Abstract

Nós relatamos evidência baseada em mecanismo para a anticancerígeno e eficácia quimiopreventivo de [6] -gingerol, o principal princípio ativo da planta medicinal, Ginger (

Zingiber officinale

), em células de cancro do cólon. O composto foi avaliado em duas linhas celulares de cancro de cólon humano para o seu efeito citotóxico e a linha celular mais sensível, SW-480, foi seleccionado para a avaliação mecanicista da sua eficácia anticancerígena e quimiopreventivo. A natureza não-tóxica de [6] -gingerol foi confirmada por ensaios de viabilidade de células que se dividem rapidamente rato normal do cólon. [6] -gingerol inibiu a proliferação celular e a apoptose induzida como evidenciado por externalização de fosfatidilserina em SW-480, enquanto que as células normais de cólon não foram afectadas. Sensibilidade a [6] -gingerol em SW-480 células foi associada com a activação de caspases 8, 9, 3 7 e a clivagem de PARP, que atesta a indução de morte celular apoptótica. Mecanisticamente, [6] -gingerol regulada para baixo de fosforilação de miristato de forbol acetato (PMA) induziu de ERK1 /2 e MAP quinases JNK e de activação do factor de transcrição AP-1, mas teve apenas um pequeno efeito na fosforilação de MAP-quinase p38 e activação de NF -kappa B. Além disso, ele complementou os inibidores de ambos ERK1 /2 ou MAP quinase JNK em reduzir a proliferação celular induzida por PMA em células SW-480. Relatamos a inibição de ERK1 /2 /JNK /AP-1 via como um possível mecanismo por trás da anticancro bem como a eficácia quimiopreventiva de [6] -gingerol contra o cancro do cólon

citação:. E Radhakrishnan, Bava SV , Narayanan SS, Nath LR, Thulasidasan AKT, Soniya VE, et ai. (2014) [6] -Gingerol Induz Caspase-dependente apoptose e impede PMA-induzida proliferação em células cancerígenas do cólon através da inibição da MAPK /AP-1 Sinalização. PLoS ONE 9 (8): e104401. doi: 10.1371 /journal.pone.0104401

editor: Rana Pratap Singh, Jawaharlal Nehru University, Índia |

Recebido: 17 Março, 2014; Aceito: 13 de julho de 2014; Publicação: 26 de agosto de 2014

Direitos de autor: © 2014 Radhakrishnan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

interesses concorrentes:. Rubi John Anto é membro do Conselho Editorial PLOS ONE. Isto não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas e critérios editoriais.

Introdução

O cancro do cólon é o terceiro tipo mais diagnosticado de câncer e a terceira principal causa de mortalidade relacionada ao câncer em Estados Unidos. Globalmente, é a quarta causa mais comum de mortalidade por câncer. As variações no padrão alimentar e aumento dos consumos de carne vermelha e processada contribuir para este aumento na incidência de câncer de cólon [1], [2] procedimentos .Surgical e quimioterapia constitui os principais regimes terapêuticos para o cancro do cólon [3]. O aumento da resistência à droga impede o tratamento do cancro do cólon e os problemas associados com a metástase aumenta a sua gravidade. Pesquisa é sobre para novos agentes terapêuticos que os objectivos vias de sinalização molecular em câncer de cólon, a fim de deter o seu crescimento e metástase.

Ginger (

Zingiber officinale

) tem sido muito utilizado na medicina tradicional e é chamado como “

Maha-aushadhi

” em Ayurveda, que significa “

o grande remédio

” [4]. O rizoma de gengibre contém muitos compostos fenólicos pungente como [6] -gingerol, [6] -shagol, [6] -paradol e zingerone [5] compostos .Estes foram estudados por seu anti-bacteriana, anti-oxidante, anti- propriedades inflamatórias e anti-tumorais [6], [7]. Muitos estudos têm demonstrado as propriedades anti-câncer destes compostos fenólicos contra o câncer de várias origens. O rizoma de gengibre é um ingrediente da dieta diária em muitos países e é um ingrediente ativo em muitos sistemas tradicionais de medicamentos à base de plantas, como a medicina Oriental e Ayurveda, para o gerenciamento de muitas doenças, incluindo indigestão e outros distúrbios gastrointestinais. Este conhecimento tradicional desencadeia um interesse particular em caracterizar a natureza quimio-preventiva e anti-cancerígeno desses compostos fenólicos contra cancros gástricos, como câncer colorretal ou câncer de pâncreas.

Entre estes compostos fenólicos, [6] -gingerol (1- [4′-hidroxi-3′-metoxifenil] -5-hidroxi-3-decanona) foi estudada para os seus efeitos citotóxicos em várias linhas celulares de cancro, incluindo cancro colo-rectal. [6] -gingerol foi mostrado para induzir morte celular na linha celular de cancro do colo do útero, células HeLa, por caspase-3 e apoptose dependente autofagia [8]. Pode inibir a metástase de células MDA-MB-231 de cancro da mama e induzir a apoptose em células de cancro de próstata LNCaP [9], [10]. A administração de [6] -gingerol inibiu o crescimento de vários tipos de tumores de murinos, tais como melanomas, carcinomas de células renais e carcinomas do cólon, aumentando as infiltrações de linfócitos infiltrantes de tumores de células CD4 e células-T CD8 e B220

+ B-células [11]. [6] -gingerol, também foi mostrado para inibir a progressão do tumor de forbol pele induzida por éster em ratinhos ICR [12]. Apenas um número limitado de estudos têm sido publicados sobre as propriedades anti-câncer de [6] -gingerol e seu mecanismo de acção contra o cancro do cólon [13], [14], [15].

Neste estudo, a efeitos citotóxicos de [6] -gingerol sobre SW-480 células cancerígenas do cólon foram comparados com seus efeitos sobre a divisão rápida células epiteliais intestinais normais do mouse. O estudo também realizada uma

In vitro

mecanicista avaliação sobre os efeitos inibitórios de [6] -gingerol de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) induziu sinais anti-apoptóticos em células SW-480.

Materiais e Métodos

2.1. Materiais

meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) foi obtido a partir de Life Technologies (Grand Island, Nova Iorque, EUA); de soro bovino fetal (FBS) a partir de PAN Biotech (GmbH, Aidenbach, Alemanha); Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS), o Factor de Crescimento Epidérmico (EGF) e insulina, transferrina, selénio, solução de piruvato de sódio (ITS-A) a partir da Invitrogen; Os anticorpos contra fosfo-p38, fosfo-ERK1 /2, fosfo-JNK, beta-actina e as caspases foram adquiridos a partir de Cell Signaling (Beverly, MA, EUA) e anticorpos contra poli polimerase ribose do ADP (PARP) foi da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). [6] -gingerol foi comprado de Biomol (Hamburgo, Alemanha). Os inibidores de cinase MAP U0126, SP600125, SB203580 e NF-kappaB inibidor SN50 foram adquiridos a partir de Calbiochem (San Diego, CA). Todos os outros produtos químicos, incluindo de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) foram adquiridos a Sigma Chemicals (St. Louis, MO, EUA).

2,2. cultura de células

linhas de células cancerígenas do cólon humano, SW-480 e HCT116 foram obtidos a partir Centro Nacional de Ciências da pilha (NCCS), Pune, na Índia. As células foram cultivadas em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS), juntamente com 100 U /ml de penicilina, 50 ug /ml de estreptomicina e 1 micrograma /ml de anfotericina B. As linhas de células foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO2 e foram sub-cultivadas duas vezes por semana.

células epiteliais intestinais normais (IECs) foram isolados a partir do cólon do rato de acordo com o protocolo estabelecido [16], [17], com adequada modificações, conforme aprovado pelo Comitê Institucional de Ética animal, Rajiv Gandhi Centro de Biotecnologia de acordo com regras do

Comissão para efeitos de controlo e supervisão de experiências com animais

, Ministério do Ambiente e Floresta do Governo da Índia ( sanção No: IAEC /151 /Ruby /2012). Resumidamente, rato (

albino suíço, 7 semanas de idade, IAEC sancionar No: IAEC /151 /Ruby /2012) cólon foi dissecado e limpos assepticamente com 1 × solução salina equilibrada de Hank (HBSS) para remover a matéria fecal . O intestino foi aberto longitudinalmente e cortada em pedaços de 1 cm e foram incubadas na presença de colagenase de tipo 1 (200 U /ml) durante 30 min com agitação vigorosa. As células epiteliais foram desalojadas isolado por centrifugação do sobrenadante. Estas células foram cultivadas em alta DMEM de glucose com FBS a 10% e 2 × antibióticos, contendo 10 factor de ng /mL de crescimento epidérmico (EGF) e 5 ug /ml de insulina-transferrina-selênio-Piruvato de Sódio (ITS-A) (Invitrogen, EUA ). Esta linha celular foi mantida a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 e foi sub-cultivadas uma vez por mês.

2,3. O tratamento medicamentoso

[6] -gingerol de stock (20 mg /ml) foi preparado em etanol e as concentrações de trabalho foram preparadas por diluição deste stock em sufoxide de dimetilo (DMSO). Para o ensaio de MTT, 5 × 10

3 células /poço de células de cancro do cólon humano e 10

4 células /poço de IECs do rato foram semeadas em placas de 96 poços. As células foram tratadas com [6] -gingerol, durante 48 h, 72 h ou 96 h antes da realização do ensaio de MTT e durante 16 h antes de coloração com anexina-V. PMA (5 mg /ml) foi preparada em DMSO e armazenado a -20 ° C. Em todos os tratamentos de combinação [6] -gingerol foi adicionado 2 horas antes do tratamento com PMA. No ensaio de viabilidade celular /transferência de Western para os tratamentos de combinação com inibidores de MAP quinase (2,5 micromolar U0126, 5 micromolar SP600125, SB203580 1’micromolar) ou inibidor da NF-kappaB (18 micromolar SN50), as células foram primeiro tratadas com o inibidor durante 1 h e subsequentemente pré-tratados com [6] -gingerol, durante 2 h, seguido pela exposição ao PMA durante 48 h antes de realizar um ensaio MTT. Para o deslocamento da mobilidade electroforética Assay (EMSA), 10

6 células de SW-480 foram semeadas em placas de 60 mm, e as células foram pré-tratados com [6] -gingerol, durante 2 h e, em seguida, com PMA durante 30 min.

2.4. A viabilidade das células de ensaio

efeitos citotóxicos de [6] -gingerol foi determinada pelo ensaio MTT como descrito anteriormente [18], e a percentagem de viabilidade celular relativa é expressa como [

570 de poços tratados /Um

570 de poços não tratados × 100].

2.5. Anexina V-iodeto de propídeo coloração

A membrana flip-flop induzida por 16 h de tratamento com [6] -gingerol foi analisado por coloração das células com isotiocianato de fluoresceína conjugado anexina V /PI (Santa Cruz Biotechnology) de acordo com a as instruções do fabricante e as células apoptóticas foram fotografadas com um microscópio de fluorescência [19]. O número total de células no campo microscópico foi contado sob um microscópio de contraste de fase e o número de células fluorescentes no mesmo campo foi contado sob um microscópio fluorescente. A fracção de células fluorescentes ao número total de células é representada como percentagem de células apoptóticas. Isso foi repetido em vários campos do mesmo bem e a média foi levado para plotagem.

2.6. Imunotransferência

A proteína total isolado a partir de células após os tratamentos, com ou sem PMA /[6] -gingerol, foram submetidas a transferência de Western como descrito anteriormente [20]. Em resumo, 60 microgramas de lisado celular total foi separado num gel de poliacrilamida a 10-15%, transferidas para uma membrana de PVDF, sondados com o anticorpo correspondente e detectadas utilizando ECL (Millipore, Billerica, MA, EUA).

2,7. Desvio de mobilidade electroforética Assay (EMSA)

EMSA foi realizado para avaliar a actividade de ligação do ADN de NF-kappa B ou os factores de transcrição AP-1 em células tratadas com PMA e /ou [6] -gingerol, como descrito anteriormente [21]. Resumidamente, 10 ug de proteínas nucleares, isolado a partir de células após tratamento com drogas, foram incubadas durante 30 min com

32P-marcado na extremidade de cadeia dupla 45-mero de oligonucleótidos para o NF kappaB (5’TTGTTACAAGGGACTTTCCGCTGGGGACTTTCCAGGGAGGCGTGG-3 ‘; a 37 ° C) ou oligonucleótido 21-mero para a AP-1 (5’-CGCTTGATGACTCAGCCGGAA-3 ‘; a 30 ° C) e o complexo de proteína de ADN foi resolvido no desnaturante em gel de poliacrilamida não-6,6%, que foi seco e visualizado no Phosphor Imager (Molecular pessoais Imager FX; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA).

2.8. Análise Estatística

Todas as experiências foram realizadas pelo menos em triplicado (n = 3). As barras de erro representam ± desvio padrão (D.P.) dos experimentos. A análise estatística foi realizada utilizando o teste t de Student e os símbolos *, ** e *** representa valores P, p≤0.05, p≤0.005 e p≤0.001 respectivamente.

Resultados

3.1. [6] -gingerol induz citotoxicidade dependente da dose em células cancerígenas do cólon, enquanto as células epiteliais intestinais normais não são afectados

[6] -gingerol foi rastreado para os seus efeitos citotóxicos em SW-480 e as células HCT-116 a várias concentrações variando de 5 micromolar a 300 micromolar, durante 72 h, utilizando o ensaio MTT. mudanças de dose-dependentes na morfologia celular foram claramente evidente sob o microscópio de contraste de fase (Fig. 1A). Os resultados mostra [6] -gingerol ser citotóxicas para ambas as células SW-480 e HCT-116 de uma forma dependente da dose, com citotoxicidade proeminente em concentrações mais elevadas produzem um

valor de IC 50 de 205 ± 5 283 ± micromolar e 7 micromolar , respectivamente (Fig. 1B e a Fig. 1C) .O efeito foi mais proeminente no caso de SW-480 do que HCT116 e, assim, o primeiro foi usado em todos os estudos posteriores. Pelo contrário, os resultados do ensaio de MTT do rato com IECs normais revelou apenas 10-15% de citotoxicidade, mesmo a duas vezes a IC

50 concentração de [6] -gingerol contra número e morfologia celular de células SW-480.The foi visto em grande parte afectadas, mesmo a 500 micromolar de [6] -gingerol (Fig. 2A). Estudando o efeito dependente do tempo de [6] -gingerol, nas concentrações eficazes revelou um aumento na citotoxicidade de células SW-480 ao longo do tempo a partir de 48 h a 96 h, embora a viabilidade de células normais de ratinho do IECs permaneceram inalterados (Fig. 2B) .Estes resultados sugerem a especificidade de [6] -gingerol na indução de citotoxicidade em células cancerosas, sem ser tóxico para as células normais, mesmo em concentrações mais elevadas.

as imagens de microscopia de contraste de fase de alterações morfológicas em células SW-480 (a) quando tratados com as concentrações indicadas de [6] -gingerol, durante 72 h. (B) a viabilidade celular relativa de SW-480 células após [6] -gingerol tratamento, determinado por ensaio de MTT e expressos como percentagem do controlo não tratado. 5000 células /poço de células SW-480 foram tratadas com a concentração indicada de [6] -gingerol, durante 72 h antes do ensaio de MTT. (C) a viabilidade celular relativa de células HCT-116 após [6] -gingerol tratamento. Os resultados são representados como a média de experiências em triplicado ± desvio padrão (SD).

(a) Fase de imagens de microscopia de contraste de IECs tratados com as concentrações indicadas de [6] -gingerol durante 72 h. (B) Tempo efeitos citotóxicos dependentes de [6] -gingerol no SW-480 e IECs em 48, 72 e 96 h. 5000 células /poço de SW-480 e 10.000 células /poço de IECs foram tratados durante 48 a 96 horas com as doses indicadas de [6] -gingerol de ensaio antes da MTT. Os resultados são representados como média ± SD de experiências em triplicado.

3.2. [6] -gingerol induz a apoptose em células cancerígenas do cólon, mas não em células epiteliais intestinais normais

De forma a avaliar se a indução de citotoxicidade por [6] -gingerol é mediado por apoptose, na membrana do flip-flop e externalização de phosphotedylserine foram controlados em células SW-480 [6] -gingerol tratados através da realização de anexina-V /coloração PI. Os resultados de coloração de anexina-V /PI confirmou os primeiros eventos de apoptotis em células SW-480 [6] -gingerol tratados, como evidente a partir do aumento dependente da dose nas células fluorescentes (Fig. 3A) .Os resultados de estudo semelhante realizada em IECs do rato mostrou apenas um número insignificante de células fluorescentes, mesmo a 500 micromolar de [6] -gingerol treatment.100 micromolar 5-fluoro uracilo (5-FU) serviu como controlo positivo para a coloração de anexina V em IECs normais (Fig. 3B ).

(a, painel superior) SW-480 células foram tratadas com as concentrações indicadas de [6] -gingerol, durante 16 h e coradas para a Anexina V /iodeto de propídio PI) positividade (. Verde-fluorescência indica Anexina de ligação à membrana celular danificada V durante a apoptose precoce e a fluorescência vermelha indica a ligação ao ADN exposta PI durante o final de apoptose. (A, painel inferior) representação gráfica da percentagem de células de anexina V /PI positivos SW-480 em relação a [6] -gingerol concentração. (B, painel superior) IECs foram tratadas com até 500 uM de [6] -gingerol, durante 16 h antes de realizar Anexina V-PI coloração. O tratamento com 100 uM de 5-FU foi utilizado como controlo positivo para a indução de apoptose. (B, painel inferior) histograma representativas da percentagem de positivos IECs anexina /PI após o tratamento com [6] -gingerol /5-FU. Os resultados são representados como média de experiências em triplicado ± DP.

Foram também analisadas as extratos de células de SW-480 células tratadas com [6] -gingerol para a activação das caspases-8, 9, 3 , 7 e clivagem de PARP usando experimentos immunoblotting. As caspases são uma família de cisteína proteases que são activadas durante o programa apoptótico. Observou-se uma clivagem significativa de pró-caspase 8 para os seus fragmentos activos (P43 /41) e pro-caspase-9 para os seus fragmentos activos (P35 /37) (fig. 4A e 4B). A activação das caspases efectoras 3 e 7 também foram induzidos por [6] -gingerol de uma forma dependente da dose, clivagem de pro-caspase-3 com os seus fragmentos activos (P17 /19) e aumentar a clivagem do pro-caspase-7 para o seu fragmento activo (p20) (Fig. 4C e 4D). Finalmente, examinámos a clivagem do ADN reparação proteína, PARP, que é um substrato da caspase-3.Upon tratamento das células com 200 e 300 micromolar de [6] -gingerol, a forma de 116 kDa de PARP foi clivado para o 89 fragmento kDa (Fig. 4E), confirmando uma caspase mediada apoptose. Uma vez que 200 micromolar de [6] -gingerol foi eficientemente activar caspases que conduzem a clivagem de PARP e da apoptose, esta concentração foi usada em estudos de sinalização.

SW-480 células (10

6 células /poço) foram tratadas com as concentrações indicadas de [6] -gingerol, durante 48 h e os extractos celulares inteiros foram riscados sobre Ocidental para membrana de PVDF. A activação de caspases e clivagem PARP foram detectadas por sondagem da membrana colocados a hibridar com anticorpos contra a caspase-3, 7, 8, 9 e contra PARP. As manchas foram desenvolvidos usando quimioluminescência aumentada (ECL). As diferenças relativas das bandas de dobragem com os tratamentos de controlo foram quantificadas a partir de análise de volume das bandas utilizando Biorad- Quantity One Software. p-actina serviu como controlo de carga, em cada caso.

3,3. [6] -gingerol inibe a activação das quinases MAP induzida por PMA em SW-480 células

PMA é um promotor de tumores bem conhecido que activa isozimas quase toda a proteína quinase C (PKC), que são reguladores a montante proeminentes de proteína activada por mitogénio (MAP) quinase [22], [23] .Os cinética de fosforilação de Ras //cinase regulada por sinal extracelular Raf (ERK1 /2), c-Jun NH2-terminal cinase (JNK) e a p38 cinase de MAP em células SW-480, em resposta ao tratamento com 50 ng /ml (80 nM) PMA durante intervalos de tempo diferentes foram estudados. A análise por Western blot revelou uma fosforilação dependente do tempo de ERK1 /2, JNK e p38.In todos os três casos, a fosforilação foi evidente em 5 min de tratamento com PMA e que atingiu um máximo aos 30 min e, em seguida, recuado por 120 minutos (Fig. 5A). O efeito de [6] -gingerol na fosforilação transiente induzido por PMA de quinases MAP foi estudada em células tratadas com 30 min com PMA SW-480, pré-tratadas com 200 micromolar [6] -gingerol, durante 2 h. Interessantemente, [6] – gingerol pré-tratamento aboliu a fosforilação transiente induzido por PMA de ERK1 /2 e JNK, quase completamente, mas apenas parcialmente abolida a fosforilação de MAP-quinase p38 em células SW-480 (figura 5B).

(a) durante a noite cultivada células SW-480 foram tratadas com 50 ng /ml de PMA durante intervalos de tempo diferentes (0-120 min) e todo o lisado celular foi imunotransferidas para uma membrana de PVDF, sondado utilizando anticorpos contra fosfo-ERK1 /2, fosfo-JNK e fosfo-p38, desenvolvido por ECL. A cinética da fosforilação induzida por PMA destas quinases MAP foram seguidas a partir deste blot (B) As células SW-480 foram pré-tratadas com 200 uM [6] -gingerol antes do tratamento com 50 ng /ml de PMA durante 30 min e o conjunto Os lisados ​​celulares foram coradas imunologicamente, sondadas e detectado como anteriormente. A diferença dobra relativa de bandas com tratamentos de controle são indicados abaixo de cada pista. β-actina serviu como o controlo de carga, em cada caso. (C) As células SW-480, pré-tratadas com as concentrações indicadas de [6] -gingerol, durante 2 h, foram tratadas com PMA (50 ng /ml) durante 30 min. Os extractos nucleares a partir de cada tratamento foram analisadas para a activação de AP-1 ou (D) NF-kappaB, realizando o ensaio em isótopo sonda marcada com ligação a ADN específica AP-1 /NF-kappaB ligação transcricional e analisando-o em desvio de mobilidade electroforética ensaio (EMSA). A ponta de seta em cada caso indica complexos entre o AP-1 /NF-kappaB e sonda de DNA.

3.4. [6] -gingerol inibe a actividade de ligação da transcrição de PMA induzido por AP-1, mas não NF-kappaB, em SW-480

PMA é um activador bem conhecido dos factores de transcrição AP-1 e NF-kB kappaB em células de cancro diferentes [24], [25], [26], [27]. Para determinar a actividade de ligação transcricional de AP-1 em SW-480, induzida em resposta ao PMA, o extracto nuclear das células tratadas com 50 ng /microlitro PMA durante 1 h foi usada para EMSA. Uma dose activação dependente clara de AP-1 foi observada em células SW-480 após tratamento com PMA (Figura 5C;. A pista 5) .A dependente da dose sub-regulação deste PMA induzido por AP-1 a ligação foi observada após 2 horas de pré -Tratamento com [6] -gingerol (Fig 5C;. pista 6-8). [6] -gingerol pré-tratamento não mostrou um efeito drástico sobre a propriedade de ligação transcricional de NF-kappaB, embora não houvesse uma inibição significativa do seu DNA de ligação a 300 micromolar [6] -gingerol (Fig 5D;. Pista 6-8 ).

3.5. [6] -gingerol inibe a proliferação celular induzida por PMA em SW-480 através da inibição das vias de ERK1 /2 e JNK MAP quinase

De modo a entender melhor os detalhes mecanísticos atrás os efeitos inibidores de [6] – gingerol em vias de sinalização activadas com PMA-em SW-480, a viabilidade e a proliferação de células SW-480 foram monitorizadas pelo ensaio de MTT, após tratamento com várias combinações de PMA, [6] -gingerol e inibidores de quinases MAP ou NF-kappaB. Primeiramente, o tratamento de PMA aumentou a proliferação de células SW-480 significativamente. Mas, [6] -gingerol pré-tratamento das células trazidos para baixo o PMA induz a proliferação drasticamente. No entanto, a viabilidade de células SW-480 após [6] -gingerol tratamento eram comparativamente mais elevada em presença de PMA (Fig. 6A).

(A) As células SW-480 durante a noite cultivadas foram pré-tratados com inibidores ( U0126, SP600125, SB203580 para /2, JNK e p38 MAP-quinases ERK1, respectivamente, ou SN50 para o NF-kappaB) durante 1 h e, em seguida, tratou-se com [6] -gingerol, durante 2 h, seguido pela exposição ao PMA durante 48 h, antes de realizando ensaio de viabilidade celular utilizando MTT. A viabilidade relativa das células SW-480 em cada tratamento representada como percentagem do controlo não tratado. Os valores apresentados são a média de experiências em triplicado ± DP. Total de lisados ​​de células tratadas com a combinação de [6] -gingerol com inibidores (B) U0126 e (C) SP600125 e de tratamentos de controlo apropriadas foram Ocidental Blotted e sondadas com anticorpo anti-caspase-3 e as manchas foram desenvolvidas utilizando ECL. Beta-actina serviu como o controle de carregamento.

Em seguida, realizamos os mesmos experimentos em SW-480 células pré-tratadas com inibidores de membros da MAP quinase família e NF-kappaB. U0126 foi utilizado como inibidor específico de ERK1 /2 via, SP600125 como um inibidor da activação de JNK e SB203580 como o inibidor de MAP-quinase p38 pathway.SN50 foi utilizado como um inibidor do factor de transcrição NF-kappaB. Nenhum dos inibidores acima tiveram qualquer efeito citotóxico nas células SW-480, na concentração testada (Fig. 6A). Mas, pré-tratamento com U0126 e SP600125 reduziu significativamente a proliferação induzida por PMA de SW-480 células para estender a mesma, embora em menor grau, em relação a [6] -gingerol pré-tratamento (Fig. 6A). Estes resultados provam o papel essencial das quinases ERK1 /2 e JNK MAP vias na indução da proliferação de células SW-480 na presença de PMA. Pré-tratamento com SB203580 SN50 e teve pouco efeito sobre a proliferação induzida por PMA de células SW-480 (Fig. 6A), provando a falta de envolvimento da via da cinase MAP p38 e o factor de transcrição NF-kappaB neste processo.

Finalmente, [6] -gingerol tratamento foi realizada em células SW-480 pré-tratadas com cada um dos inibidores acima antes da indução com PMA. Surpreendentemente, em cada caso, a viabilidade celular foi reduzida para um nível semelhante ao do pré-tratamento com apenas [6] -gingerol antes do tratamento com PMA. Este resultado sugere que, em presença de U0126, [6] -gingerol, complementa a presente inibidor de ERK1 /2 por revoga a activação de JNK MAP-cinase e, em presença de SP600125 que inibe a activação de ERK1 /2, reduzindo assim a viabilidade celular para a mesma nível em ambos os casos. Na presença de inibidores de SB203580 e SN50 [6] -gingerol exerce os seus efeitos inibidores nos dois ERK1 /2 e vias JNK MAP quinase, assim, reduz a viabilidade das células para o mesmo nível como acima. Estes resultados atestam a contribuição igual de ambos os ERK1 /2 e JNK vias da cinase MAP em [6] -gingerol inibição mediada por proliferação celular induzida por PMA de SW-480. Uma vez que não há efeitos aditivos ou sinérgicos inibitórios sobre a proliferação de células SW-480-tratadas com PMA resultantes do pré-tratamento com a combinação de [6] -gingerol com U0126 ou SP600125, em comparação com pré-tratamento com [6] -gingerol sozinho , ERK1 /2 e via JNK MAP quinase parece ser as principais vias de sinalização afectadas pela [6] -gingerol durante a inibição da proliferação de células induzida por PMA em SW-480.

de forma a testar se os efeitos inibitórios sobre a proliferação celular induzida por PMA de SW-480 células por [6] -gingerol e U0126 ou SP600125 foram apoptose mediada, que monitorizada a activação de caspase 3 a partir de cada um destes tratamentos por Western blotting. Observou-se a clivagem do procaspase 3, em todos os tratamentos envolvendo [6] -gingerol, U0126 ou SP600125 e na combinação de [6] -gingerol e estes inibidores (Fig. 6B e 6C). Foi também interessante notar que nenhuma degradação adicional da banda mãe caspase 3 foi produzida quando os inibidores e a gingerol foram usados ​​em conjunto. Isto atesta que a sub-regulação de ERK1 /2 /JNK /AP-1 induzida por PMA via, é responsável pelos efeitos inibitórios de [6] -gingerol sobre a proliferação celular induzida por PMA em SW-480.

discussão

anti-câncer e propriedades anti-inflamatórias de [6] -gingerol tem sido reconhecida desde há muito e muitos estudos têm relatado diferentes mecanismos moleculares por trás dessas propriedades. Os efeitos inibidores de [6] -gingerol contra cancros de diversas origens foram relatados anteriormente. [6] -gingerol demonstrou ser particularmente eficaz contra o carcinoma da pele e na inibição da angiogénese em células endoteliais [28], [29]. Gengibre ser um suplemento dietético e um ingrediente importante em muitos medicamentos tradicionais, é lógico para estudar os efeitos de [6] -gingerol sobre o cancro do tracto gastro-intestinal, tais como cancro do cólon. Além disso, os estudos de farmacocinética nos componentes activos de gengibre a partir de extractos de gengibre administrados por via oral em seres humanos detectados níveis significativos de uma [6] -gingerol, quer na forma livre ou conjugada, em tecidos do cólon e do plasma [30], [31]. Outro estudo sobre a biodisponibilidade de [6] -gingerol em ratos sugerem que, quando administrada por via oral é detectado a concentrações de 4,3 ug /ml no plasma em dez minutos após a administração. O mesmo estudo também determinada a sua distribuição elevada nos tecidos com concentração mais elevada em tecidos do tracto gastrointestinal. O tecido a razão de plasma de [6] -gingerol foi relatado para ser 1 e foi atribuída à sua lipofilicidade [32]. Todos esses fatos apoiar um estudo sobre os efeitos anti-câncer de [6] -gingerol sobre o câncer de cólon.

A primeira década de 21

século teve um aumento do número de estudos sobre a caracterização dos mecanismos por trás do anti efeitos -Câncer de fitoquímicos. Estudos sobre a avaliação mecanicista de propriedades anti-câncer de [6] -gingerol contra diferentes tipos de cânceres fornecidas informações valiosas sobre seus múltiplos mecanismos de ação em trazer citotóxicos ou pró-apoptóticos efeitos em células cancerosas. Alguns relatórios recentes sobre as actividades anti-câncer de [6] -gingerol contra o câncer de cólon apresentaram diferentes mecanismos para a sua acção em diferentes linhas celulares de cancro do cólon [13], [14], [15], [33]. O presente estudo sobre a linha de células SW-480 demonstra o

in vitro

citotoxicidade de [6] -gingerol com um IC

50 valor de 205 micromolar. O estudo anterior sobre

in vitro

efeitos citotóxicos de [6] -gingerol na linha de células SW-480 relataram apenas a morte celular de 17% a esta concentração [13] diferenças .Estes na magnitude dos efeitos pode ser devido a as variações no método utilizado no estudo da citotoxicidade. É também digno de nota que o mesmo estudo relatou somente 13% de citotoxicidade em células LoVo quando tratados com 200 micromolar de [6] -gingerol, durante 72 h, o que mais tarde foi relatado num estudo diferente, como 75% a 50 micromolar na mesma linha celular após 48 h de tratamento [15]. O aumento dependente da dose em células apoptóticas (células positivas Anexina-V /PI) em SW-480 células por tratamento com [6] -gingerol, até 25 dobras em concentração de 300 ^ M, revelou-se que a citotoxicidade foi induzida principalmente por apoptose. Estudos anteriores relataram ambos detenção do ciclo celular e apoptose, como o mecanismo de acção de [6] -gingerol [13], [34]. aumento de duas vezes na apoptose foi relatado em condições semelhantes em SW-480 [13], mas eles também demonstraram significativa G2 /M no ciclo de captura de células em resposta a [6] -gingerol tratamento. Muitos relatórios anteriores sugeriram que a [6] -gingerol induz a apoptose apenas no ou perto de 300 micromolar em células cancerosas [13], [34], [35], [36] e abaixo desta concentração que induz citotoxicidade principalmente por outros mecanismos. No entanto, observou-se células fluorescentes no SW-480 tratadas com ainda 100 micromolar [6] -gingerol, sugerindo claramente os eventos de apoptose início mesmo em concentrações inferiores. Além disso, a activação dependente da dose de caspases-8,9, 3 e 7 no nosso estudo confirmou ainda a apoptose como o principal mecanismo de morte celular em SW-480 células tratadas com [6] -gingerol. Activação de caspase-9 por [6] -gingerol confirma o envolvimento da via mitocondrial em [6] -gingerol-apoptotis mediada. No entanto, a clivagem de caspase-8 induzida por [6] -gingerol não pode essencialmente sugerem o envolvimento de uma via mediada por receptores, como via mitocondrial poderia também conduzir a clivagem de caspase-8 por meio de clivagem de BH3 agonista morte interagindo-domínio (BID ) [37]. A indução de apoptose em SW-480, uma linha celular de cancro do cólon p53 mutante, por [6] -gingerol é particularmente interessante como células p53 mutantes são considerados como sendo mais resistente aos agentes quimioterapêuticos padrão e radiação [13], [36]. indução independente de p53 de apoptose por [6] -gingerol foi relatado previamente em linhas celulares de cancro do pâncreas, onde a expressão do inibidor de quinase dependente de ciclina-, p21

CIP1, foi aumentada independente da expressão de p53 conduz à diminuição da ciclina A e