Sumário

Fundo

factor de transcrição relacionados com o Runt

3 (RUNX3) é um supressor de tumor de cancro e parece ser um importante componente do factor de crescimento transformante-beta (TGF-ß ) via supressão do tumor induzida. Surpreendentemente, descobrimos que o nível de expressão de RUNX3 em tecidos de carcinoma de células escamosas do pescoço (carcinoma epidermóide) de cabeça e, o que é um dos tipos mais comuns de cancro humano, foi maior do que em tecidos normais por um conjunto de dados de microarray publicado anteriormente no nosso estudo preliminar. Portanto, aqui nós examinamos o papel oncogênico de RUNX3 para CECP.

principais conclusões

expressão RUNX3 frequente e sua correlação com o comportamento maligno foram observadas em CECP. Ectópica superexpressão RUNX3 promovido o crescimento de células e soro inibiu a apoptose induzida por fome e drogas apoptose induzida quimioterapêutico em células de CECP. Estes resultados foram confirmados por knockdown RUNX3. Além disso, de RUNX3 sobre-expressão aumentada tumorsphere formação. nível de expressão RUNX3 foi bem correlacionada com o estado de metilação em células de CECP. Além disso, a expressão RUNX3 foi baixa devido à metilação do seu promotor em células epiteliais orais normais.

Conclusões /Significado

Nossas descobertas sugerem que i) RUNX3 tem um papel oncogênico em CECP, ii) expressão RUNX3 observada em HNSCC pode ser causada em parte por desmetilação durante o desenvolvimento do câncer, e iii) a expressão RUNX3 pode ser um marcador útil para prever o comportamento maligno e o efeito de drogas quimioterápicas em HNSCC

Citation:. Tsunematsu T, Kudo Y, Iizuka S, Ogawa I, Fujita T, H Kurihara, et al. (2009) RUNX3 Tem um papel oncogênico em Câncer de Cabeça e Pescoço. PLoS ONE 4 (6): e5892. doi: 10.1371 /journal.pone.0005892

editor: Torbjorn Ramqvist, Karolinska Institutet, na Suécia

Recebido: 04 de fevereiro de 2009; Aceito: 15 de maio de 2009; Publicação: 12 de junho de 2009

Direitos de autor: © 2009 Tsunematsu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. A pesquisa foi apoiado por bolsas-in-Aid do Ministério da educação, Ciência e Cultura do Japão (YK e TT) e educação e pesquisa Satake concessão (YK). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

RUNX3 /AML2 /PEBP2C /CBFA3 é um fator de transcrição e um da família relacionados com o Runt (RUNX). Três membros dos genes da família Runx,

RUNX1

,

Runx2

e

RUNX3

e gene relacionado,

CBFB /Pebpb2

, são todos conhecidos como os reguladores de desenvolvimento e têm mostrado ser importante em cancros humanos [1]. RUNX3 foi originalmente clonado como AML2 e é localizado no cromossoma 1p36.1 [2]. RUNX3 tem múltiplas funções e foi a primeira relatou correlacionar-se com a gênese e progressão do cancro gástrico humano como um supressor de tumor [2]. RUNX3-nulo ratinhos exibem hiperplasia da mucosa gástrica como um resultado da proliferação estimulada e a apoptose de células epiteliais suprimida [3]. Na verdade, é inactivado RUNX3 em mais de 80% de cancro gástrico humano por silenciamento do gene e proteína mislocalization [4]. Além do cancro gástrico, tem sido relatado que a expressão reduzida de RUNX3 foi observado em vários cancros, incluindo o da bexiga, fígado, colo-rectal e os cancros do pulmão [5] – [8]. Nestes tumores, a expressão reduzida de RUNX3 foi frequentemente causada por hipermetilação ilha CpG [9]. Além disso, mutações pontuais de

RUNX3

foram observados em certo tipo de cancros humanos incluindo cancros gástricos e da bexiga [3], [5]. Tomados em conjunto, os atos RUNX3 como um supressor do tumor em vários tipos de câncer.

Cabeça e carcinoma de células escamosas do pescoço (CECP) é um dos tipos mais comuns de câncer humano, com uma incidência anual de mais de 500.000 casos em todo o mundo [ ,,,0],10]. Como a maioria dos cancros epiteliais, HNSCC desenvolve através da acumulação de múltiplas alterações genéticas e epigenéticas em um processo multi-passo [11]. Surpreendentemente, descobrimos que o nível de expressão em tecidos de RUNX3 CECP foi maior do que em tecidos normais por um conjunto de dados de microarray anteriormente publicada de 41 pacientes CECP e 13 controlos normais no nosso estudo preliminar [12] (Figura 1A). Curiosamente, tem sido relatado recentemente que a sobre-expressão de RUNX3 foi observada no carcinoma de células basais da pele [13]. Portanto, pensamos que RUNX3 pode ter um papel oncogénica em HNSCC, bem como em carcinoma de células basais da pele. No presente estudo, examinamos a expressão e papéis de RUNX3 para o desenvolvimento HNSCC

A:. RNA total de 41 HNSCC primária e 13 tecidos normais foi marcado e hibridado com Affymetrix U133A Gene chips conforme relatado anteriormente. Gráfico mostra a média da intensidade do sinal de RUNX3 em 41 CECP e 13 tecidos normais na análise de microarray. nível de expressão de RUNX3 em HNSCC é maior do que a dos tecidos normais. B: Expressão de ARNm de RUNX3 em 14 linhas de células de carcinoma epidermóide (HSC2, HSC3, HSC4, Ca9-22, HO-1-N-1, HO-1-L-1, ZA, HOC719-PE, HOC719-NE, ​​HOC621, HOC119, HOC313, TSU e OMI) por RT-PCR. GAPDH foi usada como um controlo. C: Expressão de ARNm de RUNX3 em várias linhas celulares de cancro, incluindo o cancro do cólon (RKO e HCT116), cancro gástrico (MKN-1 e MKN-45), leucemia (HL60), linfoma (U937) e cancro da mama (MCF7 e SK-BR3 ). GAPDH foi usada como um controlo. D: Expressão de ARNm de RUNX3 em 18 casos CECP por RT-PCR. GAPDH foi usada como um controlo. E: A expressão da proteína de RUNX3 em 6 linhas de células de carcinoma epidermóide (HSC2, HSC3, HSC4, Ca9-22, HO-1-N-1 e HO-1-L-1) foi analisada por análise de transferência de Western. expressão Cul1 foi usado como um controle de carga.

Materiais e Métodos

Reagentes

Transformando SS1 crescimento fator (TGF-ß), fator de crescimento de fibroblastos básico (bFGF ) e derivado de plaquetas do factor de crescimento AA (FCDP-AA) foram obtidos a partir de R D systems (Minneapolis, MN). factor de crescimento semelhante a insulina (IGF) foi obtido a partir de Sigma (Saint Louis, MO). factor de crescimento epidérmico (EGF) foi obtido a partir de Pepro tech CE (Londres, Reino Unido). Adriamicina (cloridrato de doxorrubicina) foi obtido a partir de Sigma.

As linhas celulares e amostras de tecido

linhas de células de carcinoma epidermóide (HSC2, HSC3, HSC4, Ca9-22, HO-1-L-1 e Ho -1-N-1) foram fornecidas pela colecção japonesa de Bioresources Cell Research Banco. linhas de células de carcinoma epidermóide (ZA, HOC719-PE, HOC-719-NE, ​​HOC621, HOC119, HOC313, TSU e OMI) foram gentilmente cedidas pelo Dr. Kamata (Universidade de Hiroshima). linhas celulares de cancro gástrico, linhas (MKN-1 e MKN-45) de câncer de cólon celulares (RKO e HCT116), linhas celulares de cancro da mama (MCF7 e SK-BR3), linha de células de linfoma (U937) e linha de células de leucemia (HL-60 ) foram fornecidas pela coleção japonesa dos recursos biológicos pesquisa do Banco Cell. Eles foram mantidos em meio RPMI-1640 ou de Dulbecco Modified Eagle Médium (Nissui Pharmaceutical Co., Tóquio, Japão) suplementado com FBS inactivado por calor a 10% (Invitrogen) e 100 U /ml de condições de penicilina-estreptomicina (Gibco), sob de 5% de CO

2 no ar a 37 ° C. Para o ensaio de crescimento, 5000 células foram plaqueadas em placas de 24 poços (Falcon), e as células tripsinizadas contados a 0, 2, 4, 6 dias por Cell Counter (Coulter Z1). tecidos língua dos embriões de ratinho no dia embrionário ratinhos BALB /c de idade de 15,5 e 10 semanas foram utilizados para a histologia e imuno-histoquímica. Os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Animal da Universidade de Hiroshima.

As amostras de tecido de HNSCC foram recuperados do Registro Patologia Cirúrgica do Hospital Universitário de Hiroshima, após a aprovação pelo Comitê de Ética do Hospital Universitário de Hiroshima. Cada paciente deu consentimento informado por escrito. Cinquenta e dois casos de carcinoma epidermóide e 9 tecidos mucosos orais normais foram utilizados neste estudo. Cinco tecidos de câncer de cólon também foram utilizados para análise imuno-histoquímica (gentilmente cedido pelo Dr. Shimamoto, Universidade da Prefeitura de Hiroshima).

10% tamponada-fixados em formalina e embebidos em parafina tecidos foram usadas para exame imuno-histoquímico. O grau histológico e estágio do tumor foram classificados de acordo com os critérios da Sociedade Japonesa de Câncer de Cabeça e Pescoço. Amostras frescas foram tomadas a partir dos tecidos CECP para análise RT-PCR.

RT-PCR

O ARN total foi isolado a partir de culturas de células confluentes utilizando o Kit RNeasy Mini (Qiagen). As preparações foram quantificadas e a sua pureza foi determinada por métodos padrão espectrofotométrico. O ADNc foi sintetizado a partir de ARN total de 1 ug de acordo com a traço ReverTra (Toyobo Biochemicals, Tóquio, Japão). A amplificação por PCR de RUNX3 foi feito usando a frente iniciador; 5′-CAGAAGCTGGAGGACCAGAC-3 ‘e iniciador inverso; 5’-TCGGAGAATGGGTTCAGTTC-3 ‘. GAPDH foi usada como um controlo. Alíquotas de ADNc totais foram amplificados com o Go Master Mix verde Taq® (Promega), e as amplificações foram efectuadas num termociclador PC701 (Astec, Fukuoka, Japão) por 30 ciclos, após uma desnaturação inicial de 30 segundos a 94 ° C, durante 30 recozido s a 60 ° C, e estendido durante 1 min a 72 ° C em todos os iniciadores. Os produtos de reacção de amplificação foram resolvidos em 1,5% de agarose gels /TAE (Nacalai tesque, Inc., Kyoto, Japão), a electroforese a 100 mV, e visualizados por coloração brometo de etídio.

Western blot análise

transferência de Western foi realizada como descrito anteriormente [14]. Foram utilizados um anticorpo monoclonal anti-RUNX3 (R3-5G4, gentilmente fornecido pelo Dr. Ito, Instituto de Biologia Molecular e Celular, Singapura), anticorpo monoclonal anti-FLAG (M2, Sigma) e anticorpo policlonal anti-Cul1 (Zymed). Trinta ug de proteína foi sujeito a electroforese em gel de poliacrilamida a 10%, seguido de electrotransferência para um filtro de nitrocelulose. Para a detecção do, o sistema de detecção de ECL Western blotting imuno-complexo (Amersham) foi usada.

imuno coloração

a detecção imuno-histoquímica de RUNX3 em casos CECP foi realizada em 4,5? M secções montadas em silício -Revestido lâminas de vidro, utilizando uma técnica de peroxidase de estreptavidina-biotina, tal como descrito anteriormente [14]. detecção imuno-histoquímica de RUNX3 em vários casos de cancro humanas, incluindo 3 tipos de câncer de esôfago, 3 cancros gástricos, 3 cancros do cólon, 3 tipos de câncer do reto, 3 tipos de câncer de pâncreas, 3 cancros do fígado, 3 cancros do pulmão, 3 cancros do rim, 3 cancros da bexiga, e 4 tipos de câncer do útero foi realizada utilizando microarrays de tecido (MBL Co., Ltd., Nagoya, Japão). Para o estudo imuno-histoquímico, foi utilizado um anticorpo monoclonal anti-RUNX3 (R3-6E9, gentilmente cedido pelo Dr. Ito, Instituto de Biologia Molecular e Celular, Singapura). Para o estudo imuno-histoquímica de tecidos de ratinho, utilizou-se um anticorpo monoclonal anti-RUNX3 (R3-1E10, a MBL Co. Ltd.). A expressão de RUNX3 foi classificado como positivo (acima de 5% de tumor ou células epiteliais mostrou imunopositividade) e negativo (menos do que 5% das células epiteliais do tumor ou imunopositividade mostrou fraca ou focal ou sem coloração). Três patologistas (Y.K., I.O., e T. T.) fez todas as avaliações. correlação possível entre variáveis ​​das amostras de tumores analisados ​​foi testado para a associação pelo teste exato de Fisher. Um

P

valor 0,05 foi necessário para significância

tratamento

5-aza-2′-desoxicitidina

HSC4 células e células epiteliais normais foram tratadas com meio contendo 300 nM. 5-aza-2′-desoxicitidina (5-aza-dC, Sigma) durante 72 h. Após o tratamento, as células foram colhidas e examinadas a expressão de ARNm de RUNX3 por RT-PCR.

modificação de bissulfito e de metilação específico de reacção em cadeia da polimerase (PCR)

O ADN genómico a partir de células ou tecidos foi extraída utilizando o kit DNeasy (Qiagen, Hilden, Alemanha). Cinquenta microlitros do sobrenadante foram usadas directamente como uma fonte de DNA para o tratamento com bissulfito de sódio. As amostras de ADN foram tratadas com bissulfito para converter todas as citosinas não metiladas em uracilos, enquanto as citosinas metiladas deixando inalterados. O ADN foi desnaturado com NaOH (concentração final, 0,2 M) durante 10 min a 37 ° C. Trinta ul de hidroquinona 10 mM (Sigma) e 520 ul de H 3 bissulfito de sódio (Sigma) a pH 5,0 quer preparada de fresco, foram adicionados e misturados, e as amostras foram incubadas a 50 ° C durante 16 h. DNA modificado foi purificado utilizando Assistente resina de purificação de ADN (Promega) e eluída em 50 ul de água. A modificação foi terminada com NaOH (concentração final, 0,3 M) de tratamento durante 5 min à temperatura ambiente, seguido por precipitação com etanol. DNAs modificados foram amplificados num volume reaccional de 20 ul contendo tampão de 2 mL de 10 x de PCR com MgCl 2 15 mM, 4 uL 5xQ-Solução, 10 pM de cada iniciador, dNTP 0,2 mM e 0,75 U de Taq polimerase (polimerase HotStar Taq ADN; Qiagen, Hilden, Alemanha). Depois a mistura foi aquecida a 95 ° C durante 15 min, a PCR foi realizada em um termociclador (GeneAmp 2400; PE Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) durante 35 ciclos de desnaturação a 94 ° C durante 30 seg, emparelhamento a 58 ° C durante 60 segundos, e extensão a 72 ° C durante 60 seg, seguido por uma extensão final de 10 min a 72 ° C. Os produtos de PCR foram separados num gel de poliacrilamida não desnaturante de 8%. RUNX3 ilha CpG e regiões analisados ​​(n ° 1-10) são mostradas na Figura 2B. Os conjuntos de iniciadores utilizados neste estudo foram listados na Tabela S1 (GenBank número de acesso AL023096) [15]

A:. Expressão de RUNX3 foi analisada no epitélio da pele (× 100 e × 250, painel superior), o normal mucosa oral (× 100 e × 250, painel do meio) e mucosa oral normal com a infiltração de células inflamatórias crónicas (× 100 e × 250, painel inferior). Em epitélio da pele, algumas das células da epiderme mostraram expressão de RUNX3 nas suas núcleos. Em tecidos da mucosa oral normal, apenas algumas células epiteliais da camada basal expressa RUNX3 em seus núcleos, ea maioria das células epiteliais não expressou RUNX3. Na mucosa oral normal com a infiltração de células inflamatórias crónicas, linfócitos infiltrantes em mucosa oral mostrou expressão de RUNX3. B: Expressão de RUNX3 foi analisado em casos CECP (100 ×). A maioria das células cancerosas expressa RUNX3 em seus núcleos.

Geração de células CECP RUNX3-superexpressão

Um plasmídeo de expressão RUNX3, bandeira pcDNA3 que codifica marcado cDNA RUNX3, foi gentilmente cedido pelo Dr. Ito (Instituto de Biologia Molecular e celular, Singapura). O RUNX3 /plasmídeo pcDNA3 ou o vector sozinho foi introduzido em células HSC3, e, em seguida, G418 (500 ug /mL, Gibco) foi adicionado ao meio de cultura após 48 horas de transfecção. Após 2 semanas de selecção com G418, foram obtidos os clones estáveis ​​piscina. transfecções celulares foram realizadas utilizando FuGENE 6 (Roche) de acordo com as instruções do fabricante.

Silencing por pequeno ARN interferente

logaritmicamente crescentes Ca9-22 células foram semeadas a uma densidade de 10

5cells /disco de 6 cm e transfectadas com oligos duas vezes (em 24 e 48 h após a replating) usando Oligofectamine (Invitrogen) como descrito [16]. Quarenta e oito horas após a última transfecção, os lisados ​​foram preparados e analisados ​​por SDS-PAGE e imunotransferência. O siARN é um oligorribonucleótido duplex de 19 pb com uma cadeia de sentido directo correspondente aos nucleótidos 275-293 da sequência de ARNm de RUNX3 humano; 5′-ccuucaaggugguggcauu-3 ‘. Uma sequência mexidos que não mostra homologia significativa com sequências de rato, ratinho ou o gene humano foi usado como controlo.

análise de citometria de fluxo

a distribuição do ciclo celular foi determinada por análise do conteúdo de DNA após iodeto de propídio coloração. As células foram cultivadas tal como descrito acima, e fixadas em etanol a 70% e armazenadas a 4 ° C antes da análise. Determinação por citometria de fluxo do teor de ADN foi analisada por FACS Calibur um (Becton-Dickinson, San José, CA) citómetro de fluxo. Para cada amostra, 20000 eventos foram armazenados.

Anexina V e iodeto de propídio dupla coloração Ensaio

Após privação de soro ou tratamento Dox, as células foram então coradas com isotiocianato de fluoresceína (FITC) -conjugated Anexina V e iodeto de propídio (PI), utilizando o kit de anexina V-FITC Apoptosis Detection (Becton-Dickinson) de acordo com as instruções do fabricante. As células apoptóticas foram identificados por coloração dupla com recombinante conjugado com FITC com Anexina V e iodeto de propídio (PI). aquisição e análise de dados foram feitas em um FACSCalibur (Becton-Dickinson) citometria de fluxo utilizando software CellQuest.

Resultados

Altamente expressão de RUNX3 em HNSCC

Primeiro, examinamos a expressão de RUNX3 em 14 linhas de células de carcinoma epidermóide (HSC2, HSC3, HSC4, Ca9-22, HO-1-L-1, HO-1-N-1, ZA, HOC719-PE, HOC719-NE, ​​HOC621, HOC119, HOC313 , TSU e OMI). ARNm de RUNX3 foi observada em 9 de 14 linhas de células de carcinoma epidermóide (Figura 1B). Em certos tipos de cancros humanos, incluindo o da bexiga e gástrica, tem sido relatado observou-se que as mutações pontuais de RUNX3 [3], [5]. No entanto, não há mutações foram encontrados em linhas de células de carcinoma epidermóide com expressão de ARNm de RUNX3 (Ca9-22, HO-1-L-1 e Ho-1-N-1) (dados não mostrados). a expressão de ARNm de RUNX3 foi também examinada em várias linhas celulares de cancro, incluindo o cancro do cólon (RKO e HCT116), cancro gástrico (MKN-1 e MKN-45), leucemia (HL60), linfoma (U937) e cancro da mama (MCF7 e SK-BR3 ) (Figura 1C). células RKO, MCF7 e SK-BR3 não expressaram mRNA RUNX3. Como relatado anteriormente, a expressão de RUNX3 foi bem correlacionada com o estado de metilação, excepto para as células SK-BR3 [17] – [20]. Em células SK-BR3, down-regulação da RUNX3 é pensado para ser causado por mecanismo desconhecido [20]. Também examinamos a expressão de mRNA RUNX3 em 18 tecidos CECP. Em 13 dos 18 (72,2%) tecidos CECP, a expressão do mRNA RUNX3 foi observado (Figura 1D). Em seguida, a expressão da proteína de RUNX3 foi analisada por análise de Western blot em 6 células (CECP HSC2, HSC3, HSC4, Ca9-22, HO-1-L-1 e HO-1-N-1) (Figura 1E). Entre eles, as células Ca9-22, HO-1-L-1 e Ho-1-N-1 de RUNX3 expresso proteína, correspondente a expressão de mRNA. Em seguida, examinamos a expressão RUNX3 em 9 tecidos da mucosa oral normal e 52 casos CECP por imuno-histoquímica. Primeiro, usamos epitélio da pele e da mucosa do cólon para a reactividade de expressão RUNX3. Como mostrado no relatório recente [13], as células epidérmicas também mostraram expressão de RUNX3 em seus núcleos (Figura 2A, painel superior). Nós também examinaram a expressão RUNX3 em câncer de cólon. No cancro do cólon, RUNX3 é pensado para ser um gene supressor de tumores [18]. Como relatado anteriormente [18], expressão de RUNX3 foi observada nos seus núcleos de mucosa normal, enquanto que as células de cancro do cólon não expressar RUNX3 (Figura S1). Em tecidos da mucosa oral normal, apenas algumas células epiteliais da camada basal expressa ligeiramente RUNX3 em seus núcleos, ea maioria das células epiteliais não expressam (Figura 2A, painel do meio). Linfócitos infiltrados em mucosa oral normal mostraram expressão RUNX3 (Figura 2A, painel inferior). Imunopositividade de RUNX3 em linfócitos foi utilizada como um controlo positivo de coloração. Por outro lado, a maioria das células cancerosas expressaram RUNX3 em seus núcleos (Figura 2B). Nós também confirmou que a expressão nuclear de RUNX3 usando fracção nuclear e citoplasmática de linhas de células de carcinoma epidermóide, indicando que não há mislocalization proteína (dados não apresentados). expressão RUNX3 foi frequentemente observada em 50% (26 de 52) dos casos de CECP (Tabela 1). Além disso, comparamos a expressão RUNX3 com achados clínico-patológicos incluindo diferenciação, invasão e metástase. Curiosamente, a expressão RUNX3 foi bem correlacionada com comportamentos malignas incluindo mal diferenciação, invasão e metástase (Tabela 1).

Padrão de metilação de

RUNX3

foi bem correlacionada com a sua expressão de mRNA em HNSCC

Pedimos como expressão RUNX3 foi causada por para CECP. redução da expressão de RUNX3 foi frequentemente causada por CpG ilha hipermetilação em vários tipos de câncer [9]. De facto, a expressão de RUNX3 foi observada em células sem expressão de RUNX3 HSC4 após o tratamento com 5-aza-2′-desoxicitidina (Figura 3A). Homma et ai. examinou o estado de metilação de múltiplas regiões do

RUNX3

promotor CpG ilha (3478 pb) dentro do promotor proximal (No. 1-10) em cancros gástricos e descobriu que a metilação na região que abrange o local de início da transcrição (Sem . 5-8) é crítica para a perda da expressão de RUNX3 (Figura 3B) [15]. Para examinar o

RUNX3

estado de metilação em CECP, analisamos a metilação do

RUNX3

em todas as regiões promotoras (N.º 1-10) por PCR específicos de metilação no painel de linhas celulares CECP (Figura 3C e 3D). CECP células com expressão de RUNX3 demonstrou unmethylation ou parcialmente metilação na região N ° 5-8 (Figura 3D). células CECP sem expressão RUNX3 mostrou totalmente metilação na No. 5 e nº 6 região. Assim, estado de metilação do

RUNX3 e região promotora foi bem correlacionada com a expressão de mRNA RUNX3 em linhas celulares CECP

A:. Expressão RUNX3 foi examinado após 5-aza-2′-desoxicitidina (5 -Aza) de tratamento. HSC4 células foram tratadas com meio contendo 300 nM de 5-aza-2′-desoxicitidina durante 72 h. Após o tratamento, as células foram colhidas e examinadas a expressão de ARNm de RUNX3 por RT-PCR. B:

RUNX3

ilha CpG e regiões analisadas (N.º 1-10) são mostrados como barras verticais. local de início da transcrição (TSS) está localizado dentro da região No. 7. C: Padrão de metilação de RUNX3 em linhas de células de carcinoma epidermóide. O ADN genómico foi extraído de linhas de células de carcinoma epidermóide e foi tratada com bissulfito. estado de metilação da região promotora (No. 1-10) foi examinado pelo método de PCR específica de metilação. D: O resumo da metilação e expressão de status de RUNX3 em linhas de células de carcinoma epidermóide. E: Expressão de RUNX3 no epitélio da língua de rato com embrião (painel superior) e adultos (painel inferior) do rato por imuno-histoquímica. tecidos língua dos embriões de ratinho no dia embrionário 15,5 e 10 semanas foram utilizados ratinhos BALB /c de idade. F: Expressão de ARNm de RUNX3 foi analisada por RT-PCR em 4 células primárias cultivadas normais epiteliais orais (# 1- # 4). HSC4 célula foi utilizado como um controlo negativo e células Ca9-22 foi usada como um controlo positivo para a expressão de RUNX3. GAPDH foi usada como um controlo. L: expressão de RUNX3 foi analisada após 5-aza-2′-desoxicitidina (5-Aza) de tratamento. As células primárias cultivadas normais epiteliais orais (# 1 e # 2) foram tratadas com meio contendo 300 nM de 5-aza-2′-desoxicitidina durante 72 h. Após o tratamento, as células foram colhidas e examinadas a expressão de ARNm de RUNX3 por RT-PCR. H: O ADN genómico foi extraído a partir de 4 células primárias cultivadas normais epiteliais orais (# 1- # 4). estado de metilação na região N ° 5-8 foram examinadas pelo método de PCR específica de metilação. I: O resumo da metilação e expressão de status de RUNX3 em células epiteliais normais

relatório recente mostra que RUNX3 é expressa na língua e palato epitélio de embriões de camundongos a partir de dia embrionário 12,5-16,5, e que. expressão RUNX3 diminui após dia embrionário 16,5 e desaparece em ratos recém-nascidos [21]. Aqui também confirmou que a expressão de RUNX3 foi observada no epitélio da língua de embriões de rato (E15.5), mas não no adulto epitélio da língua do rato (10 semanas de idade) (Figura 3E). Esses achados nos fez supor que

RUNX3

pode ser silenciados por metilação em células epiteliais orais adultos. tecido da mucosa oral geralmente contém tecido conjuntivo e linfócitos infiltrantes. Como mostrado na Figura 2A (painel inferior), linfócitos infiltrantes em mucosa oral normal mostraram expressão de RUNX3. Portanto, utilizou-se células epiteliais de cultura primárias obtidas a partir de epitélio oral normal neste estudo para evitar a contaminação dos linfócitos. Na forma similar aos estudos de imuno-histoquímica (Figura 2A), 4 células epiteliais de cultura primária obtida a partir do epitélio oral normal (# 1- # 4) não expressaram ARNm de RUNX3 (Figura 3F), indicando que o nível de expressão de RUNX3 é baixa ou ausente no adulto normal epitélio oral. Foi examinada a expressão de RUNX3 após o tratamento com 5-aza-2′-desoxicitidina. expressão de RUNX3 foi regulada por tratamento com 5-aza-2′-desoxicitidina em 2 células primárias cultivadas epiteliais (# 1 e # 3) (Figura 3G). Em seguida, examinamos se

RUNX3

foi silenciado por metilação em células epiteliais orais adultos. Foi realizada PCR específicos de metilação em 4 células epiteliais de cultura principal na região que abrange o local de início da transcrição de

RUNX3

(N ° 5-8), que é crítico para a perda da expressão de RUNX3 em células CECP (Figura 3C). Curiosamente, 2 células epiteliais de cultura principal (# 1 e # 2) mostrou parcialmente metilação no No. 6 e No. 7 região, e mais 2 células epiteliais de cultura principal (# 3 e # 4) mostrou totalmente metilação no No. 7 e Não . 8 região (Figura 3H e 3I).

proliferação celular RUNX3 superexpressão reforçada e inibiu a apoptose

Para saber o papel de RUNX3 em CECP, transfectadas de forma estável um vetor de FLAG-RUNX3 expressão em células HSC3 com menor expressão de RUNX3. Obtivemos RUNX3 sobre-expressam de forma estável células (Figura 4A). Curiosamente crescimento celular, de RUNX3 sobre-expressão aumentada (Figura 4B). Em 6 dias, o número de células que sobre-expressam RUNX3 foi notavelmente maior do que a de células de controlo. Embora nós examinamos migração e invasão, RUNX3 superexpressão não promoveu a migração e invasão (Figura S2). Além disso, o aumento da população correspondente ao sub-G1 após privação de soro foi observada apenas em células de controlo, mas não em células que sobre-expressam RUNX3 (Figura 4C). Para demonstrar se este incremento de sub-G1 detectada em células de controlo após privação de soro é devido a apoptose, o nível de apoptose foi avaliada utilizando anexina V-FITC /iodeto de propídio ensaios (Figura 4D). Anexina V /propídio células duplamente positivas foram observadas em iodeto de 1,8% de células que sobre-expressam RUNX3, enquanto em 21,7% das células de controlo, indicando que a sobreexpressão de RUNX3 inibida privação de soro induzida por apoptose. Para confirmar estes fenótipos, examinou-se o knockdown de RUNX3 em células Ca9-22, que mostraram sobreexpressão de RUNX3 e eram resistentes à apoptose induzida por privação de soro. Para knockdown de RUNX3, foram utilizados três siRNAs diferentes (si-RUNX3-1, si-RUNX3-2 e si-RUNX3-3) e seu cocktail. expressão RUNX3 foi notavelmente silenciado por si-RUNX3-1 (Figura S3A). Portanto, nós utilizamos si-RUNX3-1 para os seguintes estudos. RUNX3 siARN transfecção reduzida a expressão de ARNm de RUNX3 e proteína em células Ca9-22 (Figura 5A). Examinámos se ARNsi induziu uma resposta de interferão de stress não específica. RUNX3 tratamento siRNA não induziu genes clássicos de interferão-responsive, OAS1 e ISG54 mRNAs, indicando que o tratamento RUNX3 siRNA não induziu significativa resposta do interferon (Figura S3B). Como esperávamos, RUNX3 siARN inibiu o crescimento das células (Figura 5B). Em 6 dias, o número de células tratadas RUNX3 de ARNip foi notavelmente inferior ao das células de controlo. Além disso, RUNX3 siARN aumento da população correspondente ao sub-G1 após privação de soro (Figura 5C). Anexina V /propídio células duplamente positivas iodeto foram observados em 10,5% das células de controlo, ao passo que em 18,1% de RUNX3 knockdown células (Figura 5D)

A:. Geração de células que sobre-expressam RUNX3. A /plasmídeo pcDNA3 de RUNX3 ou o vector sozinho foi introduzido em células HSC3, e os clones de piscina estáveis ​​foram obtidas por selecção de G418 durante 2 semanas. expressão exógena de ARNm de RUNX3 e a proteína foi analisada por RT-PCR e análise por transferência de Western (WB). Cul1 foi utilizado como um controlo de carga. B: O gráfico mostra o crescimento celular de células de RUNX3 sobre-expressam e controlo HSC3. As células foram plaqueadas em placas de 24 poços, e as células tripsinizadas foram contados pelo contador de células (Coulter Z1) a 0, 2, 4 e 6 dias. C: RUNX3 sobre-expressão inibiu a apoptose induzida por privação de soro. As células foram incubadas durante 0, 48 e 96 horas após a privação de soro e fixadas em etanol a 70%. a distribuição do ciclo celular foi determinada por análise de conteúdo de DNA após coloração com iodeto de propídio usando um citómetro de fluxo. Para cada amostra, 20000 eventos foram armazenados. Foram realizados dois experimentos independentes. análise de citometria de fluxo de Anexina V e iodeto de propídio coloração em células de controlo e de RUNX3 sobre-expressam após privação de soro durante 96 h: D. Foram realizados dois experimentos independentes

A:. RUNX3 silenciamento por RNA interferente pequeno. Logaritmicamente crescentes Ca9-22 células com expressão de RUNX3 foram semeadas a uma densidade de 10

5cells /disco de 6 cm e transfectadas com oligos duas vezes (em 24 e 48 h após replating). Quarenta e oito horas após a última transfecção, as células foram recolhidas e ARNm de RUNX3 e a expressão da proteína foi analisada por RT-PCR e análise de Western blot. B: O gráfico mostra que o crescimento de células de RUNX3 siARN tratada e controlar Ca9-22 células. As células foram plaqueadas em placas de 24 poços, e as células tripsinizadas foram contados pelo contador de células em 0, 2, 4 e 6 dias. C: RUNX3 siARN reforçada a apoptose induzida por privação de soro. a distribuição do ciclo celular foi determinada por análise de conteúdo de DNA após coloração com iodeto de propídio usando um citómetro de fluxo. Para cada amostra, 20000 eventos foram armazenados. Foram realizados dois experimentos independentes. D: Fluxo de análise de citometria de anexina V e iodeto de propídio coloração no controle e RUNX3 células após privação de soro knockdown por 96 h. Foram realizados dois experimentos independentes.

Além disso, nós examinamos a inibição da apoptose após o tratamento com quimioterápico no controle e RUNX3 superexpressão HNSCC (Figura 6). HSC3 células que sobre-expressam de controlo e RUNX3 foram expostas durante 72 horas a adriamicina (DOX; 0,5 e 1 ug /ml), que é um agente quimioterapêutico utilizada no tratamento de carcinoma epidermóide. A população sub-G1 de RUNX3 sobre-expressando células HSC3 foi 7,49%, enquanto que as células de controlo foi de 44,76% após o tratamento com 1 ug /ml de DOX (Figura 6A). Além disso, após o tratamento com 1 ug /ml de DOX, anexina V /propídio células duplamente positivas iodeto foram observados em 25,2% das células de controlo, ao passo que em 8,9% de células que sobre-expressam RUNX3 (Figura 6B). Por outro lado, a Anexina V /propídio células duplamente positivos de iodeto aumentou RUNX3 knockdown (Figura 6C). Em geral estes sugerem que a sobre-expressão de RUNX3 pode estar envolvida no desenvolvimento de carcinoma epidermóide através da promoção do crescimento celular e a inibição da apoptose

A:. Adriamicina (Dox, 0, 0,5 e 1 ug /ml) foi tratada durante 72 horas no controlo e RUNX3 superexpressão células HSC3. a distribuição do ciclo celular foi determinada por análise de conteúdo de DNA após coloração com iodeto de propídio usando um citómetro de fluxo. Para cada amostra, 20000 eventos foram armazenados. Percentagem da população sub-G1 é indicado. Foram realizados dois experimentos independentes com poços em triplicado por condição. dados representativo é mostrado. análise de citometria de fluxo de Anexina V e iodeto de propídio coloração em RUNX3 sobre-expressando células após o tratamento DOX durante 72 h nas doses indicadas e controlo: B. C: análise citométrica de fluxo de Anexina V e iodeto de propídio coloração em células de controlo e de RUNX3 knockdown após o tratamento DOX durante 72 h nas doses indicadas. Foram realizados dois experimentos independentes.

Para saber o papel de RUNX3 na tumorigênese, examinamos a formação tumorsphere usando placas ultra-baixas de fixação. RUNX3 sobre-expressão promovida tumorsphere formação (Figura S4A e S4B). O número médio de colónias era 535,6 e 663,3 em células RUNX3 superexpressão, respectivamente (Figura S4B) e controle de. Além disso, RUNX3 inibida knockdown tumorsphere formação (Figura S4C e S4D).