Abstract

Objectivo

Os microRNAs (miRNAs) expressão é alterado nas células cancerosas, e miRNAs poderia servir como biomarcador de diagnóstico e prognóstico para pacientes com câncer. Este estudo foi desenhado para analisar circulando expressão miRNAs no derrame maligno pleural (MPE) e sua associação com a sobrevida dos pacientes no cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC).

Métodos

O derrame pleural de 184 pacientes com NSCLC e MPE foram recolhidos. Mirna microarray e bioinformática interpretação foram utilizados para avaliar os perfis de expressão miRNA em 10 pacientes com NSCLC com diferentes prognóstico de sobrevivência. Associações foram validadas em 184 pacientes (classificados aleatoriamente em formação e validação definido com número igual em cada grupo) usando RT-PCR quantitativo. escores de risco foram formuladas com base na assinatura de miRNAs expressão. Os dados clínicos, tais como a sobrevida do paciente, foram coletados para análise de correlação.

Resultados

Trinta e três miRNAs foram encontrados para ser alterado mais do que duas vezes por microarray em derrames malignos entre mais longo de sobrevivência e os grupos de mais curto de sobrevivência, e os níveis de cinco miRNAs (miRNA-93, miRNA-100, miRNA-134, miRNA-151 e miRNA-345) foram significativamente associados com a sobrevida global. Alta expressão de miR-100 e baixa expressão de miRNA-93, miRNA-134, miRNA-151 e miRNA-345 foram associados com pior sobrevida tanto na formação e coorte de validação. Os pacientes com escores de alto risco tiveram sobrevida global baixa comparado com os pacientes com baixa pontuação de risco. escore de risco foi um preditor independente de sobrevida do paciente.

Conclusões

padrões de expressão de miRNAs são sistematicamente alterados de MPE de paciente com NSCLC. Os cinco assinatura miRNA do derrame pode servir como um preditor para a sobrevida global dos pacientes com câncer de pulmão

Citation:. Wang T, Lv M, Shen S, Zhou S, Wang P, Chen Y, et al . (2012) Perfis MicroRNA de expressão livre de células em maligno efusão associados à sobrevida do paciente em Non-Small Cell Lung Cancer. PLoS ONE 7 (8): e43268. doi: 10.1371 /journal.pone.0043268

editor: Sai Yendamuri, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 18 de maio de 2012; Aceito: 18 de julho de 2012; Publicação: 24 de agosto de 2012

Direitos de autor: © Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo National Natural Science Foundation da China (81101552), a Fundação de Ciência Natural da província de Jiangsu (BK2011571), Fundo de Investigação especializada para o Programa de Doutorado da Educação Superior (20100091120002), e os Fundos investigação fundamental para as universidades Central (1118021418 e 1118021406). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) é uma das causas mais importantes de morte por câncer em todo o mundo. Quinze por cento dos pacientes com cancro do pulmão pode ter derrame pleural maligno (EMA) no momento do diagnóstico inicial e meia desenvolver derrame pleural em uma fase mais tardia da doença [1]. MPE é um sinal de mau prognóstico para pacientes com NSCLC. Tumor propagação via sobrevivência e proliferação das células tumorais em derrame pleural é uma importante via de metástase e uma causa frequente de morbilidade em NSCLC. Apesar dos avanços nas modalidades de tratamento, a sobrevida média é muito curto. O presente tratamento padrão parece ser evacuação segura máxima do fluido pleural seguida por quimioterapia intravenosa ou quimioterapia intrapleural [2] .No entanto, verificou-se que nem todos os pacientes foram beneficiadas a partir da adição de quimioterapia, especialmente em pacientes com o tempo de sobrevivência global curto . Assim, a avaliação de prognóstico do paciente é essencial para a escolha da melhor estratégia terapêutica. Hsu et al. mostrou que os níveis de biomarcador angiogênicas expressão foram significativamente correlacionados com a sobrevida dos pacientes e controle derrame pleural [3]. Além disso, estudos recentes de perfil molecular e genética pode identificar vários marcadores e assinaturas únicas como fatores de diagnóstico e prognóstico de NSCLC. Estas descobertas abriram possibilidades para o diagnóstico de câncer não-invasivo e previsão. Alguns dos resultados estão à beira de ser traduzido para o uso clínico.

Os microRNAs (miRNAs) são de 18 a 25 nucleótidos, moléculas de RNA não codificante que regulam a expressão de muitos genes. Desde a sua descoberta, miARNs foram encontrados para regular uma variedade de processos celulares, incluindo a apoptose, diferenciação e proliferação celular [4], [5]. expressões anormais de miRNAs específicos estão implicados na patogênese de vários cancros humanos, e de expressão miRNA perfil de tumores humanos identificou assinaturas associadas com o diagnóstico, estadiamento, progressão, prognóstico e resposta ao tratamento. O potencial de prognóstico de miARN foi demonstrada para a leucemia linfocítica crónica [6], o cancro do pulmão [7], [8], o cancro da mama [9], neuroblastomas e [10]. No cancro do pulmão, os níveis elevados de baixos níveis de deixá-7 foi relatado pré-miR-155 e para ser correlacionado com prognóstico pobre [11], enquanto que o miR-34a pode ser usado como um marcador de prognóstico de recaída em NSCLC cirurgicamente ressecado [12 ]. Recentemente, vários relatórios sugerem que miARNs circulantes livres de células são detectáveis ​​no soro /plasma e os níveis de miARN derivadas de tumor elevados nos pacientes com cancros do pulmão [13], [14], o que sugere que miARNs à base de sangue pode emergir como fontes revolucionárias de biomarcador para o diagnóstico e prognóstico do câncer de pulmão. No entanto, uma assinatura miRNA no MPE, que pode prever o resultado clínico em pacientes com NSCLC não tinha sido encontrado até agora.

Em nossos estudos anteriores, nós isolamos com sucesso ácido nucleico livre de células em derrames malignos e demonstrou que células -livre BIRC5 ARNm poderia ser utilizado como um biomarcador de diagnóstico potente para MPE [15]. Também descobrimos que o miR-24 e miR-30D foram diferencialmente expressos em efusões malignas e benignas, enquanto que o isento de células de miR-152 pode ser utilizado para prever a quimiossensibilidade ao docetaxel [16], [17]. Dado o potencial de prognóstico para miRNAs em câncer, o objetivo deste estudo foi determinar se o miRNA livre de células em derrame pleural poderia ser utilizado para prever o tempo de sobrevivência de pacientes com derrame pleural maligno secundário a NSCLC.

Resultados

Detecção de miRNAs derrame e bioinformática interpretação dos miRNAs funcionais

Todos os pacientes foram acompanhados até 16 de Setembro de 2011 ou à data da morte. Todos os 184 pacientes sobreviveram por uma média de 6 meses (intervalo: 1-33 meses). A proporção cumulativa global dos pacientes que sobrevivem aos 3 meses foi de 0,70, aos 6 meses foi de 0,45, e em 12 meses foi de 0,11.

Para detectar diferentes miRNAs entre o grupo de maior sobrevivência e grupo de curto sobrevivência, microarray foi desenvolvido em 10 pacientes. Como mostrado na Tabela 1, 5 pacientes no grupo de maior sobrevivência e 5 pacientes no grupo de curto sobrevivência foram combinava exatamente nas frequências de tipo histológico e estágio, enquanto a idade, tabagismo e gênero não foram significativamente diferentes entre os dois grupos. 113 miRNAs foram detectados nestes 10 pacientes por miRNA microarray (S1 Arquivo). Usando análise de comparação de classe, foram identificados 33 miRNAs independentes para ser diferencialmente expressos em dois grupos com alterações dobra 2 (Tabela S1). A trama vulcão forneceu mais informações sobre o significado e magnitude de alteração expressiva desses miRNAs selecionados (Figura S1), que foi útil para julgar os candidatos mais importantes para estudos de acompanhamento.

Anotação gene

David foi usado para interpretar o efeito biológico dos miRNAs filtrados por lote vulcão. De acordo com os resultados de exploração de dados, 31 gos foram classificadas com base destes alvos de miARN (Figura S2a). Outra análise funcional dos miRNAs por KEGG revelou que 9 vias de transdução de sinal foram mostrados para participar nos diferentes tempo de sobrevivência de pacientes com câncer de pulmão (Figura S2B). Estes resultados representam evidências da novela para o efeito regulador de miRNAs em câncer de pulmão através de genes-alvo e via de sinalização. Além disso, a rede de miRNA-mRNA análise miRNAs e mRNA integrado descrevendo as interações de miRNA e genes-alvo (Figura S3). Tomado estes bioinformática interpretações de miRNAs funcionais juntos, 5 miRNAs (miRNA-93, miRNA-100, miRNA-134, miRNA-151 e miRNA-345) foram selecionados para análise posterior.

associação entre a expressão de miRNAs na efusão e sobrevida do paciente

em seguida, testamos os efeitos preditivos desses cinco miRNAs na sobrevivência de câncer de pulmão entre os 184 pacientes, agrupados aleatoriamente em uma coorte de treinamento (n = 92) e uma coorte de validação (n = 92). As características destes doentes com NSCLC foram apresentados na Tabela 1. A partir da coorte de formação, os níveis de expressão elevada de efusão de miR-100 (média de 0,02) e baixos níveis de expressão de miR-134 (média de 0,50), o miR-345 (mediana , 0,09) miR-151 (mediana, 0,05) e miR-93 (mediana, 0,03) foram associados individualmente com MSTs mais baixas (7,1 meses contra 4,3 meses para miR-134, 7,1 meses contra 3,9 meses para miR-151, 8.2 meses versus 2,9 meses para miR-345, 9,2 meses versus 5,5 meses para miR-93 e 8,0 meses versus 5,2 meses para miR-100, Tabela 2 e Figura 1A). Quando estes limiares foram aplicados ao conjunto de validação, foram observados log-rank comparável

P valores e RHs

(Tabela 2 e Figura 1B).

A) 92 pacientes no conjunto de dados de treinamento . B) 92 pacientes no conjunto de dados de validação. C) O escore de risco e sobrevida global em treinamento conjunto de dados D) O escore de risco e sobrevida global de conjunto de dados de validação.

Cox análise de regressão de risco proporcional para todas as 184 amostras mostraram que os níveis de expressão dos cinco miRNAs foram significativamente associados com morte por câncer (

P

= 0,004 para miR-134,

P

= 0,01 para miR-151,

P

= 0,008 para miR -345,

P

= 0,03 para miR-93, e

P

= 0,02 para miR-100, Tabela 3). Havia quatro miRNAs que foram protetora e um miRNA que era arriscado baseado em correlação de suas expressões e associação com a sobrevida do paciente.

Nature de 5 miRNA assinatura de expressão

Estes 5 miRNAs foram em seguida, utilizado para criar uma assinatura calculando um grau de risco para cada paciente. De acordo com os escores de risco, os pacientes no grupo de treinamento foram divididos em grupos de alto e baixo risco, utilizando o escore de risco médio como ponto de corte. Os pacientes pertencentes ao grupo de alto risco tinham menor sobrevida média de pacientes com escore de risco baixo (9,4 meses versus 4,0 meses,

P

= 0,003). O mesmo ponto de fórmula risco-score e de corte obtido a partir da coorte de treinamento foram aplicadas a 92 pacientes na coorte de validação. Similar aos resultados do conjunto de treinamento, a sobrevida foi maior no grupo de baixo risco do que no grupo de alto risco em todo o seguimento (Tabela 4, Figura 1C).

efusão miRNA assinatura de expressão é independente do tabagismo

a fim de verificar se o escore de risco com base 5 miRNA expressão assinatura é um preditor independente de sobrevida dos pacientes de câncer de pulmão, foi realizada a análise de regressão de Cox. Como mostrado na Tabela 5, tabagismo, idade e escore de risco foram fatores estatisticamente significativas de sobrevivência, utilizando um modelo de regressão univariada de Cox. No entanto, quando um modelo de regressão multivariada de Cox foi aplicado, escore de risco (

P

= 0,01) e tabagismo (

P

= 0,04) foram os dois preditores independentes de sobrevida do paciente (Tabela 5).

Discussão

Usando uma abordagem de amostra-splitting, a assinatura de expressão 5 miRNA que pode prever a sobrevivência tanto em treinamento e validação conjuntos foi identificado neste estudo. Mais importante ainda, a assinatura de expressão 5 miRNA foi um marcador prognóstico independente do tempo de sobrevivência pobre em análise multivariada. Para nosso conhecimento, este é o primeiro relatório de uma assinatura de expressão miRNA em derrames pleurais malignos que possam prever a sobrevida dos pacientes NSCLC.

Nós usamos miRNA microarray para detectar de forma diferente expressa miRNAs. Comparado com o grupo de curto sobrevivência, 21 miRNAs foram up-regulada e 12 miRNAs foram regulados negativamente no grupo de maior sobrevivência. A maioria dos estudos anteriores selecionado miRNAs com base nos

P valores Comprar e Dobre mudanças. Aqui, nós também utilizadas bioinformática interpretação dos miRNAs funcionais para selecionar miRNAs. termo GO e KEGG anotação via foram aplicadas ao seu conjunto de genes-alvo. Como resultado, KEGG anotação mostrou que proliferativa importante (MAPK e Wnt), sobrevivência (TGF-p e mTOR), o adesivo, as vias de sinalização oncogénicos e metabólicas eram abundantes entre os significativamente enriquecidos. A maioria deles já foram relatados a participar na promoção câncer de pulmão. O GOs relacionadas com a transdução de sinal, crescimento celular, apoptose e metabolismo representada a maioria dos termos GO significativamente enriquecidos, que estava em conformidade com a análise KEGG. Esta identidade funcional confirmou uma mudança sistemática em miRNAs e seus genes-alvo durante a formação e promoção tumor. A análise de redes de interação miRNA-mRNA integrada ainda mais a descoberta de bioinformática, e, em seguida, apresentou os principais alvos de miRNAs. O centro da rede foi representa por grau, o que significa que a contribuição de um miARN aos genes redor. foram seleccionados miARNs com graus mais elevados para análise posterior. Portanto, bioinformática interpretação pode nos ajudar a pegar miRNAs com funções importantes durante a progressão do câncer de pulmão.

A assinatura de cinco miRNA identificados neste estudo incluiu um miRNA (miRNA-100) que era arriscado e quatro miRNAs (miRNA-93 , miARN-134, miARN-151 e miARN-345) que foram protectora no que diz respeito à sua associação entre a sua expressão e a sobrevivência do paciente. A natureza de protecção e arriscado destes miARNs é sugestivo de suas funções sendo quer inibidora ou que promovem de várias propriedades das células cancerosas, tais como a proliferação, migração e invasão. Aumento de miR-100 foi encontrado no carcinoma do ovário [18], carcinoma hepatocelular e carcinoma do esófago de células escamosas [19], [20]. Em boa correlação com os nossos dados, miR-100 expressão foi associada com a progressão e prognóstico no câncer gástrico [21]. Zheng et al. demonstrado que o miR-100 regula a diferenciação e sobrevivência celular por segmentação RBSP3, um supressor de tumor fosfatase como na leucemia mielóide aguda [22]. Entre as quatro miARNs de protecção, apenas a miR-134 foi relatado para aumentar a sobrevivência celular através da indução de paragem em G1 em células de cancro do pulmão [23]. Nossos resultados mostram que todos estes quatro miRNAs foram regulados positivamente em pacientes com tempo de sobrevida mais longa. As expressões destes miRNAs foram positivamente correlacionados com a sobrevida do paciente. A infiltração do derrame por lumophcytes pode levar a uma resposta imunitária do tumor. Portanto, especula-se que os miARNs associados com a sobrevivência melhorada pode indicar uma resposta inflamatória, que necessita de ser demonstrada.

Neste estudo, os perfis de miARN isentos de células em efusões pleurais foram detectados, pela primeira vez, que possui uma série de vantagens. Para pacientes com NSCLC com MPE, os objetivos do tratamento são para controlar o volume de derrame pleural e prolongar a sobrevivência. Portanto, toracoscopicamente evacuação de derrame é uma rotina na clínica. Recolha de amostra de derramamento não aumentar a carga sobre os pacientes. Além disso, pacientes com câncer de pulmão e derrames malignos não pode receber tratamento cirúrgico. amostra de derramamento é mais fácil de obter do que a amostra de tecido. Além disso, miARNs como biomarcadores utilizados para prognóstico no ambiente clínico tem vantagens importantes em contraste com os mRNAs. Ao contrário de mRNAs, miRNAs em efusões permanecem em grande parte intacto e estável. Um número modesto de miRNAs pode ser suficiente para prever a sobrevida do paciente. Tem sido demonstrado que a classificação de vários tipos de câncer com base em assinaturas de expressão de miRNA é mais preciso do que as assinaturas de mRNA base [24].

Apesar de mais estudos prospectivos com grande número de pacientes são necessários para confirmar o papel da assinatura miRNA como fator prognóstico, os presentes resultados podem ter implicações clínicas significativas, uma vez que não há nenhum marcador de prognóstico estabelecido, exceto performance status pré-tratamento para pacientes com NSCLC com MPE [25]. Os cinco assinatura miRNA, identificados neste estudo, classifica os pacientes com sucesso em grupos de baixo risco e alto risco em ambos os conjuntos de treinamento e validação. Isto pode ajudar os clínicos para identificar doentes que pertencem a um risco elevado para a terapia adjuvante mais eficaz em adição ao protocolo de tratamento padrão. Nossa descoberta de que cinco assinatura miRNA pode prever a sobrevida do paciente também susceptível de gerar potenciais alvos moleculares para o desenvolvimento de terapia antineoplásica. Desde miRNAs pode direcionar vários genes, estudos mais aprofundados são necessários para entender o mecanismo de regulação destes miRNAs que é provável que resulte em uma melhor compreensão sobre a metástase pleural do NSCLC.

Em conclusão, nós identificamos uma assinatura de cinco miRNA que pode prever a sobrevida do paciente em NSCLC avançado. Efusões com alta expressão de miR-100 e baixa expressão de miRNA-93, miRNA-134, miRNA-151 e miRNA-345 foram associados com desfecho sobrevida. Esses achados podem ter implicações na compreensão das NSCLC avançado, desenvolvimento de terapia-alvo e seleção de pacientes com câncer para terapia adjuvante.

Métodos

Todas as pesquisas envolvendo participantes humanos foram aprovados pelo “Cilindro torre Hospital comissão de ética “e consentimento informado por escrito foi obtido de todos os assuntos.

recolha de amostras e RNA isolamento

amostras de efusão de 184 pacientes consecutivos com diagnóstico histológico de câncer de pulmão foram coletadas durante o período de março 2006 a dezembro de 2010 no Drum Tower Hospital e Nanjing Chest Hospital. Nenhum dos pacientes recebeu a entrega medicina cavidade antes da coleta da amostra. 5 ml de derrame para extracção de ARN foi recolhido num tubo contendo ácido cítrico isento de ARNase de cada paciente. O sobrenadante foi obtido por centrifugação a 4000 g durante 20 min. 800 ul de sobrenadante foi misturado com 2,4 ml de reagente TRIzol LS (Invitrogen, CA, EUA). Outros 30 fmol ATH-miR159a foi complementada em cada tubo de amostra. Em seguida, o RNA total contendo RNA pequeno foi extraído de derrames usando miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com o protocolo do fabricante.

Microarray e bioinformática interpretação dos miRNAs funcionais

Mirna microarray foi desenvolvido em 10 amostras (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Após a análise significativa e análise FDR, foram selecionados os genes diferencialmente expressos de acordo com o

P

limiar -valor e dobre alterações [26]. análise GO foi aplicado para analisar a principal função dos genes de expressão diferencial de acordo com o Gene Ontology que é a classificação funcional chave do NCBI [27]. Da mesma forma, a análise Caminho foi usado para descobrir a via significativa dos genes diferenciais de acordo com KEGG, Biocarta Reatome e [28]. A relação da miARN e os genes foram contados pelos seus valores de expressão diferencial, e miARN -Gene-rede foi construída de acordo com as interacções de miARN e genes na base de dados de Sanger miARN [29]. O centro da rede foi representa por grau, o que significa que a contribuição uma MicroRNA aos genes redor. Os 5 miRNAs com graus mais altos foram escolhidos para um estudo mais aprofundado.

RT-PCR quantitativo

miRNAs foram reverso-transcrito para cDNA com AMV transcriptase (Takara, Japão) reversa. O ARN total (1,5 mL para cada miARN) foi usado como os modelos, e a reacção foi incubada a 16 ° C durante 10 min, seguido de 42 ° C durante 40 min e 70 ° C durante 15 min para desnaturar a transcriptase reversa. As reacções de PCR quantitativas para miARNs foram realizadas utilizando UPL sonda (Roche, Basileia, Switerland) pela ABI Sistema de Detecção Além disso StepOne (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). As condições de PCR foram 95 ° C durante 10 min, seguido de 50 ciclos a 95 ° C durante 15 s e 60 ° C durante 1 min. Cada amostra foi ensaiada em triplicado. níveis relativos de expressão de miRNA foram calculados de acordo com o método Ct comparativo utilizando ATH-miR159a como referência e uma mistura de RNA extraído de células humanas A549 câncer de pulmão e câncer gástrico células BGC-823 (1:1) como o calibrador.

análise estatística

as diferenças entre os dois grupos foram avaliadas pelo teste t. As associações entre a sobrevida global e derrame níveis de expressão de miRNA foram analisados ​​usando o método de Kaplan-Meier, teste log-rank, e modelos de regressão de risco proporcional de Cox. Escores de risco foram atribuídas a todos os pacientes de acordo com uma combinação linear do nível da expressão de miARN, ponderadas por o coeficiente de regressão a partir de amostras de treino. O escore de risco foi calculado da seguinte forma: o risco-score = (1,21 × nível de miR-100 expressão) + (- 0,28 × nível de expressão de miR-134) + (- 0,33 × nível de expressão de miR-151) + (- 0,35 × nível de expressão de miR-345) + (- 0,19 × nível de expressão de miR-93). modelo de regressão Cox e estratificação também foram conduzidas. A análise estatística foi realizada utilizando o software (SPSS 18; SPSS, Chicago, IL). A significância estatística foi aceito para

P

valores . 0,05

Informações de Apoio

arquivo S1.

113 miRNAs foram detectados nestes 10 pacientes entre o grupo de maior sobrevivência e grupo de curto sobrevivência por miRNA microarray (S1 Arquivo). Dobre alterações, o valor FDR e valor de p foram calculados para todos os miRNAs

doi:. 10.1371 /journal.pone.0043268.s001

(XLS)

Figura S1.

A trama vulcão mostra os miRNAs diferencialmente expressos em derrames entre o grupo de maior sobrevivência e grupo de curto sobrevivência. O eixo horizontal representa a alteração de dobragem entre dois grupos. O eixo vertical representa o P-valor do teste t para as diferenças entre amostras

doi:. 10.1371 /journal.pone.0043268.s002

(TIF)

Figura S2.

GO e análise de caminho baseado em miRNA genes alvo. O eixo vertical é a GO (A) e caminho (B) da categoria, eo eixo horizontal é o enriquecimento de GO e vias

doi:. 10.1371 /journal.pone.0043268.s003

(TIF)

Figura S3. rede

miRNA-mRNA. nós caixa vermelha representam miRNA e azul nós ciclo representam mRNA. Arestas mostram o efeito inibidor de miARN no ARNm. O centro da rede foi representa por grau, o que significa que a contribuição uma MicroRNA aos genes redor. miRNA-93 têm os maiores graus

doi:. 10.1371 /journal.pone.0043268.s004

(TIF)

Tabela S1.

MiRNAs que são diferencialmente expressos em derrames entre o grupo de maior sobrevivência e grupo de curto sobrevivência.

doi: 10.1371 /journal.pone.0043268.s005

(DOC)

Reconhecimentos

Agradecemos Qian Qian e como Yu, em Nanjing Chest Hospital para fornecer parte da nossa derrame amostras.