Abstract

RND3 /Rhoe é uma pequena GTPase Rho envolvidas na regulação de diferentes comportamentos celulares. A desregulação da RND3 tem sido associada a tumorigénese e metástase. cancros do pulmão são a principal causa de morte relacionada ao câncer no Ocidente e em todo o mundo. A expressão de RND3 e seu papel ectópica no cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) ainda precisam ser exploradas. Aqui, nós relatamos que RND3 foi regulada para baixo em três linhagens de células NSCLC: H358, H520 e A549. A infra-regulação de RND3 levou a hiper-ativação de Rho-quinase e de sinalização Notch. A reintrodução de RND3 ou inibição selectiva de sinalização Notch, mas não a sinalização de Rho cinase, bloqueou a proliferação de H358 e H520 células. Mecanicamente, Notch domínio intracelular (NICD) abundância de proteína em células H358 foi regulamentada pelo RND3 mediada degradação proteassoma NICD. RND3 regulada a proliferação de células H358 e H520 através de um Notch1 /NICD /Hes1 sinalização independente eixo de Rho Kinase

Citation:. Tang Y, Hu C, Yang H, Cao L, Li Y, Deng P, et al. (2014) RND3 Regula Lung Cancer Proliferação celular por meio de sinalização Notch. PLoS ONE 9 (11): e111897. doi: 10.1371 /journal.pone.0111897

editor: Jeremy J. W. Chen, do Instituto de Ciências Biomédicas, Taiwan

Recebido: 13 de junho de 2014; Aceito: 29 de setembro de 2014; Publicação: 05 de novembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Tang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Chave cite de Centro Nacional de Pesquisa Clincial para a doença respiratória, National Key Scientific Programa de Apoio à Tecnologia: Inovação Colaborativa de Pesquisa Clínica para a doença pulmonar obstrutiva crónica e cancro do pulmão, No. 2013BAI09B09. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer nos países desenvolvidos. Os principais tipos de cancro do pulmão são o carcinoma de células pequenas do pulmão (SCLC) e carcinoma do pulmão de células não pequenas (NSCLC). Apesar dos avanços na medicina atual, a sobrevida global em 5 anos dos pacientes diagnosticados com NSCLC é de aproximadamente 15%, o que indica que (1) nos falta uma maneira eficiente para evitar NSCLC; e que (2) nós não entendemos completamente NSCLC. A recorrência da malignidade e resistência à quimioterapia são dois principais limitações no tratamento dos cancros do pulmão. De interesse, várias malignidades que são resistentes à terapia têm sido intimamente associado com up-regulada sinalização Notch [1]. O papel da sinalização Notch em NSCLC é controversa. Alguns estudos relatam que Notch1 activo inibiu o crescimento de algumas células NSCLC [2], [3], enquanto um estudo mais recente mostrou que uma activação de mutação de Notch1 em aproximadamente 10% de NSCLC levou a um mau prognóstico em pacientes [4]. Portanto, uma investigação mais aprofundada da sinalização Notch em NSCLC é necessário entender esta doença e pode ser benéfica para o tratamento de NSCLC.

RND3, também conhecido como Rhoe, é uma pequena GTPase envolvida na regulação de uma ampla variedade de comportamentos de células, incluindo o citoesqueleto, a proliferação, a migração e a apoptose [5] – [9]. A função biológica de RND3 foi pela primeira vez identificado como um repressor ROCK1 que regula a dinâmica de actina [5]. Recentemente, estudos têm relatado a ampla função de RND3 no cancro e sistema de neurônios desenvolvimento. Curiosamente, RND3 é regulada negativamente em células de cancro diferentes, tais como células de cancro da mama [8], o carcinoma hepatocelular [10], carcinoma de células escamosas [11], as células de tumor de origem mesenquimal [12], etc. No entanto, estudos da expressão e função biológica de RND3 em NSCLC são muito limitados.

o papel da RND3 na regulação do ciclo celular foi relatada uma década atrás. a sobre-expressão forçada de RND3 inibe a proliferação celular e a entrada na fase S induzida por soro, independente de sinalização RhoA-ROCK, indicando que a sinalização complicada está envolvido na regulação do ciclo celular [13]. Uma publicação recente explorou uma relação muito interessante entre RND3 e sinalização Notch [7]. A supressão de RND3 resultou numa sobre-regulação de sinalização de Notch em ratinhos células ependimais, promovendo a proliferação nas células. mediada por ARNi RND3 regulação negativa em duas linhas celulares, MDA-MB-231 e HepG2, promoveu a proliferação de células, a progressão do ciclo celular e invasão. No entanto, o papel de RND3 em cancros do pulmão, especificamente no NSCLC, permanece obscura. Este estudo, pela primeira vez, descobre os papéis patogénicos de RND3 em NSCLC, incluindo o seguinte: 1) RND3 é regulada negativamente em A520, H358 e A549, linhas celulares de cancro de pulmão de três; 2) forçada de expressão RND3 em células A520 e A358 inibe a proliferação celular; 3) a proliferação celular RND3 mediada é regulada através da regulação de sinalização Notch via modificações pós-translacionais.

Materiais e Métodos

cultura celular e geração de linhas celulares estáveis ​​

H358 (ATCC, CRL-5807), H520 (ATCC, HTB-182) e A549 (ATCC, CCL-185) As células foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Life Technologies, Cat # 11875-085) mais soro fetal bovino a 10% (vida Technologies, Cat # 16000-044) e 1% de penicilina-estreptomicina (Life Technologies, Cat # 15140-148). HBEC células foram cultivadas em meio isento de soro queratinócitos (Life Technologies, Cat # 17005-042) com extracto de pituitária bovina (Life Technologies, Cat # 13028-014) e EGF humano recombinante (Life Technologies, Cat # PHG0311).

cDNA RND3 foi subclonado no vetor de lentivírus pWPI-polio-eGFP. 293 t (Invitrogen, Carlsbad, CA), as células foram transfectadas com o vector lentiviral expressando RND3 e dois vectores auxiliares, PMD2 e psPAX2, para produzir lentivírus. As células H358 e H520 foram depois infectadas com o vírus a uma MOI de 10. A eficiência da infecção foi verificada por expressão da GFP por microscopia fluorescente. As células infectadas foram seleccionadas por puromicina (2 pg /ml). Um único clone foi escolhido para produzir linhas celulares estáveis, H358-H520 e RND3-RND3.

Para as experiências de medição do número de células, as células foram sincronizadas durante 12 h e 10

5 células de cada grupo foram cultivados em meio de crescimento. O número de células foi contado a cada 24 h durante um total de 5 dias.

imunotransferência

As amostras de proteínas para análise de Western blot foram extraídos por tampão RIPA (Thermo Scientific, Cat # 89900) mais uma protease inibidores de cocktail inibidor (Roche, Cat # 11836153001) e fosfatase (NaF 50 mM, Na 2 mM de

3VO

4, pirofosfato de sódio a 4 mM). Os anticorpos comercialmente disponíveis eram provenientes das seguintes fontes: MYPT1 (2634 s), fosfo-T853 MYPT1 (4563 S) e PDK1 (3062) a partir de Cell Signaling Technology (MA, EUA); MLC2 (PA5-17624) e fosfo-Ser20 MLC (PA5-17727) da Thermo Scientific Pierce (IL, EUA); ROCK1 (sc-5560) e RND3 (SC-53874) a partir de Santa Cruz Biotechnology (CA, EUA). HES1 (ab71559) e Notch1 (ab27526) eram de Abcam (MA, EUA). carga de proteína correspondente foi verificada por meio da intensidade de um GAPDH (sc20357, Santa Cruz, CA) blot.

extracção de ARNm e qRT-PCR

O ARN total foi extraído por reagente de Trizol (Life Technologies, 15596-026). qRT-PCR foi realizada utilizando um método de SYBR verde com um sistema tampão de MasterMix. As sequências de iniciadores foram como se segue: RND3: CTATGACCAGGGGGCAAATA /TCTTCGCTTTGTCCTTTCGT; Jag-1: CTATGATGAGGGGGATGCT /CGTCCATTCAGGCACTGG; Jag-2: TGGGATGCCTGGCACA /CCGGCAGATGCAGGA; Dll-1: GAGGGAGGCCTCGTGGA /AGACCCGAAGTGCCTTTGTA; Dll-4: GCATTGTTTACATTGCATCCTG /GCAAACCCCAGCAAGAGAC; Notch1: CACTGTGGGCGGGTCC /GTTGTATTGGTTCGGCACCAT; Hes1: AGGCGGACATTCTGGAAATG /CGGTACTTCCCCAGCACACTT; GAPDH:. GAGTCAACGGATTTGGTCGT /TTGATTTTGGAGGGATCTCG

incorporação de BrdU ensaio

As células foram sincronizadas e, em seguida, cultivadas em meio de crescimento durante 12 h seguido por tratamento com BrdU (bromodesoxiuridina) durante 30 min antes da colheita. O anticorpo anti-BrdU (rato, BD, 552598, 1:1000) foi incubada a 4 ° C durante 16 h, e o anticorpo anti-IgG de ratinho de cabra conjugado com secundário Alexa Fluor 594 (1:200) foi adquirido de Invitrogen ( A11032). O tempo de incubação foi de 1 h à temperatura ambiente, protegida da luz. Os núcleos foram visualizadas por DAPI (4 ‘, 6’diamidino-2-fenilindol) (Vectashield, Vector Laboratories, Inc., H1000) e as imagens foram obtidas por microscopia de fluorescência (DMI 4000B, Leica, Mannheim, Alemanha).

A análise estatística

Os dados são expressos como média ± SD Em comparações múltiplas de grupo, ANOVA de uma via seguido pelo método de Student-Newman-Keuls. Nas comparações 2 grupos,

foi utilizado t

teste de um estudante não pareado, de duas caudas. Todas as análises foram conduzidas por 11,0 SigmaPlot (Systat, San Jose, CA, EUA). Um valor de P 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

RND3 é regulada para baixo juntamente com o aumento da atividade Notch e Rho Kinase em H358 e H520 células

Dois humano. linhas celulares de NSCLC, H358 e H520, foram utilizados neste estudo. células epiteliais brônquicas humanas (HBEC) foram utilizados como um controlo normal. Detectamos a expressão RND3 em ambos os níveis de mRNA e proteína. Em comparação com células HBEC, RND3 expressão foi significativamente regulada negativamente em células H358 e H520 (Fig. 1A-C). RND3 foi pela primeira vez identificado como um inibidor endógeno ROCK1 que regula o citoesqueleto. Aqui, nós investigamos Rho cinase sinalização por sondagem dois substratos cinase Rho bem caracterizadas nos três linhas de células. Como mostrado na Fig. 1D-G, a fosforilação da fosfatase da miosina, um alvo subunidade (MYPT1) e leve da miosina de cadeia 2 (MCl2) foi significativamente aumentada em H358 e H520 células, indicando uma actividade de Rho-cinase-hiper activado. No entanto, o nível de expressão ROCK1 não foi diferente entre as linhas celulares (Fig. 1H). Um potente activador de Rho-cinase 1 [14], PDK1 que podia competir com RND3 para se ligar a ROCK1, o nível de expressão também não foi alterada na H358 e H520 células em comparação com as células HEBC (Fig. S1). De interesse, em adição à sinalização Rho cinase regulada para cima, também observamos sinalização Notch-hiper activado em H520 e H358, em comparação com células HBEC (Fig. 1I, 1J), como é evidenciado pela acumulação da forma activa de Notch1 , Notch domínio intracelular (NICD). Tanto a Rho-cinase e Notch têm sido extensivamente estudadas em diferentes células e modelos genéticos. O papel biológico de ativação destas duas vias de sinalização em NSCLC, eo relacionamento entre RND3 down-regulação e NICD-regulação em cancros do pulmão ainda não foi caracterizado.

(A) mRNA RND3 detectado por qRT- a PCR é regulada negativamente em H358 e H520 em comparação com HBEC. Os níveis de expressão de proteína (B) RND3 em células por Western Blot. (C) quantificação Densitometria de intensidade da banda ocidental em B. (D), (F), (H) (I), uma transferência de Western para detectar MYPT1 fosforilada, fosforilado MLC2, ROCK1 e NiCd células. (E), (L) (J) quantificação Densitometria da intensidade da banda ocidental mostrou-regulação da actividade da Rho-quinase expressão NICD em H358 e H520 células em comparação com HBEC. As transferências de Western foram quantificadas a partir de três repetições experimentais independentes. células positivas para BrdU foram quantificados a partir de 8 imagens tiradas a partir de quatro slides. Os dados representam médias ± DP

A inibição da proliferação por superexpressão estável de RND3 em H520 e H358

Para investigar o papel ectópica de expressão RND3 reduzida em células H520 e H358, geramos células linhas que expressam estavelmente RND3-GFP utilizando um sistema de lentivírus. RND3 expressão foi verificada por meio de ambos os anticorpos anti-RND3 (detecta endógeno e exógeno RND3) e anti-GFP (detecta exógeno RND3 apenas) anticorpos (Fig. 2A e 2C). H358-RND3 e H520-RND3 estavelmente expressa RND3 em 2,7 vezes e 4,4 vezes maior em comparação com células H358 e H520, respectivamente (Fig. 2B e 2D). Em seguida, investigou-se a taxa de proliferação das duas linhas celulares estáveis ​​utilizando um ensaio de incorporação de BrdU. As células foram sincronizadas por privação de soro e, em seguida, cultivadas em meio de crescimento durante 12 h, seguido por tratamento com BrdU durante 30 min antes da colheita. As células foram transferidas para lâminas de Cytospin para coloração e de imagem. A taxa de proliferação indicado por coloração BrdU positiva foi significativamente diminuída em células H358-H358 RND3 em comparação com células (Fig. 2E e 2F). O mesmo resultado foi observado em células H520-H520 RND3 em comparação com células (Fig. 2G e 2H). Nós também contado o rácio de BrdU + célula para GFP + células, como mostrado na Fig. S2. A proporção era significativamente maior para o H358 (50%) e H520 (41%) em comparação com células (11%) as células, respectivamente (Fig. S2A e S2B) H358-RND3 (15%) e H520-RND3. Além disso, 1 × 10

5 células de cada grupo foram sincronizadas e em seguida cultivadas. O número de células foi contado em diferentes pontos de tempo (dia 0, 1, 2, 3, 4 e 5). Observou-se um aumento significativo no número de células em células H358 e H520. No entanto, este aumento foi marcadamente atenuada em ambos H358-H520 RND3 e células-RND3 iniciada no dia 2 (Fig. 2I e 2J). Tomados em conjunto, forçado a sobre-expressão de RND3 em H358 e H520 poderia reduzir a taxa de proliferação destas células. A inibição do crescimento de células tumorais é uma da maior parte das estratégias de importantes no tratamento de cancro. O papel de RND3 na inibição da proliferação destas duas CPNPC torna um alvo possível para o tratamento do cancro

(A) (B) A geração de uma linha celular H358 que expressam estavelmente RND3 GFP. A expressão RND3 foi verificada por meio de ambos os anticorpos RND3 e GFP. (Acampamento; (D) A geração de uma linha celular H358 que expressam estavelmente RND3 GFP. A expressão RND3 foi verificada por meio de ambos os anticorpos RND3 e GFP. (E) (F) H358-RND3 tem uma taxa de proliferação mais baixa em comparação com células H358 como detectado por incorporação de BrdU. (L) (H) H520-RND3 tem uma taxa de proliferação mais baixa em comparação com células H520 como detectado por incorporação de BrdU. (I) (J) O número de células foi quantificada no ponto de tempo diferente. Uma média de três amostras em cada ponto de tempo foi apresentada nesta figura. As transferências de Western foram quantificadas a partir de três repetições experimentais independentes. Os dados representam médias ± SD

Retoma RND3 embotada Rho-quinase e de sinalização Notch em H520 e H358 células

Nós apresentaram maiores atividades Rho-quinase e expressão NICD em conjunto com um nível de expressão RND3 reduzida as células H520 e H358, em comparação com as células epiteliais normais do pulmão, HBEC (Fig. 1). Nós próxima exploraram se existe uma correlação entre menor expressão RND3 e superior Rho-quinase e expressão NICD. A expressão NICD foi regulada para baixo mais do que 3,5 vezes em células H520-H520 RND3 em comparação com células (Fig. 3A e 3B). A leve de miosina de cadeia fosfatase fosforilado, uma subunidade (pMYPT1) e da cadeia leve da miosina (pMLC2) foram regulados negativamente 2.5- e 1,8 vezes, respectivamente, em células H520-H520 RND3 em comparação com células (Fig. 3C e 3D). Nas células H358, observou-se a mesma tendência de expressão NICD ea atividade Rho Kinase quando RND3 foi sobre-expresso. A expressão NICD foi reduzida 2,9 vezes em células H358-RND3 comparação com H358 células (Fig. 3E e 3F), enquanto pMYPT1 (2,46 vezes) e pMLC2 (1,83 vezes) também foram reduzidos nas células H358-RND3 comparação com H358 células (Fig. 3G e 3H). Além disso, a sobre-expressão de RND3 em H358 e H520 células não alterou a expressão de ligando de entalhe, como mostrado na Fig. S3. Expressão do ser humano Jagged-1 (Jag-1), Jagged-2, (Jag-2), Delta-like-1 (DLL-1) e mRNA foram medidos por qRT-PCR Delta-like-4 (DLL-4) . Não há nenhuma alteração estatisticamente significativa na expressão dessas mRNA em H358 e H520 comparou o H358-RND3 e H520-RND3, respectivamente (Fig. S3A e S3B). Estes resultados sugerem que RND3 poderia regular tanto Rho-quinase e NICD sinalização em H358 e H520 células. RND3 é um regulador de inibir a ativação Rho-quinase e expressão NICD no CPNPC. RND3 modulação sinalização Notch mediada não fez através de regulação da expressão do ligando Notch

(A) (B) Diminuição da expressão NICD em células H520-RND3 comparação com H520 células. (Acampamento; (D) A diminuição da actividade de Rho quinase em células H520-RND3 em comparação com células H520 detectados por anticorpos específicos para pMYPT1 e pMLC2. (E) (F) Redução da expressão NICD em células H358-RND3 comparação com H358 células. (L) (H) A diminuição da actividade de Rho quinase em células H358-H358 RND3 em comparação com células detectadas por anticorpos específicos para pMYPT1 e pMLC2. As transferências de Western foram quantificadas a partir de três repetições experimentais independentes. Os dados representam médias ± SD

A inibição da sinalização Notch impediu a proliferação de H520 e H358 células

Nós demonstramos que a superexpressão forçada de RND3 por lentivírus, tanto H520 e H358 células 1) inibiu a proliferação (Fig. 2) e 2) bloqueou a activação de Rho-quinase e de sinalização Notch /NiCd. Para determinar qual o caminho de sinalização pode contribuir para a taxa de proliferação, inibidores químicos foram aplicados às células. Se Fasudil, a Rho Kinase inibidor [15], [16], pode afetar a taxa de proliferação celular em H358 e H520 células? Os nossos dados mostraram que a inibição da actividade de Rho-cinase por Fasudil não alterou a proliferação de células H520 e H358 (Fig. S4). No entanto, o composto E [17], um inibidor específico de sinalização Notch, pode atenuar a proliferação em ambas as linhas celulares (Fig. 4). O tratamento com o composto E reduziu a proliferação de H358 em 40% em comparação com o grupo de controlo tratado DSMO como indicado por um ensaio de incorporação de BrdU (fig. 4A e 4B). A taxa de proliferação celular diminuiu para apenas 32% do controlo no grupo H520 (Fig. 4C e 4D). Para testar a possível citotoxicidade de composto E, avaliou-se a morte celular por coloração com Azul de Tripano. Na concentração de 5 composto nM E, não se detectou uma morte celular significativa em relação ao grupo sem tratamento em ambos H358 e H520 células (Fig. S6, imagem 2 e 6 em comparação com 1 e 5, respectivamente), sugerindo que a citotoxicidade Composto de E em todas as três linhas de células a esta concentração foi mínima. Nós aumentou ainda mais a concentração de composto E para 50 nM e 500 nM, e descobriu que a morte celular apenas menos de 5% foi observada em 50 grupo nM (Fig S6, imagem 3, 7 e 11.), Ao passo que a morte celular massiva ( 50%) foi causada por doses elevadas o composto e (500 nM, Fig. S6, quadro 4, 8 e 12). O experimento usando inibidores da sinalização seletivos sugeriu que RND3 infra-regulação mediada NICD-regulação pode desempenhar um papel mais importante na proliferação de H358 e H520 células e que essa proliferação não é Rho quinase dependente.

(A) (B) O pedido de blocos o composto E da proliferação de células H358 tal como detectado por um ensaio de incorporação de BrdU. As células foram tratadas com o composto E na concentração final de 5 nM e sincronizado pela depleção de soro, seguido por crescimento em meio durante 12 horas. Em seguida, as células foram tratadas com BrdU durante 30 minutos antes de serem colhidas para análise. (Acampamento; (D) A aplicação de blocos de composto E da proliferação de células H520 tal como detectado por um ensaio de incorporação de BrdU. As células foram tratadas com o composto E na concentração final de 5 nM e sincronizado pela depleção de soro, seguido por crescimento em meio durante 12 horas. Em seguida, as células foram tratadas com BrdU durante 30 minutos antes de serem colhidas para análise. células positivas para BrdU foram quantificados a partir de 8 imagens tiradas a partir de quatro slides. Os dados representam significa ± S.D.

RND3 regula a proliferação através da modulação do eixo sinalização NICD /Hes1 em H520 e H358 células

sinalização Notch é um importante regulador do ciclo celular. Bloqueio de sinalização Notch inibe o crescimento de células diferentes [18] – [20]. Visivelmente, um estudo recente realizado por Chang et al. grupo mostrou que NICD regula a proliferação das células da epiderme por meio de sobre-regulação de HES1 em ratinhos knockout RND3 [21]. Por isso, investigamos a expressão Hes1 em nossas células. HES1 foi regulado para cima de 5 vezes em H520 e H358 em comparação com as células HBEC (Fig. 5A e 5B). Consistente com uma taxa de proliferação atenuada observada em células H358-RND3 H520-RND3 e (Fig. 3E-3H), expressão HES1 foi também sub-regulada por duas vezes e 2,5 vezes nestas duas linhas de células em comparação com H520 e H358, ., respectivamente (Fig. 5C-5F), sugerindo que diminui NICD mediada por inibição na taxa de proliferação de H520-H358 RND3 e células-RND3 pode ser regulada através da expressão HES1-baixo

(a) (B) HES1 foi regulado para cima em H520 e H358 células em comparação com as células HBEC. expressão (C-F) HES1 diminuiu quando RND3 foi sobre-expresso de forma estável em células H358 e H520. (L) (H) a sobre-expressão transitória em células de RND3 H358 NiCd e HES1 regulada de um modo dependente da dose. (I) (J) A inibição da actividade do proteosoma pelo MG132 (concentração final de 15? M) aboliu a dosagem RND3 dependente NICD sub-regulação H358 células. As transferências de Western foram quantificadas a partir de três repetições experimentais independentes. Os dados representam a média ± S.D. *

p Art 0,05 em relação ao controle (grupo 0); #

p Art 0,05 em relação ao grupo 1; $

p Art 0,05 em relação ao grupo 3. Os dados representam médias ± DP

Para definir a relação entre RND3 e NICD, foi realizada uma expressão dependente dosagem de RND3 em H358 células . -myc RND3 foi transientemente transfectada para células H358 em diferentes doses (0, 1 pg, 3 pg, 5 ug). Em seguida, examinámos a expressão de NiCd e HES1 por western blot. Com o aumento da expressão RND3, o NICD e os níveis de expressão HES1 diminuiu (Fig. 5G e 5H). Não surpreendentemente, Hes1 mRNA, um gene alvo NICD, alterado em conformidade (Fig. S5 preenchido barra preta). No entanto, não foi observada qualquer alteração no mRNA Notch1 (Fig. S5 bar vazio), apesar da diminuição significativa no nível de proteína devido à RND3 superexpressão, sugerindo que RND3 NICD regulamentada em nível de pós-tradução, porque o nível de NICD é regulada pela proteassoma degradação [22]. Nós inibiu a atividade do proteassoma usando MG132 e descobriu que a dosagem RND3 degradação NICD dependente foi completamente bloqueada (Fig. 5I e 5J), sugerindo um papel regulador pós-tradução de RND3 na degradação NICD.

RND3 regula a proliferação através de Notch1 sinalização em células de adenocarcinoma de pulmão

linha celular

H358 foi derivadas de carcinoma de pulmão broncoalveolar e linha celular H520 foi obtido a partir de pulmão squamouse carcinoma de células. No entanto, o principal subtipo de NSCLC foi adenocarcinoma de pulmão. Portanto, confirmou nosso estudo em células de adenocarcinoma de pulmão, uma A549, conforme mostrado na Fig. 6. RND3 foi regulada para baixo juntamente com a sobre-regulada de Rho-quinase e de Notch1 de sinalização em células A549 em comparação com células HBEC (Fig. 6A e 6B). Nós quantificou o aumento da regulação vezes em mudança em dois sinalização. Os resultados foram apresentados na Fig. 6C. Rho Kinase sinalização foram up-regulada por quase 4 vezes evidenciado pelo nível pMYPT1; a sinalização Notch1 foram up-regulada por 5 vezes evidenciado pelo nível NICD. A inibição da sinalização por Notch1 Composto E bloqueou a proliferação de células A549 (Fig. 6D e 6E). A citotoxicidade do composto E em células A549 também foi avaliada por coloração com azul de Tripano. Como mostrado na Fig. S6 (foto 9 a 12), a 5 nM Composto E não causou a morte significativa em relação ao estado inicial em células A549. Mecanicamente, RND3 regulada a proliferação celular através de sinalização NICD /Hes1. A sobre-expressão RND3 suprimiu a expressão de NiCd e HES1 de um modo dependente de dosagem em células A549 (Fig. 6F e 6G). As nossas descobertas em células A549 foram consistentes com os resultados de H358 e H520 células, sugerindo que a sinalização RND3-NICD HES1 era geralmente um mecanismo molecular para regular o crescimento de células NSCLC. Juntos, maior expressão de NiCd e HES1 e inferior RND3 expressão foram observados em H520, H358 e A549 células em comparação com as células HBEC. Restabelecimento do RND3 inibiu a expressão de NiCd e HES1, o que resultou em taxas de proliferação diminuíram de H520 e H358 células. O bloqueio da sinalização de Notch1 inibiu a proliferação de células em H358, H520 e células A549. RND3 regulada a abundância NICD através levando a sua degradação proteossómica no CPNPC.

(A) mRNA RND3 detectado por qRT-PCR é regulada para baixo em relação ao A459 HBEC. (B) (C) uma transferência de Western para detectar MYPT1 fosforilada, NiCd células. (D) (E) O pedido de blocos o composto E a proliferação de células A459, conforme detectado por um ensaio de incorporação de BrdU. As células foram tratadas com o composto E na concentração final de 5 nM e sincronizado pela depleção de soro, seguido por crescimento em meio durante 12 horas. Em seguida, as células foram tratadas com BrdU durante 30 minutos antes de serem colhidas para análise. (F) (L) a sobre-expressão transitória em células de RND3 A549 NiCd e HES1 regulada de um modo dependente da dose. Os dados representam a média ± S.D. *

p Art 0,05 em relação ao controle (grupo 0); #

p Art 0,05 em relação ao grupo 1; $

p Art 0,05 em relação ao grupo 3. Os dados representam médias ± DP

Discussão

RND3 pertence aos Ras superfamília e é uma pequena GTPase Rho que regula uma variedade de funções celulares e doenças. Foi inicialmente identificada como um inibidor ROCK1 endógena. RND3 se liga a ROCK1 para inibir a sinalização a jusante [5]. Recentemente, estudos têm enfatizado o papel crítico da RND3 em diferentes tipos de câncer. RND3 é regulada negativamente em muitos cancros, tais como carcinoma hepatocelular [10], [23], as células tumorais mesenquimais [12], e câncer de próstata [12]. No entanto, em alguns tipos de cancro, RND3 é sobre-regulada, tal como em tumores pancreáticos [24], [25], as linhas celulares de cancro do cólon [25] e de melanomas [26]. Estas diferenças sugerem que RND3 tem funções específicas em diferentes linhagens de células. Curiosamente, tal como um gene altamente relacionadas com tumores, a investigação sobre o papel da RND3 em NSCLC é extremamente deficiente. Dois estudos mostraram que RND3 sobre-expressão pode ser associado com um prognóstico desfavorável em doentes com NSCLC [27], [28], enquanto o papel exacto de RND3 em NSCLC não foi ainda investigado. Aqui, relatamos o RND3 que é sub-regulada em H358, H520 e células A549, e este sub-regulação promove o crescimento destas duas linhas de células e é dependente da sinalização de Notch-regulada

Um dos. a maioria das estratégias importantes para a cura do câncer é a inibição da proliferação de células tumorais descontrolada. No entanto, a falta de inibição específica é o principal problema enfrentado na clínica. Compreendendo o mecanismo de regulação única do ciclo celular em células cancerosas favoreceria a descoberta de novos fármacos e novos tratamentos para o cancro. RND3 superexpressão em fibroblastos inibe a entrada de fase S, bloqueando a expressão da ciclina D1 em nível pós-transcricional [13]. No mesmo estudo, a sobre-expressão de ciclina D1 não resgatar paragem do ciclo celular mediada por RND3, sugerindo que outros jogadores estão envolvidos regulação do ciclo celular. Em células de cancro da próstata, a expressão RND3 induz as células paradas em G 2 /M, em vez de no G1, como pode ser visto em fibroblastos, sugerindo que o RND3 tem a capacidade para regular a progressão do ciclo celular em fases diferentes [29]. Os nossos dados demonstraram que a sinalização Notch /HES1 é fundamental no crescimento RND3 deficiência-mediada de H358, H520 e células A549. Esta constatação alarga a compreensão da função do RND3 na regulação do ciclo celular de cancro e também fornece um alvo potencial para o tratamento de NSCLC.

RND3 expressão está correlacionada com a migração de células em desenvolvimento e doenças. Dois estudos recentes descobriram que RND3 regulamentada migração neuronal através de sinalização Rho quinase dependente [30], [31]. Enquanto isso, em cânceres, down-regulação da RND3 está intimamente associada com a invasão e metástase [10], [23], [32]. O mecanismo potencial pode também ser através de sinalização RhoA /ROCK1. Neste estudo, que mostrou que tanto NiCd e Rho cinase são activados em H358, H520 e A549 em comparação com células HBEC. Reintrodução de RND3 inibiu ambas as vias de sinalização. No entanto, a inibição única sinalização Notch impede a hiper-crescimento de H358 e H520 células; inibição Rho Kinase não. Mais estudos para investigar a regulação da tumorigênese, migração e apoptose de células tumorais em resposta à inibição Rho Kinase seria necessário e interessante.

Notch é um receptor transmembranar evolutivamente conservada envolvida no desenvolvimento e doenças. Após estimulação do ligando, o entalhe pode ser clivada por γ-secretase. A parte intracelular (NICD) pode translocar para o núcleo para iniciar a transcrição. A expressão forçada de Notch 1 inibiu o crescimento de células A549 em cultura [2]. No entanto, um estudo independente tem desafiado esta noção [33]. Mais recentemente, um mutante de activação Notch 1 foi encontrada em cerca de 10% de NSCLC, e as mutações conferido um pior prognóstico em pacientes [4]. Esta controvérsia sugere, pelo menos, que: 1) a função de Notch 1 em NSCLC é diversificada em diferentes células e diferentes estágios do câncer; 2) expressão de Notch1 devem ser considerados durante o tratamento de pacientes; 3) precisamos urgentemente para entender o papel de Notch1 em NSCLC. Neste estudo, os nossos dados indicam que a sinalização Notch é activada nas células H358 e H520, e esta activação dirigimos a proliferação destas células através de dois HES1. RND3 pôde reprimir H358, H520 e células A549 a proliferação antagonizando sinalização Notch de uma forma pós-translacional.

Um estudo recentemente publicado destacou que RND3 era um mediador a jusante da sinalização Notch em carcinomas de células escamosas (SCC) na pele epitélios [34]. Os autores sugeriram que o RND3 é um alvo transcricional de Notch1 activado, e depleção RND3 suprime sinalização Notch por mediar a translocação nuclear do NICD através de uma interacção com importinas. Em nosso estudo, descobrimos que RND3 superexpressão suprimida sinalização Notch, bloqueando a degradação NICD. Estas discrepâncias podem ser porque 1) uma linha celular diferente foi utilizada para o estudo; 2) mais provável, estes dois tipos de regulação co-existir em células, funcionando como um mecanismo de feedback para controlar com precisão a sinalização Notch.

A expressão de RND3 expressa foi precisamente regulamentados em tecidos tumorais humanas. RND3 foi sobre-regulada no cancro colorectal em comparação com o tecido colorectal humano normal [35]. Enquanto a regulação negativa da RND3 foi a observação no tecido tumoral fígado humano e esofágica tecidos de carcinoma espinocelular humanos em comparação com os tecidos normais adjacentes, respectivamente [11], [36]. Embora o padrão de expressão diferente do RND3 foi encontrada em tumores diferentes no ser humano, a expressão RND3 estava intimamente relacionado com a proliferação de células de tumor, de células de migração /metástase e diagnóstico /prognóstico. Dado o fato de que RND3 foi regulada em células NSCLC e para baixo-regulação da RND3 promoveu a proliferação de células NSCLC, seria interessante e necessário para avaliar a expressão RND3 em amostras de tecido de câncer de pulmão humanos.

Em conjunto , somos o primeiro grupo de informar que RND3 é regulada em H358, H520 e células A549, resultando em uma hiper-ativação de Notch e sinalização Rho-quinase. Mecanicamente, RND3 regula a proliferação de H358, H520 e células A549 através do eixo sinalização NICD /Hes1.

Informações de Apoio

Figura S1.

Expressão de PDK1, um activador de Rho-cinase, permanece inalterada em células H358 e H520 em comparação com células HBEC. (B).