dos dois genes em tumores da próstata podia ser explicado por uma activação unidireccional de

TDRD1

por meio do fator ERG transcrição.

(a)

ERG

e

TDRD1

níveis de expressão de mRNA em células VCaP medida 72 h após o silenciamento de genes com siRNAs. Três experiências independentes foram realizados em triplicado. (B) a expressão da proteína ERG e TDRD1 em células VCaP 72 h após o silenciamento de genes com siRNAs

TDRD1

Promotor-associado CpG Island é Hypomethylated em

TMPRSS2:. ERG

-positivo próstata tumores

Expressão de

TDRD1

, juntamente com a de outros genes específicos da linha germinal, é conhecido por ser reprimido em tecidos somáticos ao silenciar epigenética [26], [48 ]. Nós, portanto, investigado estado de metilação do

TDRD1

promotor e da ilha CpG associada no contexto do

ERG

rearranjos. Nós inspecionados metilação do DNA em torno do

TDRD1

local de início da transcrição em tumores da próstata, que se tinha analisado por MEDIP-Seq [22], e encontrei esta região a ser diferencialmente metilado entre tumores com e sem o

TMPRSS2: ERG

fusão do gene. Especificamente, a região de 1 kb abrangendo o

TDRD1

ilha CpG associada ao promotor foi significativamente hypomethylated no

TMPRSS2: ERG

tumores -positivas comparação com benigno e

TMPRSS2: ERG

tumores -negative (P . 0.0001, Fig 3A). Uma janela de 500 pb imediatamente a jusante da ilha CpG não mostraram diferenças na metilação do DNA entre tumores ERG-negativas e ERG-positivas (P = 0,41, Fig. 3a). Além disso, a sequência de ADN que flanqueia o putativo

TDRD1

promotor não foi diferencialmente metilada entre qualquer um dos três grupos (P 0,05), indicando que a metilação do ADN diferencial ocorre na proximidade directa do

TDRD1

transcricional começar site, mas não em torno dele. De nota, o nível médio de

TDRD1

metilação do promotor foi inversamente correlacionada com os níveis

TDRD1

de mRNA em todas as 93 amostras (

ρ

= -0,57), sugerindo que a perda de metilação do promotor contribui substancialmente para

TDRD1

superexpressão em

TMPRSS2:. ERG

cancro da próstata fusion-positivo (Fig. 3b)

(a) Análise de

TDRD1

metilação do promotor de tumores de próstata por MEDIP-Seq. Os valores representam o grau médio de metilação do DNA das caixas de 500-pb. análise (B) Correlação de

TDRD1

metilação do promotor e

TDRD1

expressão de mRNA no câncer de próstata. O coeficiente de correlação de Spearman é mostrado.

Perda induzida ERG de Repressão epigenética no

TDRD1

Promotor é um mecanismo principal de

TDRD1

Activation

uma vez que a região diferencialmente metilado atravessou a ilha CpG associada ao

TDRD1

ilhas promotor e CpG são conhecidos por desempenhar um papel na regulação da transcrição [49], temos realizado seqüenciamento bissulfito do

TDRD1

-associated ilha CpG em linhas de células da próstata. Descobrimos que a ilha de CpG foi totalmente metilada em células benignas e linhas celulares de cancro do ERG-negativas, com uma metilação média que varia de 89,3% para 98,6% para LNCaP para PC-3 (Fig. 4a). Em contraste, CpG metilação foi quase completamente ausente no

TMPRSS2: ERG

linhas celulares -positivas NCI-H660 e capnografia, (11,4% e 0,7%, respectivamente). Comparação dos níveis de

TDRD1

mRNA (Fig. 1b) para a metilação do DNA do CpG-ilha no

TDRD1

promotor (Fig. 4a) revelou uma correlação inversa entre os dois parâmetros em todo o linhas celulares investigadas, o que estava de acordo com os dados correspondentes a partir de tumores da próstata. Dadas as grandes diferenças na metilação do DNA no

TDRD1

promotor entre o ERG-reorganizados e restantes linhas celulares, temos a hipótese de que a perda de metilação do DNA no

TDRD1

promotor é o principal mecanismo responsável pela

TDRD1

ativação. Para testar esta possibilidade, células LNCaP tratadas ERG-negativas com o inibidor da metiltransferase de ADN 5-aza-desoxicitidina (decitabina; [50]). Depois de cinco dias de tratamento com concentrações submicromolares de decitabina observou-se um aumento dependente da dose na expressão de

GSTP1 gene que é conhecido por ser silenciado por metilação em células LNCaP [51] (Fig. 4b). Notavelmente,

TDRD1

ARNm foi regulada positivamente em mais de 25 vezes. Consequentemente, na sequência do aumento no

TDRD1

níveis de mRNA, proteínas TDRD1 tornou-se detectável em células LNCaP por immunoblotting (Fig. 4b, inserção), indicando que a perda de metilação do DNA podem então ser suficiente para conduzir

TDRD1

análise de expressão.

(a) de metilação do DNA do

TDRD1

ilha CpG associada ao promotor em linhas de células de próstata por seqüenciamento bissulfito. nível médio de metilação de toda a ilha CpG calculado a partir de cinco colônias sequenciados é mostrado (%). (B) Análise de expressão de ARNm em células LNCaP após o tratamento com o agente de desmetilação 5-aza-2′-desoxicitidina. Inserção: análise de expressão de proteína em células LNCaP após o tratamento com 5-aza-2′-desoxicitidina. 75μg de lisado de proteína a partir de células LNCaP foi utilizado por pista. (C) Análise da expressão de mRNA em clones LNCaP estáveis ​​superexpressão

ERG

. Duas experiências independentes foram realizados em triplicado. Inserção: análise da expressão do ERG em 48 h nos clones LNCaP por Western blotting. (D) seqüenciamento bissulfito do

TDRD1

ilha CpG associada ao promotor em células LNCaP 48 h após a indução da expressão de ERG com doxiciclina. (E) seqüenciamento bissulfito do

TDRD1

associada ao promotor ilha CpG 96 h após o silenciamento de

ERG

em células VCaP. Os dados mostrados na (D) e (E) são médios% de metilação de toda a ilha CpG calculado a partir de 11-12 clones sequenciados.

Para verificar se ERG pode imitar os efeitos exercida sobre

expressão TDRD1

por desmetilação do genoma LNCaP, geramos células LNCaP estáveis ​​com superexpressão sequência de codificação da

TMPRSS2: ERG

T1 fusão /E4 de forma induzível. Indução de

expressão ERG

com doxiciclina levou a um aumento de quase 5 vezes na

TDRD1

mRNA, enquanto doxiciclina não teve influência no

expressão TDRD1

no clone LNCaP levando o vector de expressão vazio (Fig. 4c). Temos usado o seqüenciamento bissulfito para analisar o estado de metilação do DNA correspondente do

TDRD1

ilha CpG associada ao promotor após indução ERG. ERG superexpressão levou à hipometilação da região promotora

TDRD1

em 27% dos alelos investigados, enquanto nós não observamos hipometilação após tratamento doxiciclina no controlo de vector vazio (Fig. 4d, Fig. S1a). Tendo em conta que o experimento inverso, ou seja, o esgotamento dos ERG em células VCaP por RNAi, levou a regulação negativa da expressão TDRD1 (Fig. 2) também têm realizado seqüenciamento bissulfito do

TDRD1

CpG ilha depois ERG silenciamento em VCaP células. Em 96 h pós-transfecção, o silenciamento de ERG com eficiência de 65% resultou aumento de quase 3 vezes na metilação do ADN significativo na ilha CpG, a partir de 15,7% de CpG metilados de controlo não-direccionamento para 45% nas células tratadas com siRNA alvejando

ERG

(Fig. 4e, Fig. S1b).

as observações acima mencionados demonstram que o estado de metilação do DNA do

TDRD1

promotor e assim a sua actividade de transcrição são mecanicamente ligados com os níveis de fator de transcrição ERG em células cancerosas da próstata.

papel diferencial de

TDRD1

no testículo e próstata

O evolutiva conservadas via piRNA desempenha um papel importante no sexo masculino da linha germinal durante a espermatogénese [52] – [54]. Os componentes da via ato piRNA para suprimir a actividade de elementos transponíveis, potencialmente, a fim de manter a integridade dos cromossomas de linhas germinativas durante desmetilação do genoma em células germinativas primordiais [55] – [57]. Estudos realizados em ratinhos e peixes-zebra demonstraram que Tdrd1, ortólogo humano de

TDRD1

, é um componente da via de piRNA que interage especificamente com proteínas piRNA-associados para potenciar o silenciamento piRNA-mediada de retrotransposões Linha1. Por conseguinte, foi demonstrado perda de Tdrd1 no rato para resultar em LINHA1 desrepressão [27], [58]. Nos seres humanos, quatro orthologs codificam proteínas piRNA-associados existe:

PIWIL1 Restaurant –

PIWIL4

[59]. [17].