Abstract
Fundo
O glioblastoma é o tumor cerebral primário mais frequente e maligno com um prognóstico pobre. A tradução de estratégias terapêuticas para o glioblastoma a partir da fase experimental para a clínica tem sido limitada pela insuficiência de modelos animais, que carecem de características importantes de tumores humanos. terapia genética Lentivirus é uma opção terapêutica atraente para glioblastoma humano, que nós validado em um modelo animal clinicamente relevante.
Metodologia /Principais Achados
Foi utilizado um modelo de xenoenxerto de roedor que recapitula a invasiva e angiogênico características de glioblastoma humano para analisar o padrão de transdução e eficácia terapêutica dos vectores lentivirais pseudotipados. células de glioblastoma humano ambos, linfocítica glicoproteína do vírus da coriomeningite (LCMV-GP) e vesicular glicoproteína do vírus da estomatite (VSV-G) lentivirais pseudotipados muito eficiente transduzidas
in vitro
e
in vivo
. Em contraste, vetores gammaretroviral pseudotipados, semelhantes aos avaliados para terapia clínica de glioblastoma, mostraram transferência de genes ineficiente
in vitro
e
in vivo
. Ambos os vectores lentivirais pseudotipados transduzidas células estaminais cancerosas semelhante caracterizados pela sua CD133-, nestin- e SOX2-expressão, a capacidade para formar esferóides em meio de células estaminais neurais e para expressar marcadores astrocíticos e diferenciação neuronal em condições de soro. Em uma abordagem terapêutica utilizando o herpes simplex gene suicida de timidina quinase do vírus (HSV-1
-tk
) fundido com eGFP, ambos os vectores lentivirais mediada por uma remissão completa de tumores sólidos, como visto na MRI resultando numa sobrevivência altamente significativa benefício (p 0,001) em comparação com grupos de controle. Em todos os tumores recorrentes, sobrevivendo células tumorais eGFP-positivas foram encontradas, defendendo a aplicação pró-fármaco para vários ciclos até mesmo para melhorar e prolongar o efeito terapêutico.
Conclusões /Significado
Em conclusão, vetores lentivirais pseudotipados são candidatos promissores para a terapia genética do glioma em pacientes. A entrega gene ineficiente por vetores gammaretroviral está em linha com os resultados obtidos na terapia clínica para GBM e, portanto, confirma a alta reprodutibilidade do modelo de glioma animais invasivo para pesquisa translacional
Citation:. Huszthy PC, Giroglou T, Tsinkalovsky O, P Euskirchen, Skaftnesmo KO, Bjerkvig R, et al. (2009) Remissão de Invasiva, Cancer Stem-Like Glioblastoma xenoenxertos Usando suicídio Lentivirus Vector-Mediated Gene Therapy. PLoS ONE 4 (7): e6314. doi: 10.1371 /journal.pone.0006314
editor: Chris Jones, do Instituto de Pesquisa do Câncer, Reino Unido
Recebido: 09 de março de 2009; Aceito: 23 de junho de 2009; Publicação: 20 de julho de 2009
Direitos de autor: © 2009 Huszthy et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Conselho de Investigação da Noruega (conceder 186,492 para HM), a Sociedade norueguesa Câncer, Helse Vest, Hospital Universitário Haukeland, o Programa de Investigação Bergen Translational, o 6º Programa Quadro da Comissão Europeia (contrato 504743) e pelo Programa Koeln Fortune em da Universidade de Colónia (concessão 28/2006 para HM). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o glioblastoma é o tumor cerebral primário mais frequente e maligno. Apesar dos avanços na neurocirurgia, radioterapia e quimioterapia, o prognóstico dos pacientes permanece pobre, com uma sobrevida média de 14 meses [1].
A grande desvantagem na pesquisa do câncer cerebral translacional tem sido a falta de modelos animais adequados. Syngeneic- ou tumores de xenoenxerto com base em linhas celulares de glioblastoma cultivadas como monocamadas crescer como circunscrito e lesões altamente angiogénicos
in vivo
[2], sem as células de tumor invasivas, que representam uma característica importante do glioblastoma humano. As células invasivas migrar para longe da massa do tumor inicial e pode causar tumores recorrentes em diferentes regiões do cérebro. Assim, estas células representam um importante alvo terapêutico.
A recém modelo estabelecido na qual esferóides à base de biópsia de glioblastoma são passados em série nos cérebros de ratos nus mostra altamente características invasivas e angiogênicos [3]. Por isso, este modelo é bem adequado para o estudo de novas estratégias terapêuticas. Ainda assim, relatórios usando este ou outros modelos clinicamente relevantes para a terapia experimental são escassos. Recentemente, foi analisado o potencial terapêutico do vector G207 Herpes oncolítico base para HSV-1 no modelo baseado no GBM esferóide biópsia. O volume do tumor nos animais tratados foi reduzido em comparação com grupos de controle, mas não havia nenhuma vantagem de sobrevivência significativa [4]. Em contraste, a mesma terapia era mais eficaz num modelo animal com base de linha de células [5], e como resultado é actualmente investigada numa fase I /II Estudo clínico [6]. Na presente investigação foi utilizado o modelo de xenotransplante invasiva para avaliar transdução e eficácia terapêutica dos vectores lentivirais pseudotipados.
vetores Gammaretroviral derivados do Moloney vírus da leucemia murina (MMLV) foram os retrovírus mais frequentemente utilizados para a terapia de gene de tumores cerebrais [7] – [10]. No entanto, apesar dos resultados promissores em modelos animais, os ensaios clínicos, utilizando sobrenadantes de vector retrovirais ou células de empacotamento retroviral falharam [11] – [13]. Uma grande desvantagem dos vectores gammaretroviral é a transdução exclusiva de células em divisão, uma vez que em gliomas humanos, a maioria das células tumorais não se dividem dentro de uma determinada janela de tratamento. Portanto, os vectores lentivirais com a sua capacidade para transduzir células, também não se dividem são candidatos atractivos para o tratamento de cancro cerebral. Em estudos anteriores, nós desenvolvemos gammaretroviral e vectores lentivirais pseudotipado com as glicoproteínas (GP) do vírus da coriomeningite linfocitária (LCMV) [14], [15]. Estes vetores têm uma ampla gama de hospedeiros e pode ser concentrado por ultracentrifugação para
in vivo para aplicativos. Além disso, por LCMV-GP não é citotóxico, e linhas celulares de empacotamento recombinantes estáveis podem ser estabelecidos [16], [17]. Recentemente, nós mostramos que lentivirais pseudotipos LCMV-GP eficiente entregues transgenes de rato células de glioma
in vivo
, enquanto neurônios residentes não foram transduzidas [18]. Além disso, mostramos um efeito terapêutico significativo de LCMV-GP lentivirais pseudotipados no modelo de glioma 9L de rato base de células-line usando o gene suicida HSV-1-
tk
. Pseudotipos VSV-G lentivirais também mostrou uma eficácia significativa, semelhante ao de pseudotipos de LCMV, que foi principalmente mediada por um efeito de proximidade de células cerebrais normais transduzidas [19].
No trabalho apresentado, que mostrou que tanto células de glioma humano, lentivírus pseudotipados LCMV-GP VSV-G e eficiente transduzidas
in vitro
e
in vivo
, enquanto transdução gammaretroviral foi ineficiente. A transferência de genes para células de glioma foi eficiente para ambos os tipos de vetor pseudotipados lentivirais. No entanto, foi mais específico usando vectores pseudotipados LCMV-GP, tal como pseudotipos VSV-G também transduzidas células do cérebro do hospedeiro em áreas invasivas. Análise de células tumorais transduzidas revelou que ambos os vectores lentivirais alvo CD133-positivas, bem como as células cancerosas CD133-negativas. Além disso, as células de glioblastoma transduzidas expressa a haste marcadores celulares nestina e SOX2. Importantemente, quando avaliadas para a aplicação terapêutica utilizando o HSV-1-
TK
como um transgene, ambos os vectores lentivirais mediada regressão completa do tumor em MRI, resultando em um benefício de sobrevivência altamente significativa (p 0,001) em comparação com os grupos de controle .
Materiais e Métodos
Ética Declaração
a coleção de tecidos de biópsia humana foi aprovado pelo comitê de ética regional. O manejo dos animais e os procedimentos cirúrgicos foram realizados em conformidade com a lei norueguesa Animal e do comitê de ética local aprovou o protocolo.
As linhas celulares
A linha de células de rim embrionário humano 293T (ATCC número CRL-11268) e a linha de células TE671 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) e mantidas em meio de eagle modificado por Dulbbeco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (FCS) e 1% de glutamina. Todas as linhas celulares foram cultivadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO
2.
de cultura de tecidos
fragmentos de tumor de doentes com glioblastoma multiforme foram obtidas durante a cirurgia. As amostras de tecido foram retiradas de áreas tumorais viáveis que correspondiam às regiões com realce de contraste em ressonância magnética pré-operatórios-scans. As amostras foram transferidas para tubos de ensaio contendo meio de crescimento completo, e esferóides foram preparados como anteriormente descrito [20]. O mesmo método foi aplicado para o material do tumor passadas em ratos nus. Resumidamente, as amostras de tecido foram cortados em fragmentos de fragmentos de ~ 0,5 mm e colocados em 80 cm
2 frascos de cultura de tecidos (Nunc, Roskilde, Dinamarca) com 0,75% de agar (Difco, Detroit, MI) revestida de base. Os esferóides foram mantidas num incubador de cultura de tecido padrão com 5% de CO
2 e 100% de humidade relativa a 37 ° C. O meio foi mudado uma vez por semana. Foram selecionados esferóides com diâmetros entre 400 e 600 mm para
in vitro
experiências e para a implantação intracerebral.
A dissociação dos tumores
Os tumores foram dissociadas utilizando o Kit Neuronal dissociação (Miltenyi , Bergisch-Gladbach, Alemanha) de acordo com o protocolo do fabricante
Fluxo de análise de citometria e separação de células
as células foram analisadas e classificadas em um classificador de células MoFlo (Beckman Coulter, EUA;. ex Cytomation, EUA), equipado com um Coherent Empresa de laser de argônio 621-ion ajustado para 488 nm (usado a 180 mW) e 635 Diode nm (25 mW). Duas ug /mL de iodeto de propídio – Pi (Molecular Probes) foram adicionados às amostras antes de filtragem de fluidos para facilitar a discriminação de células mortas. A GFP e PI foram animado a 488 nm e fluorescência foi medida através 530/40 BP e 613/20 BP filtros ópticos (todos os filtros de Omega Optical, Brattleboro, VT, EUA), respectivamente. Doublets foram discriminados utilizando uma dispersão de luz frontal (FSC) versus largura de pulso. canal FL3 (no modo logarítmica) com o FSC foram usadas para exibir e portão para fora células positivas /mortas PI. sinais de luz dispersão lateral (SSC) FSC e foram detectados e apresentados no modo linear. células GFP + foram definidos em SSC contra FL1 (no modo logarítmico) gráfico de pontos após a exclusão de células mortas e os detritos, tal como descrito acima.
Para a análise de células de expressão de CD133 foram coradas com aloficocianina (APC) conjugada com anticorpo monoclonal CD133 /1 (AC133) anticorpos (Miltenyi, Bergisch-Gladbach, Alemanha), de acordo com o protocolo geral do fabricante para a coloração imunofluorescente (durante 10 min no escuro a 4 ° C). CD133-APC foi excitado a 635 nm, a fluorescência foi medida através 670/30 filtro óptico BP, e vivas células CD133 + foram definidos no SSC contra FL6 (no modo logarítmica) gráfico de pontos. suspensão de células não-coradas foi utilizada como um controlo.
células GFP + tumores foram classificados em “purificar um” modo em polipropileno tubos Falcon de fundo redondo (Becton Dickinson Labware Europa, França) contendo meio de cultura, que foram colocados no gelo. Alíquotas de algumas amostras no final da triagem foram removidos e novamente analisadas para controlo da pureza tipo, que foi superior a 98%.
Cultura de células classificadas
As células seleccionadas foram cultivadas quer em Neurobasal médio (Invitrogen, Carlsbad, CA) com suplemento B27 (20 ul /ml; Invitrogen), Glutamax (10 ul /ml; Invitrogen), o factor de crescimento de fibroblastos 2 (20 ng /mL; Peprotech, Rocky Hill, NJ), de crescimento epidérmico fator (20 ng mL; Peprotech) ou transferidas para DMEM suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (FCS) e 1% de glutamina e cultivadas em lamelas em placas de 24 poços
imunofluorescência coloração de esferóides /células aderentes
esferóides /células aderentes foram coradas com anticorpos específicos de ratinho-humano anti-nestina (Millipore, Billerica, MA), anticorpos de cabra anti-SOX2 (R D), de rato-anti-β-tubulinIII (Millipore ) anticorpos e anticorpos anti-GFAP de ratinho (Millipore). Os anticorpos primários foram incubados durante a noite a 4 ° C. anticorpos Alexa-Fluor647-cabra-anti-rato und Alexa-Fluor647-burro anti-cabra (Dianova, Hamburg, Germany) foram utilizados como anticorpos secundários durante a noite a 4 ° C (para esferóides) ou durante 2 horas à temperatura ambiente (por células aderentes). Esferóides foram examinadas sob um microscópio de fluorescência (Nikon, Tokyo, Japão) e as células aderentes foram analisados por microscopia de varredura a laser confocal (Zeiss, Jena, Alemanha).
lentivirais e retrovirais
O lentiviral pRRL.sinCMVeGFPpre vector plasmídico foi publicada por Naldini et ai. [21]. A construção do vector lentiviral pRRL.sinCMV-TK /eGFPpre foi descrito anteriormente. tem sido descrito o vector retroviral pMP71-eGFP-pré anteriormente [22].
Preparação de lentivírus e os sobrenadantes de vector retroviral
A linha celular 293T foi utilizado para a produção transiente de vetor lentiviral. O plasmídeo vector lentiviral pRRL.sinCMV-TK /eGFPpre (5 ug) ou pRRL.sinCMVeGFPpre (5 ug), a expressão de HIV gag-pol-REV plasmídeo pCMV-dR8.91 (12,5 ug) [21] e 2 ug do envelope plasmídeo de expressão pHCMV-LCMV-GP [14] ou de pCMV-G [23] foram co-transfectados para células 293T e concentrou-se, tal como descrito anteriormente [18]. Para a produção de vectores retrovirais, células 293T foram transfectadas com 7,5 ug de pMP71-eGFP-pré, 12,5? G de pSV-Mo-MLVgagpol, e 2 pg do plasmídeo de expressão envelope pHCMV-LCMV-GP [14] ou de pCMV-G [23]. Vetores foram colhidas e concentrada como descrito anteriormente [24].
A titulação de sobrenadantes de vectores virais
vectores foram titulados em TE671 células como descrito anteriormente [18].
Implantação de esferóides glioblastoma
implantação intracraniana de esferóides de glioblastoma foi feito como descrito anteriormente [25].
Vector infusão
Três semanas a um mês após o implante, os animais foram anestesiados e preparados para injecção de vector. A pele foi retirado para revelar a localização da craniotomia. 2 vezes 10 mL de reservas de vector foram entregues no centro dos tumores utilizando uma seringa de vidro (modelo 701, Hamilton, Bonaduz, Suíça) fixado numa bomba de infusão controlada por um microprocessador (UMP 2-1, mundo Precision Instruments, Aston, Stevenage , Reino Unido). As coordenadas de injeção foram estimados após analisar imagens de ressonância magnética para cada lesão individual. infusão vector foi realizado por convecção a administração melhorada no decurso de 25 min (200 nl /min durante 10 min, seguida de 400 nl /min durante 10 min, e, finalmente, 800 nl /min durante 5 min). Após a infusão, a agulha foi deixada no local por 5 min para evitar refluxo vetor. A agulha foi lentamente retraído e as dobras cutâneas foram fechados com fio cirúrgico poliamida. Após a cirurgia, os ratos foram deixados a recuperar numa incubadora a 35 ° C antes de voltar-los para as gaiolas.
tratamento de gliomas de rato
Os ratos portadores de xenoenxertos de glioblastoma foram tratados diariamente por via i.p. injeções de 50 mg /kg ganciclovir (GCV, Roche, Basel, Suíça).
Análise de cérebros de ratos
Os animais foram sacrificados e perfundidos com solução salina estéril e, posteriormente, com paraformaldeído a 4%. Os cérebros foram removidos, suspensos em 30% de sacarose para três dias, e, em seguida, rapidamente congelados em isopentano arrefecida com gelo seco. cortes coronais (12 um) foram preparados em um criostato. Para a análise de imunof luorescência, as secções foram coradas com os anticorpos anti-nestina-humanas específicas (Millipore) para células humanas de glioblastoma, anti-rato NeuN-(Millipore) anticorpos para neurónios, anticorpos de rato anti-nestina específicos de ratos (Millipore) para astrócitos e células progenitoras células. Os anticorpos primários (diluição 1:200) foram incubadas durante a noite a 4 ° C. Biotinilado de cabra anti-ratinho e de cabra anti-coelho (Vector Laboratories, Burlinghame, CA) foram utilizados como anticorpos secundários (diluição 1:100) durante 2 h à temperatura ambiente. As secções foram incubadas com Extravidin-Cy3 (Sigma, St. Louis, MO) como fluorocromo (diluição 1:200) durante 1 h à temperatura ambiente. As secções foram examinadas num microscópio de fluorescência (Nikon) e analisados por microscopia de laser confocal de varrimento (Zeiss, Jena, Alemanha)