Abstract

O RNA dead box helicase p68 (DDX5) é um importante receptor de andrógeno (AR) transcricional co-ativador no cancro da próstata (PCA) e é mais -expressed na doença fase tardia. β-catenina é uma proteína multifuncional com funções estruturais e de sinalização importantes que é sobre-regulada em APC e semelhante ao de p68, interage com o co-AR para activar a expressão de genes alvo AR. Importante, p68 forma complexos com nuclear β-catenina e promove a transcrição de genes em cancro do cólon, indicando uma interacção funcional entre estas duas proteínas na progressão do cancro. Neste estudo, exploramos a relação de p68 e β-catenina em APC, para avaliar o seu potencial cooperação na expressão de genes dependente de AR, o que pode ser de importância no desenvolvimento de cancro da próstata resistentes à castração (CRPCa). Usamos imunoprecipitação para demonstrar uma interacção romance entre p68 e β-catenina nos núcleos de células APC, que é dependente de células LNCaP, mas independente de andrógeno em uma hormona derivado refractário da mesma linha celular (representativo do tipo de doença CRPCa) androgénio. AR actividade melhorada é observada em ensaios de repórter de luciferase dependente de androgénios em presença de co-transfecção transitória de p68 e β-catenina como um efeito aditivo, e empobrecido-p68-imunoprecipitação da cromatina (ChIP) mostrou uma diminuição do recrutamento de AR e β- catenina para androgénio regiões promotor responsivo. Além disso, encontramos p68 imunoprecipitadas com a forma processive e não processive da RNA polimerase II (RNAP II) e show de p68 recrutados para alongar regiões do AR mediada

PSA

gene, sugerindo um papel para p68 na facilitação RNAP II transcrição de genes mediadas AR. Estes resultados sugerem p68 é importante na facilitação da β-catenina e AR atividade transcricional em células CaP

Citation:. Clark EL, Hadjimichael C, Temperley R, Barnard A, Fuller-Pace FV, Robson CN (2013) p68 /DDX5 Suporta β-catenina RNAP II durante andrógeno Receptor Mediated Transcrição em câncer de próstata. PLoS ONE 8 (1): e54150. doi: 10.1371 /journal.pone.0054150

editor: Jean-Marc A. Lobaccaro, Clermont Université, França |

Recebido: 29 de maio de 2012; Aceito: 07 de dezembro de 2012; Publicação: 17 de janeiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Clark et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela próstata Acção Charity [PCRF9 /07 a CNR ELC]; e pelo Conselho de Pesquisa Médica, Cancer Research UK, e do Departamento de Saúde da próstata Mecanismos de câncer de evolução e tratamento colaboração (prompt) [G0100100 /64424 para CNR]. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o aparecimento e progressão do cancro da próstata (CaP) é impulsionado pela função de transcrição do receptor de androgénio (AR), e de ablação de androgénios é uma estratégia eficaz nas fases iniciais da doença [1]. No entanto, o PCA pode progredir para um fenótipo de castração resistente do cancro da próstata (CRPCa) que é actualmente tratável [1], [2]. activação aberrante da AR é pensado para desempenhar um papel de destaque no desenvolvimento de CRPCa; um processo postulada como sendo, em parte, mediada através da activação descontrolada de proteínas co-activador que facilitam a expressão de genes responsivos a AR em um ambiente hormonal mínima [3]. Compreender os eventos moleculares pelos quais a progressão para CRPCa ocorre, pode levar à identificação de novos alvos e melhorar a sobrevivência de pacientes com doença.

β-catenina é um componente integral da via Wnt, desempenhando um papel na transdução de sinal. A estabilização citoplasmática e acumulação nuclear de β-catenina é a “marca” da activação da via de sinalização Wnt (ver comentários [4], [5]). Em células da próstata, β-catenina é encontrado para ser associado com liganded AR e actuam como um reforço tanto Wnt e androgénio transcrição do gene responsivo co-activador AR (revisto em [6] – [8]). AR activado é capaz de transporte para o β-catenina para o núcleo e melhorar a transcrição de AR, o que indica uma interacção dependente do ligando [9]. No entanto, xenoenxertos colhidas a partir de ratinhos resistentes à castração também demonstraram um aumento de co-localização e interacção da RA e β-catenina [10]. Em células LNCaP CaP na ausência de androgénios, H2-relaxina mediada por fosforilação de Akt e GSK-3β causou a acumulação citoplásmica estabilizado de β-catenina que, subsequentemente, ligado ao AR e translocado para o núcleo, o que sugere que a presença de androgénios não é essencial para a interacção entre a RA e β-catenina sob certas condições [11]. Curiosamente, a co-localização e interacção da RA e β-catenina não foi observado em tumores colhidos a partir de ratinhos não castrados, sugerindo que esta interacção é específica para a progressão de CaP de CRPCa e garante mais investigação. A evidência directa de β-catenina, como parte do complexo de AR da transcrição foi demonstrada através de imunoprecipitação estudos de cromatina (ChIP), que mostram β-catenina recrutados para as regiões promotoras de ambos androgénio e genes Wnt reactivo na presença e na ausência de androgénios [11 ], [12]. Outra evidência sugere que o crescimento de células de tumor da próstata metastático no osso é mediada através de androgénio activação Wnt [13], e aumento dos níveis de p-catenina nuclear têm sido correlacionadas com a progressão da doença do cancro da próstata [14], [15]. Além disso, a redução ou a perda de E-caderina, que sequestra normalmente β-catenina na membrana plasmática é postulada para aumentar os níveis de celular β-catenina e promover a actividade de AR [7]. Colectivamente, os dados sugerem um papel importante para β-catenina na progressão de CaP para o fenótipo CRPCa. No entanto, é claro que os mecanismos precisos pelos quais β-catenina medeia a atividade transcricional AR e crescimento de CRPCa na ausência de andrógenos, merece uma investigação mais aprofundada.

O p68 RNA helicase (DDX5) é um crescimento e developmentally- membro prototípico regulada da família caixa de mortos de helicases. funções de p68 em muitos processos celulares vulgarmente desregulado no cancro, incluindo o processamento de pré-ARNm e splicing alternativo, a proliferação celular, transformação microARN (revisto em [16], [17]), e a biogénese ribossoma [18]. p68 é também conhecido para interagir com vários componentes do complexo de transcrição e a co-activar vários factores de transcrição, tais como p53 supressor de tumores, Receptor de Estrogénio α (ERa) e β-catenina (revisto em [16], [19], [20 ]). Foi anteriormente demonstrado p68 sobre-expresso em APC e funcionando como um co-activador do ar [21]. Além de tumores da próstata, p68 é sobre-expresso em muitos outros tipos de células de cancro, tais como cólon e da mama, sugerindo que p68 actua como um promotor tumoral potencial ([22] e revisto em [17]). p68 e o p72 proteína altamente homóloga (Ddx17), são sobre-expressos e formam complexos com β-catenina nos núcleos de células do cancro do cólon para activar a transcrição do gene e promovem a proliferação de células [22] – [24]. Tirosina p68 593 fosforilada também está relacionado com β-catenina no citoplasma das células de cancro do cólon, onde promovida a translocação nuclear β-catenina através de uma via RanGTPase Wnt-independente através da interacção com β-catenina e deslocamento de Axin [25], [26 ]. No entanto, a investigação conflitantes encontrada nenhuma evidência de que p68 foi necessária para a translocação nuclear de β-catenina no mesmo tipo de célula [27], e tirosina p68 593 fosforilado não diferiu do de tipo selvagem na sua capacidade para estimular a-catenina β transcrição dependente em outro estudo [23].

neste artigo, usamos imunoprecipitação, técnicas de chip e repórter luciferase em combinação com knockdown nucleotídeo siRNA oligo, para explorar a relação de p68 com β-catenina para compreender o mecanismo molecular pelo que potencialmente mediar a activação aberrante da AR e crescimento das células APC, como parte do complexo AR transcrição.

resultados

p68 e β-catenina Interact no núcleo das células CaP

Dado que o receptor de androgénio (AR) associa independentemente com β-catenina e p68 em células CaP [21], [28], e de p68 e β-catenina interagir em células de cancro do cólon [23]. Nós especulamos uma possível interação proteína de três vias entre a AR, β-catenina e p68 em células APC. Ligand AR livre é sequestrado no citoplasma das células APC e sobre movimentos ligação do hormônio predominantemente no núcleo [29]. Anteriormente, verificou-se p68 a ser uma proteína nuclear em células CaP cuja localização era inalterado por tratamento androgénio [21]. No entanto, de p68 foi encontrado no citoplasma de células cancerígenas do cólon, onde se associa com β-catenina [23], [25], e β-catenina demonstrou interagir com a AR no citoplasma das células APC e passar para o núcleo na presença e na ausência de androgénios [9] – [11]. Em função destes resultados, buscou-se confirmar a localização de β-catenina e p68 na LNCaP eo refratário linha celular LNCaP-AI CaP hormonal (ver materiais e métodos). Como esperado em resposta ao tratamento R1881 (10 nM), AR translocado para o núcleo em ambas as células LNCaP-AI (Figura 1A) e LNCaP. tratamento de androgénio não alterou significativamente a localização nuclear de p68 em qualquer células LNCaP-AI ou de LNCaP e de modo semelhante, a localização da β-catenina foi inalterada após tratamento R1881. Proporcionalmente menos β-catenina é encontrado no núcleo em relação ao citoplasma de células de LNCaP, com proporcionalmente mais elevado no tipo celular de LNCaP-AI. Isso reflete descobertas anteriores que demonstraram AR constitutivamente shuttles β-catenina para o núcleo das células LNCaP-ai como uma adaptação para andrógeno condições independentes [10], [12].

A. imagens imuno-blot cortadas mostrar LNCaP citoplasmática e nuclear e lisados ​​celulares LNCaP-AI CaP (+/- R1881 10 nm, 8 horas), sondada sequencialmente com β-catenina, AR, p68, α-tubulina e TATA ligação (TBP) anticorpos . B. Interacções de p68 ectópica e β-catenina em células COS-7. lisados ​​de células inteiras de COS 7-transfectadas com pcDNA

3-p68-myc e PCs

3 + -Myc

6-β-catenina constrói (+/- R1881 10 nM, 8 horas), foram imunoprecipitados com β-catenina e anticorpo de p68, respectivamente. Cortadas imuno-manchas foram sondadas sequencialmente com β-catenina, p68 e antibody.C myc. Interacção de p68 endógena e β-catenina nos núcleos de células LNCaP e LNCaP-AI CaP na presença e na ausência de androgénios. Imagens cortadas imuno-blot de lisados ​​nucleares LNCaP e LNCaP-AI, imunoprecipitadas com o anticorpo p68 (+/- R1881 10 nM, 8 horas), e sondou sequencialmente com β-catenina e p68. amostras de extracto conter quer células inteiras ou lisado nuclear e proteína G-Sepharose com qualquer anticorpo presente. Controle (CON) amostras contêm o anticorpo e proteína G sepharose em tampão de extracção única.

Co-imunoprecipitação de lisados ​​de células HCT-116 com anticorpo β-catenina identificada uma interação p68 endógena com β-catenina, no todo lisados ​​de células cancerígenas do cólon [23]. Uma análise adicional utilizando truncagens marcada com myc de p68 demonstrou que o terminal COOH de p68 foi incapaz de interagir com β-catenina, e a interação foi através da helicase domínio (N-terminal) de p68. A seguir os nossos resultados blot-Immuno na Figura 1A onde ambos β-catenina e p68 foram encontradas no núcleo das células LNCaP e LNCaP-AI na presença e na ausência de androgénios, nós investigamos se p68 e β-catenina directamente interagiram no núcleo de células APC. A Figura 1B mostra a co-imunoprecipitação ectópica de sobre-expressa p68 marcada com myc e proteínas de fusão β-catenina na linha celular do receptor de androgénio negativos COS-7, tanto na presença como na ausência de R1881 (10 nM). Demonstrando que em

in-vitro

condições, p68 e β-catenina são capazes de se ligar directamente independentemente da AR e andrógenos. (N.B. a maior banda na imunoprecipitação blot β-catenina é uma banda não específica detectada pelo anticorpo myc). No entanto, a proteína endógena imunoprecipitada a partir de extractos de LNCaP nuclear mostrou a interacção β-catenina-p68 foi facilitada na presença de androgénios (R1881, 10 nM), mas por outro lado na linha celular LNCaP-AI a interacção foi facilitada na ausência de androgénios ( R1881, 10 nM) (Figura 1C). (N.B. a imunoprecipitação utilizando o anticorpo inversa β-catenina para puxar para baixo de proteína p68 não conseguiram demonstrar uma interacção entre as duas proteínas, quer em LNCaP ou tipo celular de LNCaP-AI, apesar de numerosas tentativas com vários anticorpos para p-catenina). Também encontrou nenhuma interacção endógeno entre p68 e β-catenina na linha celular PC3 negativo AR (ver Figura S1 na informação de apoio), indicando que a presença de um AR funcional é eventualmente importante para uma interacção endógeno da p68 e β-catenina em células CaP [21], [28].

p68 Interage com RNAP II e é recrutado para regiões funcionais do

PSA

Gene

Temos anteriormente descrito p68 como funcionamento como um “adaptador” ou proteína “acoplamento”, que podem coordenar os processos totalmente integrados de iniciação da transcrição, alongamento e splicing do mRNA na expressão de genes regulada por RA [30]. Recrutamento de p68 de genes responsivos AR endógenos podem facilitar a montagem spliceosome e aumentar a taxa de ARN polimerase II (RNAP II) alongamento, afectando o reconhecimento do sítio de splicing e exão promover pular em transcritos nascentes. Devido às funções estabelecidas p-catenina e jogo de p68 na iniciação da transcrição de genes AR regulamentados, procuramos expandir estes resultados e investigar a relação do p68 com RNAP II em células APC. Encontramos p68 imunoprecipitado com ambos endógena processiva (fosforilação de Ser-2) e não-processiva (fosforilação de Ser-5) formas de RNAP II em células APC, tanto na presença como na ausência de androgénios (Figura 2A R1881, 10 tratamento nM ). Indicando um possível papel para a atividade p68 (além da função co-ativador AR), durante as fases de alongamento de AR transcrição regulada. Já foi previamente demonstrada por cromatina-imunoprecipitação (ChIP) e análise de QPCR ao longo de um tratamento de androgénio 100 minutos (R1881, 10 nM) decurso de tempo, uma co-recrutamento de p68 com AR nas regiões promotoras e potenciadoras que respondem a androgénios do AR regulados

PSA

gene [21]. Expandindo nestes resultados, nós otimizamos primers QPCR para outras áreas do

PSA

gene (entre a intensificador e promotor região (PE), exão 1, intrão 2, exão 3, intron 3, exão 5 e regiões 3’dsF), para estabelecer se p68 foi recrutado para que não sejam de iniciação da transcrição sites. (NB A localização e sequência informações primer para estas regiões podem ser encontrados na Tabela S1 na informação de apoio. Não foi possível otimizar primers QPCR para intron 1, exão 2, intron 4 ou exão 4 regiões do

PSA

gene). A Figura 2B mostra significativa (

P

0,05 *) enriquecimento diferencial de AR mediante tratamento R1881 (10 nM) em pontos de tempo determinados (0, 15, 30, 45, 90 e 120 minutos) para o são III região do

PSA

gene, como demonstrado anteriormente [31]. Enriquecimento de AR em outras regiões não foi visto. Da mesma forma, a Figura 2C mostra significativa (

P

0,005 **) recrutamento cíclico dissociação-associação de p68 após tratamento R1881 (10 nM) para a região de ARE III, embora recrutamento não foi limitada a esta região como EP , exão 3, Intron 3, exon 5 e 3’dsF regiões também apresentaram enriquecimento significativo. Recrutamento não alcançou significância na ARE I, Exon 1 e 2 Intron regiões. Estes resultados implicam p68 está associada com ambas as formas de iniciação e alongamento da transcrição de RNAP II enriquecido e não apenas nos locais de início da transcrição de um gene regulado pelo AR mas ex�icas, regiões intrónicas e 3’dsF, indicando uma possível função de p68 no sentido de facilitar o processamento da transcrição do gene AR por RNAP II.

A. imagens imuno-blot recortadas de lisados ​​nucleares LNCaP imunoprecipitadas com RNAP II H5 (ser-2), RNAP II H14 (ser-5), RNAP II CTD monoclonal e o anticorpo p68 (+/- R1881 10 nM, 8 horas), sondou sequencialmente com p68 e anticorpo RNAP II. amostras de extracto conter ligado celular nuclear e sepharose proteína G sem anticorpos presentes. As amostras de controlo contêm anticorpo e proteína G Sepharose em apenas tampão de extracção nuclear. B. Recrutamento de p68 AR e C. às regiões do

PSA

gene. As células LNCaP foram tratadas com 10 nM R1881 e colhidas aos 0, 15, 30, 45, 90 120 pontos de tempo minuto. As amostras foram imunoprecipitadas com anticorpos IgG AR, p68 ou de controlo e recuperou material processado por ensaio de chip. dados QPCR são representativos de n = 3 ensaios Independent Chip normalizada para níveis de entrada (+/- SE). (Primers N.B. QPCR não poderia ser otimizado para todas as regiões ex�icas e intrônicas do

PSA

gene). A amostra emparelhado independente

t

teste foi utilizado para comparar o enriquecimento no recrutamento entre diferentes

PSA

regiões e mostrar importância. D. Diagrama de

PSA

gene que descreve os limites exon /intron.

p68 função é necessária para Recrutamento de AR e β-catenina para as regiões promotoras de andrógeno genes responsivos

Temos demonstrado anteriormente uma diminuição do mRNA e os níveis de proteína da AR e o andrógeno responsivo

PSA

gene mediante knockdown p68 por siRNA [21]. Consistente com os resultados acima descritos ChIP, β-catenina é recrutado para as regiões promotoras e potenciadoras de genes-alvo e de androgénio responsivo sinalização Wnt tanto na presença como na ausência de androgénios [11], [12]. Em função destes resultados, realizamos experimentos chip em células LNCaP desprovidas de p68 por siRNA para estabelecer se a função p68 era necessário para o recrutamento-catenina β AR e as regiões promotoras de genes que respondem a androgénios. p68 alvo ARNsi expressão knockdown (atenuação de ARNm de p68 ~ 50%

P

0,0494 * e protein~90% às 72 horas após a transfecção), não alterou significativamente os níveis de p-catenina de mRNA ou a expressão da proteína em comparação com controle (não-silenciamento, NS) siRNA em células LNCaPs, na presença ou ausência de R1881 (Figura 3A, B e C, respectivamente). estimulação de androgénio facilitado um recrutamento modesto (0,8 vezes) de AR para a região são i da

PSA

promotor em controlo (NS) ARNsi de LNCaP transfectadas células como esperado (Figura 4A), a qual foi significativamente atenuada para controlar os níveis em p68 células empobrecido (

p Art 0,0077 **). Do mesmo modo, a estimulação de androgénio aumento do recrutamento de AR para a região intensif icador a ARE III do

PSA

gene de 9 vezes no controle células transfectadas (NS) siRNA (Figura 4B), enquanto que em células p68 esgotado, o recrutamento para a mesma região estava reduzido por 4 vezes (

p Art 0,0008 ***). Um padrão semelhante de atenuação no recrutamento AR também foi visto em

KLK2

(0,25 vezes,

p

= 0,1593 Figura 4C) e

TMPRSS2

(1 dobra,

p Art 0,0016 ** Figura 4D) regiões promotoras em p68 alvo células siRNA esgotados após tratamento R1881, embora esta não atingiu significância e estimulação do andrógeno não apresentaram enriquecimento de recrutamento AR no

KLK2

promotor . No entanto, temos visto recrutamento do AR ao

KLK2

promotor em outros pontos do tempo (dados não mostrados). Curiosamente, um padrão semelhante na atenuação de β-catenina recrutamento de p68 sobre alvo knockdown siARN foi também observada. Aumento do recrutamento β-catenina tanto são i (0,6 vezes) e são III (0,8 vezes) regiões foi observado após estimulação de androgénio no controle (NS) células de ARNsi transfectados em comparação com células não tratadas (Figura 4E e 4F, respectivamente), como esperado . No entanto, em células p68 empobrecido, recrutamento β-catenina foi significativamente atenuada para níveis abaixo de controlo (SN) de ARNsi em ambas as regiões (1,1 vezes,

P

0,0023 ** e 1,3 vezes, p 0,0011 ** respectivamente). Um padrão semelhante de β-catenina de-recrutamento foi repetido no

KLK2

e

TMPRSS2

promotor em células p68 empobrecido (1,25 vezes,

p Art 0,0003 ** * Figura 4G, e uma dobra,

p Art 0,0005 *** Figura 4H respectivamente). Embora seja de notar que, em contraste com o recrutamento AR, um aumento no recrutamento β-catenina (1,75 vezes) é visto no

KLK2 e região promotor nesta altura andrógeno. Nós relataram uma diminuição na AR ARNm e os níveis de proteína p68 após a depleção de células LNCaP anteriormente [21], apoiando a noção de que as funções de p68 como um co-activador de AR. Por conseguinte, uma redução no recrutamento de AR para as regiões promotoras dos genes que respondem a androgénios em células p68 empobrecido seria esperado como o próprio AR é um gene que respondem a androgénios. No entanto, em p68 células empobrecido, encontramos recrutamento β-catenina reduzida a níveis mais baixos do que as células não tratadas em todas as regiões promotoras avaliados (semelhantes aos níveis de IgG). Sugerindo interacção directa de p68 pode ser necessária para facilitar o carregamento de β-catenina para regiões transcricionalmente activos de genes que respondem a androgénios. Esses dados enfatizam a importância da função do p68 no recrutamento do co-ativador de β-catenina e AR para as regiões promotoras de genes que respondem a androgénios.

níveis de expressão de mRNA de p68 A. e β-catenina B. no controlo (NS) e células LNCaP transfectadas com ARNsi de p68 (+/- R1881 10 nM, 16 horas). dados QPCR foi normalizada para níveis de GAPDH e dobre mudança relativa calculada para controlar (NS) (-R1881) níveis de mRNA (definido como 1). A amostra independente

t

teste foi utilizado para comparar as diferenças nos níveis de expressão e mostrar importância. C. imagens cortadas de imuno-blot de lisados ​​a partir de células LNCaP tratadas com 10 nM R1881 (16 horas) e transfectadas com o controlo (SN) e ARNsi de p68. Blots sondados sequencialmente com β-catenina, p68 e anticorpos α-tubulina.

células LNCaP transfectadas com p68 ou de controlo (SN) de siRNA, tratadas com 10 nM de R1881 durante 90 minutos, e imunoprecipitados com AR ABC D. ou β-catenina E. F. G. H. anticorpos (incluindo um anticorpo de controlo de IgG). material recuperado foi processado por ensaio chip e recrutamento para

PSA Quais são I (A E), SÃO III (B F),

KLK2

(C G)

TMPRSS2

(D H) regiões promotoras avaliada em relação ao ponto de tempo 0 minutos. depleção de p68 em células LNCaP mostraram redução AR β-catenina recrutamento após o tratamento com 10 nM de R1881 durante 90 minutos para todas as regiões avaliadas em comparação com células de controlo (SN) de ARNip. Os resultados apresentados representam n = 3 experiências independentes (+/- SD). A amostra independente

t

teste foi utilizado para comparar as diferenças nos níveis de expressão e mostrou significância.

p68 e β-catenina aditiva aumentar a atividade transcricional do receptor andrógeno genes regulados

Dado que p68 e β-catenina em células de interagir APC e p68 facilita o recrutamento de β-catenina para androgénio promotores de genes responsivos. A seguir, escolheram para investigar o efeito combinado de co-expressão de p68 e β-catenina sobre a actividade transcricional do AR, utilizando ensaios de luciferase repórter dependentes de androgénio em células COS-7. O p AR-mediada (ARE)

3 Luc repórter foi robusta estimularam 2 vezes pela AR em cima R1881 (10 nM) de tratamento do andrógeno (Figura 5, compare luz cinzenta bar + R1881 e barra cinza escuro -R1881). A sobre-expressão de β-catenina demonstrou p negligenciável (ARE)

3 actividade repórter Luc na presença ou ausência de R1881 demonstrando que β-catenina não afecta directamente P (ARE)

3 actividade repórter Luc na ausência da AR. No entanto, a co-expressão de AR e β-catenina demonstrou um aumento de 8 vezes em p (ARE)

3 actividade repórter Luc por tratamento R1881, confirmando β-catenina como co-activador do AR consistentes com as descobertas anteriores [28 ]. Da mesma forma, a co-expressão de AR e de p68 mostrou um aumento de 5 vezes em p (ARE)

3 actividade a seguir ao tratamento repórter Luc R1881, confirmando também de p68 como um co-activador do AR consistente com os resultados anteriores. (Tem sido demonstrado N.B. p68 a não afectar P (ARE) actividade repórter

3 Luc directamente na ausência de ar [21]). No entanto, a co-expressão de AR, β-catenina e construções de p68 demonstrou um significativo de 18 vezes (

P 0,0011

**

)

aumentar em p (ARE)

3 repórter Luc actividade após tratamento R1881, 10 vezes mais elevada do que RA e β-catenina de co-expressão, demonstrando p68 tem um efeito aditivo na actividade de transcrição significativa AR e β-catenina. Isto também foi observado com outro androgénio regulada

PSA

promotor repórter de luciferase (P (PSA) Luc), em que a co-expressão de AR, β-catenina e construções de p68 mostrou uma significativa 8 vezes (

p

0,0057 **) aumento da atividade repórter, 5 vezes maior do que AR e β-catenina co-expressão, confirmando o efeito aditivo de p68 em β-catenina e AR atividade transcricional (ver informações de apoio, figura S2). p68 foi avaliado para formar heterodímeros com o p72 helicase altamente homóloga (DdX17), e co-activate β-catenina a expressão do gene mediada anteriormente [23]. Descobrimos que a co-transfecção de AR, β-catenina e construções de p72 não tem um efeito aditivo significativa em p (ARE)

3 actividade repórter Luc em comparação com a co-transfecção de AR, β-catenina e construções de p68 (ver informações de apoio, Figura S3

p

= 0,3646). Isto é semelhante a um relatório anterior que encontrou p72 não foi capaz de aumentar a actividade transcricional do AR de p (ARE)

3 Luc repórter [21], e sugere uma especificidade para p68 na activação transcricional do AR em CaP. Colectivamente, estes dados sugerem β-catenina e p68 podem trabalhar juntos como co-activadores para melhorar AR transcrição regulada.

COS-7 células transfectadas transitoriamente em triplicado com p (ARE)

repórter 3Luc e PCMV- β-galactosidase plasmídeos em conjunto com vectores de expressão de mamíferos para a AR, β-catenina e p68 (+/- 10 nM R1881). A actividade da luciferase foi corrigida para a actividade β-galactosidase correspondente para dar actividade relativa. A gama de níveis de plasmídeo (+ e ++) corresponde a 50 e 100 ng, respectivamente. Os dados apresentados em relação à actividade de AR sozinho (-R1881) (definido como 1), e representativa de, pelo menos, n = 3 experiências de ensaio de luciferase (+/- SE). A amostra independente

t

teste foi utilizado para comparar as diferenças nos níveis de expressão e mostrou significância.

Discussão

Neste estudo, descrevemos uma interação funcional entre p68 , β-catenina e a AR no núcleo das células APC. A AR tem sido demonstrado para sinalizar através da via Wnt /β-catenina em CaP como uma adaptação a níveis de castração de androgénios [12], e β-catenina é conhecido para interagir com outros co-activadores do ar [32]. Aqui nós apresentamos imunoprecipitação, Chip depleção de p68 e

PSA

dados repórter da luciferase para confirmar uma interação entre p68, β-catenina e AR em células APC. Inicialmente confirmou uma directo

in-vitro de p68

-β-catenina interacção através de transfecção transiente de construções para a linha celular COS-AR negativos 7 (o que não era dependente de androgénio). No entanto, após nova investigação, descobrimos sob condições endógenas a interacção de p68-β-catenina foi facilitada na presença de androgénios na linha celular LNCaP APC, mas, inversamente, no refractário a hormonas (LNCaP-AI) derivados desta linha celular (representativos de o tipo de doença CRPCa), a interacção foi facilitada na ausência de androgénios. Isso é semelhante a uma constatação de aumento da formação de complexos AR endógeno /β-catenina em uma castração resistente CaP xenotransplantes rato modelo, onde foi detectada nenhuma interação entre AR e β-catenina na presença de andrógenos [10]. Isto pode sugerir um mecanismo pelo qual p68 adaptado e β-catenina co-activadores co-operativamente manter a actividade transcricional do AR (e genes regulados de androgénio), facilitando a sobrevivência de células do (CRPCa) Tipo de doença de castração-resistente. No entanto, mais trabalho é necessário para fundamentar o mecanismo molecular completo desta reivindicação. dados de imuno-blot confirmou a localização celular de p68 e β-catenina não foi influenciado pela hormona (encontramos p68 e β-catenina nos núcleos de células CaP tanto na presença como na ausência de androgénios), e

PSA

os dados de luciferase repórter mostraram co-transfecção de p68 e construções β-catenina teve um efeito aditivo sobre a actividade de transcrição de AR na presença de androgénios. Estes dados sugerem que p68 e β-catenina trabalhar juntos como co-activadores para melhorar aditiva a atividade transcricional do AR, que, curiosamente, pode ter implicações na progressão da doença tipo CRPCa.

Nós também mostrou usando knockdown de expressão p68 por siRNA oligonucleotídeo combinada com chip, que p68 foi necessário para o recrutamento óptimo da AR e β-catenina ao promotor regiões de genes andrógeno regulado. estimulação androgênica recrutamento facilitada da AR para ambos são I e que sejam regiões do nível III da

PSA

promotor e siRNA

KLK2

e

TMPRSS2

regiões promotoras no controle (NS) células LNCaP transfectadas, que foi subsequentemente atenuadas em células p68 esgotado. O recrutamento β-catenina observado para as mesmas regiões promotoras de androgénio regulada foi reduzida em p68 empobrecido células LNCaP após tratamento androgénio, mas a níveis mais baixos do que as células não tratadas (semelhante ao controlo de IgG). Este é um achado interessante, pois sugere que uma redução no recrutamento de β-catenina com as regiões promotoras dos genes andrógeno regulamentada em p68 células empobrecido não é apenas uma consequência de menos AR disponíveis para recrutamento, e implica que a função p68 é necessária para carga β-catenina para regiões transcricionalmente regulados de genes que respondem a androgénios.

O papel da p68 em processamentos alternativos de mRNA é bem documentada (revisto em [19], [21], [33]). Temos anteriormente especulado que a p68 pode funcionar como um “adaptador” ou proteína “acoplamento”, que coordena os processos firmemente integradas de transcrição e o processamento do ARN, facilitando a diafonia entre a transcrição e processamento do RNA em genes AR-regulados, possivelmente através do controlo da taxa de iniciação da transcrição /alongamento de RNAP II [30]. RNAP II tem dois sítios de fosforilação fisiologicamente importantes na extremidade C-terminal, que são importantes para a transição da polimerase a partir de uma forma de iniciação da transcrição (fosforilação em Ser-5), para o estabelecimento da forma de complexo transcricional de alongamento (fosforilação de Ser-2) . No presente estudo, nós demonstramos utilizando extractos nucleares endógenos de células LNCaP APC, que p68 interage tanto com o processiva (fosforilação de Ser-2) e não-processiva (fosforilação de Ser-5) forma de RNAP II, na presença e ausência de andrógenos.