Abstract

A disseminação de células cancerosas da próstata com o microambiente da medula óssea e do crescimento resistente a castração são fundamentais passos na progressão da doença e fontes significativas de morbidade. No entanto, o significado biológico de células estaminais mesenquimais (MSCs) e de medula óssea derivadas de matriz extracelular (ECM-BM), em que este processo não é totalmente compreendido. Por isso, estabeleceu um

in vitro

modelo de tecido da medula óssea de engenharia que incorpora hMSCs e BM-ECM para facilitar estudos sobre os mecanismos de sobrevivência das células do câncer de próstata em meio destituído de andrógeno em resposta a parácrina fatores e BM-ECM. fatores parácrinos hMSC derivados aumentaram a sobrevivência de células LNCaP, que foi em parte atribuído a IGFR e sinalização IL6. Além disso, BM-ECM aumentou LNCaP e sobrevivência de células MDA-PCA-2b em condições de depleção de androgênio, e induziu chemoresistance e alterações morfológicas no LNCaPs. Para determinar o efeito de BM-ECM na sinalização celular, foi examinado o estado de fosforilação de 46 cinases. Os aumentos na fosforilação de proteínas relacionadas com a via da MAPK, bem como sustenta a fosforilação de Akt foram observados em culturas de BM-ECM quando em comparação com as culturas cultivadas em polistireno tratados com plasma. Bloqueio de MEK1 /2 ou a via PI3K levou a uma redução significativa na sobrevivência de LNCaP, quando cultivadas na BM-ECM em condições de depleção de androgênio. A relevância clínica destas observações foi determinado por análise de Erk fosforilação em cancro da próstata metastático ósseo humano contra o cancro da próstata não metastático, e aumento da fosforilação foi observado nas amostras metastáticas. Aqui nós descrevemos um modelo de medula óssea engenharia que imita muitas características observadas em pacientes e fornece uma plataforma para mecanicistas

in vitro

estudos

Citation:. Lescarbeau RM, Seib FP, Prewitz M, Werner C , Kaplan DL (2012) In Vitro Modelo de metástase para Medula óssea medeia o cancro da próstata castração Crescimento resistente através parácrina e Fatores de matriz extracelular. PLoS ONE 7 (8): e40372. doi: 10.1371 /journal.pone.0040372

editor: Subhash Gautam, Henry Ford Health System, Estados Unidos da América

Recebido: 11 Abril de 2012; Aceito: 07 de junho de 2012; Publicação: 01 de agosto de 2012

Direitos de autor: © Lescarbeau et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health EB002520-05 P41 concessão (Engenharia de Tecidos Resource Center) (DL Kaplan). FP Seib é apoiado por uma bolsa Mildred Scheel de Pós-Doutorado da Aid alemão do cancro. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O microambiente da medula óssea oferece muitas pistas que permitem a sobrevivência e proliferação de células cancerosas da próstata. Está agora bem estabelecido que, em particular, de osteoblastos factores segregados permitir androgénio crescimento independente de células de cancro da próstata metastizado [1], [2]. Além disso, derivadas da medula óssea matriz extracelular (BM-ECM) está implicado na progressão de outros tipos de cancro, incluindo do mieloma múltiplo, através da activação de vias associadas com a sobrevivência [3].

Devido ao tropismo significativa de câncer de próstata para a medula óssea, numerosos

in vivo

modelos foram desenvolvidos para estudar essa interação. Estes incluem modelos de murganho de xenoenxerto em que as células cancerosas são injectados intratibialmente [4], modelos de ratinho humanizados, onde o osso humano é colocado subcutaneamente e em seguida semeado com células de cancro da próstata, implantação subcutânea de tecido ósseo por engenharia [5], e as fibras ocas contendo tanto cancro da próstata e óssea como células [6]. Estes

in vivo

modelos, no entanto, são de baixo rendimento e potencialmente sofrem de interações xenogênicos. Para superar algumas destas limitações, e para permitir a melhoria estudos sobre os mecanismos e alto throughput screening, os pesquisadores estão usando

in vitro

modelos de cultura celular. Só recentemente plasma convencional de poliestireno tratado de cultura de tecidos (PTP) Ware foi substituído por substratos de cultura que imitam mais de perto o

in vivo

microambiente do tumor. Estes incluíram modelos estudo das interacções parácrinos e, mais recentemente, as interacções ECM [7], [8], [9]. No entanto, nenhum desses estudos usaram um modelo de tecido da medula óssea de engenharia em combinação com meios de andrógenos esgotados para modelar a progressão do câncer de próstata resistente à castração

in vitro.

O crescimento e sobrevivência das células cancerosas da próstata em condições de androgénio empobrecido tem sido atribuída a uma variedade de mecanismos. A sobre-regulação do receptor de androgénio permitindo um aumento da sensibilidade, mutações que permitem o aumento promiscuidade de outros ligandos, bem como a síntese de androgénio intracrine pelas células cancerosas da próstata contribuir para crescimento independente de androgénios [10]. Outros métodos de crescimento independente de androgénio incluem a activação de vias mitogénicas e factores de transcrição, tais como MAPK, PI3K, STAT3, e β-catenina [11], [12]. A activação destes percursos permite o crescimento independente de androgénio ou sobrevivência celular através de co-activação do receptor de androgénio.

anterior

In vitro

estudos sugeriram que os componentes de ECM individuais podem actuar como ligandos para induzir sinalização celular mitogénica e sobrevivência. Por exemplo, a fibronectina, que é um componente de BM-ECM, induziu a fosforilação de MEK através FAK e Src [13]. Do mesmo modo, a integrina β1 e as interacções de IGF-1R com fibronectina mediada quimiorresistência na linha celular de cancro da próstata DU145 [14]. Estes estudos indicam um possível papel para ligantes BM-ECM ativação de caminhos associados com o crescimento independente de andrógeno e progressão da doença.

Co-culturas de células mesenquimais humanas estaminais (hMSCs) e células cancerosas da próstata permite sinalização parácrina, induz a osteogênese, e suporta a sobrevivência de câncer de próstata. Para os painéis A, B, C valores brutos foram normalizados para o grupo de controlo negativo. hMSCs (A) foram tratados com meios normais de crescimento, meios condicionados LNCaP, PC3 condicionado mídia ou material osteogênicos 14 dias. Eles foram então coradas com vermelho de alizarina, que foi subsequentemente extraído e quantificado para determinar a deposição de cálcio. (B) de qRT-PCR para os transcritos especificados. Cada grupo foi cultivado como descrito em (A), e extraiu-se ARN posteriormente. (C) indirectos co-culturas de hMSCs com LNCaPs em meios de androgénio suprimido na presença do inibidor de IGFR AG1024, ou inibidores de IL6, AG490 e mAb anti-IL6. As células foram plaqueadas em meio de crescimento, deixou-se recuperar durante 24 h, e subsequentemente mudado para androgénio empobrecido inibidor mais meio. LNCaP viabilidade foi medida após 7 dias. (D) IL6 concentrações em meio de cultura condicionado. (E) IGF-1 concentrações em meios condicionados após 48 horas de cada tipo de célula cultivada sozinho. (* P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001, n = 3, ± SEM).

derivadas de medula óssea matriz extracelular (ECM-BM) protege o cancro da próstata as células contra a depleção de androgênio e quimioterapia. Para os painéis A, B, C valores brutos foram normalizados para o grupo de controlo negativo. (A) O crescimento de células LNCaP ao longo do tempo em cultura em meios esgotados androgénio tal como medido através de MTT. Iguais números de LNCaPs foram semeadas à BM-ECM ou PTP com um n de 4 por um grupo por cada ponto de tempo, e ensaiaram-se no dia apropriada. (B) MDA-PCa-2bs foram plaqueadas e transferido para androgénio meios eliminados, tal como descrito em (A) e a viabilidade celular foi determinada após 4 dias. MDA-PCA-2bs células também foram cultivadas em ECM comercial. (C) A viabilidade celular de células LNCaP, após 72 horas em meio de crescimento com 25 nM de docetaxel. (* P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001, n = 3, com a excepção indicada em (A), ± SEM)

derivadas da medula óssea matriz extracelular. (BM-ECM) induz crescimento de aglomerado como LNCaPs que resiste a depleção androgénica. LNCaPs foram semeadas à BM-ECM e PTP, como detalhado na Figura 2A. microscopia eletrônica de varredura de 7 culturas dia em meios de crescimento normais (A) e (B) andrógenos empobrecido mídia. (C) Maior micrografia eletrônica de varredura ampliação de LNCaP (asterisco preto) células cultivadas no BM-ECM (asterisco branco). (D) A circularidade de LNCaPs sobre PTP em andrógeno esgotados e meio de crescimento e LNCaPs no BM-ECM em andrógeno media empobrecido foi quantificada a partir de imagens de microscopia eletrônica de varredura após 7 dias em cultura (* P 0,05; ** P 0,01; * ** P . 0,001, ± SEM)

Expressão de integrina avp3 nas células LNCaP medeia a adesão à matriz extracelular óssea derivadas de medula (BM-ECM). (A), a expressão de superfície celular da integrina avp3 tal como medido por citometria de fluxo. (B) Anti-aVp3 anticorpo integrina reduzida adesão celular a BM-ECM. valores brutos foram normalizados para o grupo IgG controle. (N = 3, * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001, ± SEM).

diferenciais fosfo-proteómica de células LNCaP cultivadas em extracelular derivada de medula óssea matriz (BM-ECM). (A) de agrupamento hierárquico revela LNCaPs no BM-ECM em meios de andrógenos empobrecido agrupados mais perto com LNCaPs cultivadas em PTP em meio de crescimento (B) fosforilação diferencial de LNCaPs no BM-ECM em meios de andrógenos empobrecido contra LNCaPs sobre PTP em meios de andrógenos esgotado. (C) fosforilação diferencial de LNCaPs sobre PTP em meios de andrógenos empobrecido contra LNCaPs sobre PTP em meios de crescimento. (D) a fosforilação diferencial de LNCaPs no BM-ECM em meios de andrógenos empobrecido contra LNCaPs sobre PTP em meio de crescimento.

derivadas da medula óssea matriz extracelular (BM-ECM) induz diferencial sinalização em células LNCaP que medeia a sobrevivência celular. Figura painéis C, D, E valores brutos foram normalizados para o grupo de controlo negativo. (A) Western Blot de LNCaPs indica aumento de fosfo-ERK1 /2 e fosfo-p90RSK em resposta à BM-ECM. (B) Efeito de PI3K, LY294002, ou MEK1 /2, U0126, inibidores sobre LNCaPs cultivadas na BM-ECM. As células foram semeadas a densidades iguais BM-ECM ou PTP em meio de crescimento e depois de 24 h comutado para androgénio meio destituído ± inibidores. A viabilidade celular foi medida após 7 dias (n = 3). (C) Relativa apoptose tal como medido usando um ensaio de desidrogenase de 6-fosfato de glicose após 72 horas. Limpar barra indica meios de crescimento, barras pretas do andrógeno media esgotados. As células lisadas são um controlo positivo (n = 8). (D) foram cultivadas em LNCaPs PTP indirectamente com hMSCs, em BM-ECM, ou em ambas as condições, simultaneamente, enquanto em meio destituído de androgénio. viabilidade celular relativa foi medida após 7 dias (n = 3, excepto como notado em (D), * P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001, ± SEM). (E) Reduções de fosfo-ERK1 /2 em células LNCaP no BM-ECM quando tratados com U0126 e LY294002.

A coloração para fosforilação Erk em um tissue microarray de amostras de tumores primários e metastáticos óssea amostras (a) secções de tecido representativos coradas para p-Erk a partir de amostras de tumor de próstata primário. Amostra VI continha a única coloração positiva substancial em amostras de próstata primários. seções (B) de tecido coradas para p-Erk a partir de amostras de cancro da próstata metastático do osso (barras de escala são 200 mm).

A média de pontuação plotados para cada grupo tirada de dois investigadores cegos (círculos pretos). A coloração em secções de metástase óssea é significativa sobre ambas as secções de tecido e tumor primário normais (n = 8 para o tecido da próstata normal, n = 72 para o tumor primário e metástases n = 4 osso, *** P 0,001, ± Desvio Padrão.. ).

Aqui nós apresentamos um

in vitro

plataforma, que permite o exame eficiente e precisa do microambiente do tumor da medula óssea com um foco específico no BM-ECMs. Nós usamos este sistema para examinar a resposta das células cancerosas da próstata e foram capazes de identificar vários fatores que contribuíram para a progressão da doença, incluindo o crescimento independente de andrógeno e chemoresistance. Os fatores identificados incluídos IGF1 e sinalização parácrina IL6 e ativação da via MAPK via de sinalização BM-ECM.

Materiais e Métodos

cultura de células e substrato BM-ECM

LNCaP, PC3, e as células MDA-PCA-2b foram recentemente comprado de ATCC (Manassas, VA) que valida linhas celulares usando análise STR. aspirados da medula óssea inteiras foram obtidos a partir de Lonza (Basileia, Suíça), e as hMSCs foram isolados e caracterizados tal como descrito noutro local [15]. Após o isolamento, as hMSCs foram cultivadas em DMEM suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 1% de Penicilina Estreptomicina, aminoácidos não essenciais 0,1 mM e 1 ng /de factor de crescimento de fibroblastos básico ml. células LNCaP e PC3 foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com FBS a 10%, e 1% de penicilina estreptomicina. Enquanto as células MDA-PCa-2b foram foram cultivadas em meio BRFF-HPC1 (ES Athena, Baltimore, MD) suplementado com 20% de FBS sem Penicilina Estreptomicina. Para estudos envolvendo meios esgotados andrógeno, meios de base livre vermelho fenol foi usado com 10% de carvão despojado FBS. Indirectos co-culturas usado 1 ^ M de tamanho de poro inserções Transwell (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) com um tipo de células semeadas na placa de cultura de tecido e outra na inserção de cultura de célula. estudos de co-cultura indirecta utilizada uma proporção de 01:01 de meios de comunicação os dois tipos de células de interesse. Em estudos de androgénio empobrecido foram preparados dois tipos de meios, tal como descrito acima. As culturas celulares foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2. O ECM derivadas da medula óssea foi gerado tal como descrito noutro local [16]. Salvo indicação em contrário todos os reagentes de cultura de células foram adquiridos a partir de Invitrogen (Carlsbad, CA).

andrógeno estudos empobrecido crescimento

Para os estudos de crescimento /sobrevivência independentes de andrógenos, células cancerosas da próstata foram semeadas a 5000 células /cm

2 em meios de crescimento em ambos PTP ou BM-ECM. Estudos incluindo células MDA-PCA-2b, placas de controlo PTP também foram revestidas primeiro com uma matriz de ligação de células proprietária que contém fibronectina, o colagénio e albumina (Athena ES, Baltimore, MD) para facilitar a adesão celular. As células foram deixadas aderir durante 24 horas, após o que as culturas foram lavadas com PBS, e transferido para androgénio meios esgotados. células LNCaP na BM-ECM ou PTP foram ensaiadas tal como descrito abaixo nos seus respectivos pontos de tempo para completar a curva de crescimento, ou o meio foi substituído. As células MDA-PCa-2b foram cultivadas durante 4 dias, o meio foi mudado no dia 2, e os números de células relativos avaliada através 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT, Invitrogen ) no final do período de cultura, seguindo o protocolo do fabricante. A validade do ensaio de MTT foi confirmada por comparação com contagem manual e quantificação de ADN (Fig. S1A, S1B). Os valores de MTT foram normalizados para o controlo negativo que foi arbitrariamente definida como um valor de um.

experimentais bloqueio

Integrina

Células LNCaP em suspensão foram pré-incubados com um anticorpo monoclonal de bloqueio contra a aVp3 (20 ug /mL), o clone 23C6 (eBioscience, San Diego, CA), ou IgG de controlo do isotipo durante 30 minutos e em seguida semeado com BM-ECM. Após 12 horas, o meio foi aspirado e as células foram lavadas uma vez com PBS. O número relativo de células foi então medida utilizando um ensaio MTT como descrito acima.

estudos de tratamento com docetaxel

células de cancro da próstata foram semeadas em PTP ou BM-ECM como detalhado acima e deixou-se recuperar durante 24 horas. Em seguida, as células foram lavadas com PBS e substituído com meio de crescimento suplementado com 25 nM de docetaxel única ou veículo. As células foram expostas a tratamento durante 72 horas e a viabilidade celular relativa foi então medida utilizando um ensaio de MTT, que foi normalizada como em ensaios de MTT anteriores.

ensaios ELISA

Para recolher amostras de meio condicionado de cada tipo de célula foi semeada para PTP e co-culturas realizados utilizando transpoço inserções com hMSCs em células PTP e LNCaP semeadas para as inserções. Os meios condicionados de cada grupo foi removido a cada 48 horas e substituído com meio fresco. Ambos IL6 e kits de ELISA de IGF-1 foram realizados de acordo com as instruções do fabricante (eBioscience e R D Systems, respectivamente). O experimento foi executado em triplicado e o valor médio calculado.

A apoptose ensaio

LNCaPs foram semeadas a 2500 células /cm

2 em uma placa de 24 poços e deixadas a aderir durante 24 horas perante a mídia foi alterado para meio de crescimento, meios de andrógenos esgotados, ou mídia de andrógenos empobrecido suplementadas com LY294002 (Merck Química, Gibbstown, NJ). Após 72 horas o meio foi recolhido a partir de cada cavidade e ensaiadas quanto a apoptose utilizando um ensaio de 6-fosfato de glucose (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. 0,25% de Triton X-100 foi completada no grupo de controlo positivo antes da remoção do suporte. O experimento foi realizado com n = 8 e a média calculada. valores de fluorescência medidos foram normalizados para o controlo negativo que foi ajustado para um valor de um.

A microscopia electrónica de varrimento

Células LNCaP foram semeadas em PTP ou BM-ECM como detalhado acima. Ao fim de 4 dias em meio destituído growth- ou andrógenos, as culturas foram terminadas, lavadas com PBS, fixadas com glutaraldeído a 2% e preparado para pulverização de platina-paládio tal como descrito noutro local [17]. As amostras foram visualizadas com uma emissão de campo microscópio eletrônico de varredura Zeiss Supra 55VP.

Western blot e arrays de proteínas de fase reversa

células LNCaP foram semeadas em meio de crescimento para PTP e BM-ECM e permitiu recuperar durante 24 horas. Tal como indicado, o meio de cultura foi substituído com um ou outro meio de crescimento fresco ou andrógenos empobrecido meios e as células foram cultivadas durante 72 horas. Em seguida, o meio foi removido, as células foram lavadas com PBS gelado e recolhidas com um raspador de células. As células foram sedimentadas a 4 ° C e lisadas com cocktails tampão RIPA (Roche, Basileia, Suíça) que continha inibidores da protease e da fosfatase (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) a 4 ° C O teor de proteína foi determinada com o ensaio de proteína do ácido bicinconínico ( Pierce Biotechnology) e 5 ug de proteína celular foi reduzida e analisados ​​por transferência de Western por pista. As membranas foram bloqueadas com albumina de soro bovino e sondadas com um cocktail de anticorpos contra fosfo-p90RSK (Ser380), fosfo-Akt (Ser473), fosfo-p44 /42 (Thr202 /Tyr204), fosfo-S6 (Ser235 /236), fosfo -Erk1 /2 (Thr202 /Tyr204), e eIF4E (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) utilizando uma incubação durante a noite a 4 ° C e a uma diluição 1:400 anticorpo. ERK total foi determinado utilizando um /42 MAPK anticorpo específico da p44 (Cell Signaling Technology), a uma diluição 1:2000. Para os arrays de proteínas de fase inversa, no total de 150 ug de LNCaP ligado foi ensaiada utilizando o kit proteoma Profiler fosfo-quinase humana (R D Systems, Minneapolis, MN). De acordo com as instruções do fabricante

A citometria de fluxo

células LNCaP foram tripsinizadas e centrifugadas numa pelete (1200 rpm, 10 minutos). As células foram então ressuspensas em PBS contendo o anticorpo aVp3, clone de LM609, (Millipore, Billerica, MA) a uma diluição de 1:300 e incubadas a 4 ° C durante 30 min. As células foram então fixadas em formalina a 4%, e analisadas utilizando citometria de fluxo (FACSCaliber, BD Biosciences). Os dados foram analisados ​​usando o software Flow-jo (Árvore estrelas Inc., Ashland, OR).

Alazarin mancha vermelha e quantificação

Para avaliar a diferenciação osteogênica de hMSCs em resposta ao câncer de próstata células de meio condicionado, LNCaPs e hMSCs ou PC3s e hMSCs foram indirectamente co-cultivadas numa proporção de 1:01 a respectivos meios. Aos 14 dias de co-cultura, a camada de MSC foi fixado com formalina a 4% e incubou-se com uma solução aquosa a 1% de alizarina vermelha (pH 4,2) (Sigma-Aldrich) durante 10 min à temperatura ambiente. Em seguida, as amostras foram lavadas com água para remover o corante não ligado e subsequentemente visualizados por microscopia de luz. Para quantificação de alizarina vermelha 10% de ácido acético foram adicionados a cada poço, incubou-se durante 30 minutos, foi retirada de cada poço, e neutralizou-se com hidróxido de amónio a 10%. Por fim, a absorvância das amostras foi lida a 405 nm utilizando um espectrofotómetro. Os valores de absorvância foram normalizadas para o controlo negativo que foi ajustado para um valor de um.

Sinalização estudos de inibição

Para as células de co-culturas indirectos foram semeadas em meio de crescimento e depois de 24 h o meio foi substituído com uma mistura 01:01 de andrógenos empobrecido media LNCaP e hMSC. Este meio foi suplementado com LY294002, a uma concentração de 5 uM ou U0126 (EMD Chemicals) a 100 nM. AG1024 e AG490 (EMD Chemicals) também foram suplementados para o meio esgotado de androgénio e de hMSCs LNCaPs em co-cultura indirecta, a uma concentração de 1 uM e 50 uM, respectivamente. O anticorpo monoclonal anti-IL-6 humana (eBioscience) foi suplementado para o meio a uma concentração de 20 ug /ml, enquanto LNCaPs foram co-cultivadas indirectamente com as hMSCs. As concentrações úteis de inibidores de moléculas pequenas foram determinados a partir de curvas de resposta à dose de LNCaPs sozinhas em cultura (Fig. S2). A sobrevivência celular foi determinada com o ensaio MTT como descrito acima, após 7 dias. Os valores de MTT foram normalizados para o controlo negativo que foi ajustado para um valor de um.

quantitativo em tempo real da reacção em cadeia da polimerase (RT-PCR)

O ARN total foi isolado utilizando colunas de sílica RNeasy (Qiagen , Valência, CA) de acordo com as instruções do fabricante, e 200 ng de ARN foi transcrito reversamente a partir de cada amostra (iScript, Bio-Rad, Hercules CA). Os níveis de expressão de genes alvo foi quantificado por RT-PCR utilizando Brilhante II rápida mistura QPCR mestre (Aglient Technologies, Santa Clara, CA) e iniciadores validados (TaqMan, Applied Biosystems, Carlsbad CA). A expressão relativa de genes alvo foi calculada com base nos valores de sub>

-ΔΔCT método assumindo 100% de eficiência de duas PCR [18] .

fosfo-Erk imunohistoquímica

microarrays de tecido da próstata contendo secções de tecido normal da próstata, tumores da próstata primários e tecido ósseo metastático da próstata foram obtidas a partir de US Biomax (Rockville, MD). Um anticorpo monoclonal contra a T185 ERK1 /2 phosphosites, Y187, T202, Y204 e foi obtido a partir de Abcam (Cambridge, MA), o clone de MAPK-YT. A coloração foi realizada pelo laboratório Tufts Medical Center Histologia seguinte optimização de diluição do anticorpo de bloqueio e em otimizações lâminas cortadas a partir dos mesmos blocos de tecido que as amostras experimentais. microscopia de campo claro foi realizada utilizando um microscópio Leica Microsystems DM IL (Buffalo Grove, IL), com uma câmera Leica Microsystems DFC420 e Software Suite V3.5 Leica Microsystems Aplicação sem alterações a imagens RAW. Secções foram marcados por dois investigadores cegas utilizando a escala Dako (0,1 +, 2 +, 3 +), onde pontuações finais para cada seção foram então a média em conjunto [19]. A one-way ANOVA foi utilizado com teste post hoc de Bonferroni no intervalo de confiança de 95% para determinar a significância.

cálculos de IC50

células LNCaP foram semeadas em placas de 96 poços a 18.000 células /cm

2. As células foram tratadas com concentrações crescentes de inibidor e de sobrevivência relativa, medida com um ensaio MTT após 3 dias. As concentrações de IC50 foram determinados com base em metade da distância entre os valores máximos e mínimos de sobrevivência ao longo da curva de resposta à dose. A média foi feita de 12 repetições por concentração.

Validação de células contagem

número igual de células LNCaP foram semeadas para PTP e BM-ECM em uma placa de 24 poços a 2.500 células /cm

2, 5000 células /cm

2, e 7.500 células /cm

2, como determinado através de contar com um hemocitômetro. Além disso, prepararam-se concentrações crescentes de células LNCaP e uma medição tomada a partir de cada amostra de MTT (Invitrogen, Carlsbad, CA) e ensaios de quantificação de ADN utilizando Picogreen (Invitrogen, Carlsbad, CA) para criar uma curva padrão. Após 24 horas de cultura em andrógeno empobrecido media, as células no PTP e BM-ECM foram testadas usando quantificação do DNA, MTT e contagem manual através de coloração nuclear e imagiologia. núcleos celulares foram corados com Hoechst 33258, lavou-se com PBS, e fotografada em 20x utilizando um microscópio invertido Leica DM IL. Cinco imagens representativas foram tomadas por poço e o número de núcleos contadas manualmente. Este número de núcleos foi em média e multiplicado pela área da superfície de um único poço de uma placa de 24 poços (2 cm

2) sobre a área do campo de visão a 20x para determinar o número de células por poço, e o média de todas as réplicas biológicas tomadas (n = 4).

a análise dos dados

a análise estatística foi concluída utilizando Graphpad Prism 5. a significância foi acessado usando testes t não pareado uma cauda na confiança de 95% intervalo, ou ANOVA de uma via com o teste de comparação múltipla de Dunnett, também no intervalo de confiança de 95%, a menos que indicado de outra forma (* P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001). Os dados foram representados como a média ± SEM, a menos que indicado de outra maneira. análise de circularidade A imagem foi concluída usando ImageJ e sugeriu limiarizar configurações. valores crescentes na escala circularidade indicam células cada vez mais circulares. dados de microarranjos de proteína foram digitalizados como um arquivo de imagem ea intensidade de pixel integrada para cada ponto medido utilizando ImageJ. A média de duplicatas foi tomada, os dados foram significa centrado, e análise de agrupamento hierárquico foi realizada. fosforilação de proteínas diferencial entre os grupos foi expressa como a diferença de duas medidas dividido pelo desvio padrão da população.

Resultados

interações parácrinos de hMSCs e LNCaPs promover a diferenciação osteogénica de hMSCs e andrógeno sobrevivência independente do LNCaPs

Para entender melhor a sinalização parácrina entre hMSCs e células de câncer de próstata, foi utilizado co-culturas indiretos de LNCaPs e hMSCs. LNCaPs induzir a diferenciação osteogénica de hMSCs (Fig. 1A, 1B), que se assemelhava a ativação de osteoblastos freqüentemente visto em pacientes com câncer de próstata [20]. Além disso, a sobrevivência de células de LNCaP em hMSC co-culturas foi significativamente melhorada em relação às culturas monotípicas LNCaP em androgénio empobrecido meios de comunicação (Fig. 1C). Para interrogar estes efeitos, a sinalização IL6 foi inibida com um anticorpo anti-IL6 monoclonal ou, AG490, uma pequena molécula inibidora da quinase Jak2, um activador a montante da STAT3. Estes tratamentos reduziram significativamente a viabilidade das LNCaPs em comparação com o grupo de co-cultura em condições desinibida empobrecido andrógenos (Fig. 1C). Notando que a redução da viabilidade não foi para o nível de LNCaPs cultivadas isoladamente, também testaram o efeito da AG1024, um inibidor IGFR. Esta droga também reduziu significativamente a viabilidade das células LNCaP indirectamente co-cultivadas com as hMSCs. Estes inibidores sozinho não eram citotóxicos para as células (Fig. S2). Finalmente, a expressão de IL-6 ao longo do tempo foi confirmada por meio de ELISA a partir de hMSCs meios condicionados com condições diferentes (Fig. 1D). Notavelmente, as hMSCs que tinha sido pré-diferenciada para uma linhagem osteogica tinha consistentemente taxas de expressão mais elevados de IL6. Considerando LNCaPs induzir hMSCs a sofrer diferenciação osteogénica, este pode ser uma fonte de IL6 aumento ligandos níveis. Além disso, os níveis de IGF-1 foram medidos em meio condicionado com um ensaio de ELISA. Sem tempo de efeitos variados foram vistos, foi observado libertação estado estacionário no entanto significativo de hMSCs em comparação com PC3 e células LNCaP (Fig. 1E).

BM-ECM promove a sobrevivência de células LNCaP em andrógenos empobrecido mídia e chemoresistance

Além solúvel sinais parácrinos, temos a hipótese de que o osso ECM medula-like pode desempenhar um papel na sobrevivência de células cancerosas da próstata andrógeno-dependentes. Uma matriz descelulada foi derivado a partir de proteínas secretadas por ECM hMSCs [16]. Após uma semana de cultura em meio privado de androgénio, houve um aumento significativo no número de células viáveis ​​na BM-ECM, em comparação com as células em meios de androgénio empobrecido em PTP (Fig. 2A). O mecanismo deste efeito foi confirmado num segundo linha celular dependente de androgénios, isto é, as células MDA-PCa-2b (Fig. 2B). As células MDA-2b-PCA são rotineiramente cultivadas em ECM comercialmente disponível para suportar a adesão celular e o crescimento. No entanto, este substrato ECM não suportar o crescimento de células MDA-PCa-2b em condições empobrecido androgénio, indicando o efeito é específico para os componentes de ECM ou BM-estrutura (Fig. 2B). Em seguida, examinamos se BM-ECM poderia conferir chemoresistance utilizando meio de crescimento suplementado com docetaxel. BM-ECM cultivadas células LNCaP mostraram um aumento significativo na sobrevivência das células quando comparada com PTP culturas (Fig. 2C). Estes dados indicam que os componentes de BM-ECM desempenham um papel na determinação da sobrevivência em resposta à privação de androgénio e docetaxel tratamento.

BM-ECM altera a morfologia LNCaP

Para proporcionar uma melhor compreensão da o crosstalk BM-ECM e LNCaP, analisamos a morfologia das células por microscopia eletrônica de varredura. LNCaPs poderia ser observado ligado a ECM e as fibras da matriz (fig. 3A, 3B, e 3C). células LNCaP cultivadas em meios de androgénio empobrecido teve um aumento substancial de alongamento, como quantificada seguinte imagem SEM após 4 dias (Fig. 3B). No entanto, essa alteração morfológica foi impedida de ocorrer quando as células foram cultivadas em meio destituído de androgénio em BM-ECM. Nesta condição as células apareceu a crescer em clusters, resultando em um aumento significativo na circularidade medida (Fig. 3D).

Bloqueio aVp3 limites integrina de ligação à BM-ECM

Em seguida, buscou-se examinar o papel do complexo de integrina avp3 para fixação BM-ECM, porque este complexo integrina tem sido implicada na ligação de ECM e subsequente metástases da medula óssea [21]. Citometria de fluxo rotulagem da superfície celular mostraram pela aVp3 integrina (Fig. 4A). Para determinar a significância funcional, as células em suspensão foram incubadas com um anticorpo bloqueador contra a integrina avp3 ou controlo de isotipo e a fixação de células à BM-ECM foi então medida. Uma diminuição significativa na fixação celular foi medida, o que sugere que a aVp3 integrina, neste caso, desempenha um papel na mediação da ligação a BM-ECM (Fig. 4B).

efeito do LM-ECM em MAPK e PI3K vias de sinalização

para determinar o mecanismo de mediação da resposta dos LNCaPs à BM-ECM examinámos o estado de fosforilação relativa de 46 proteínas a partir de várias vias utilizando um microarray de proteína de fase inversa. Quando a análise de agrupamento hierárquico foi realizada, LNCaPs no BM-ECM em meios de andrógenos empobrecido agrupado mais estreitamente com LNCaPs em meios de crescimento no PTP (Fig. 5A). fosforilação diferencial foi então avaliada entre LNCaPs no BM-ECM em meios de andrógenos empobrecido e LNCaPs em PTP em andrógeno empobrecido mídia, e numerosos proteínas parecia ser diferencialmente fosforilada (Fig. 5B). No entanto, quando também analisou as diferenças de fosforilação entre LNCaPs em PTP em meios de crescimento relação a outros meios esgotados andrógeno várias proteínas foram regulamentados de igual modo (Fig. 5C).