Abstract

fator de crescimento epidérmico aberrante (EGF) de sinalização está associada ao crescimento do tumor em carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço em seres humanos (CECP), e é um dos principais focos de terapia-alvo. Cetuximab, um anticorpo monoclonal contra o EGFR, foi bem sucedido em prolongar a sobrevivência, mas apenas dispõe de uma taxa de resposta de 10% de encolhimento do tumor em um ambiente clínico. O objetivo deste estudo foi comparar dacomitinib (PF-00299804), a próxima geração inibidor de molécula pequena de tirosina quinase que irreversivelmente blocos múltiplos receptores sua família (HER-1 (EGFR), HER-2 e HER-4 tirosina quinases), para cetuximab, o actual FDA aprovou medicação anti-EGFR para HNSCC e erlotinib, um inibidor de cinase de EGFR de tirosina específica de molécula pequena. Dacomitinib, erlotinib e cetuximab foram testados num painel de linhas celulares 27 CECP. O tratamento com 100 ug /ml de cetuximab ou 1 uM de erlotinib inibiu o crescimento de pelo menos 50% em 7/27 linhas de células, enquanto que o tratamento com 1 uM de dacomitinib tinha inibição do crescimento semelhante em linhas 17/27. As linhas celulares que representam três níveis de sensibilidade para dacomitinib foram adicionalmente analisados ​​utilizando transferências de Western, análise do ciclo celular e apoptose. O tratamento com 100 nM de dacomitinib redução da atividade EGFR e AKT jusante e ERK mais eficaz do que o tratamento com 100 ug /ml de cetuximab em todas as dez linhas testadas. Embora ambos os compostos induziram apoptose em níveis semelhantes, dacomitinib causou maior apreensão G0 /G1. A sensibilidade ao bloqueio de EGFR foi associada a níveis de EGFR e de ERK e não estava associada a mutações oncogénicas comuns e variações no número de cópias. EGFR fosforilado e os níveis de ERK total e correlacionam com sensibilidade para ambos cetuximab e dacomitinib. Três das quatro linhas no grupo extremamente sensível tinha os mais elevados níveis de EGFR fosforilado e ERK total e entre as dez linhas seleccionadas, enquanto que as três linhas resistentes tinha colectivamente os níveis mais baixos. Nem pAKT nem TAKT foi associada com sensibilidade

Citation:. Ather F, Hamidi H, Fejzo MS, Letrent S, Finn RS, Kabbinavar F, et al. (2013) Dacomitinib, uma irreversível Pan-erbB Inhibitor Significativamente anula crescimento na cabeça e pescoço Modelos que apresentam baixa resposta à Cetuximab. PLoS ONE 8 (2): e56112. doi: 10.1371 /journal.pone.0056112

editor: Nils Cordes, da Universidade de Tecnologia de Dresden, Alemanha |

Recebido: 23 Abril de 2012; Aceito: 08 de janeiro de 2013; Publicação: 06 de fevereiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Ather et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. SL é um funcionário da Pfizer. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas PLoS ONE em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço (CECP), que consiste em cancros originários o cavidades oral e nasal, laringe, faringe, lábios e seios, é o sexto tipo de câncer mais comum em todo o mundo com uma incidência superando 500.000 casos por ano [1], [2]. Apesar do modelo de evolução da gestão multimodalidade integrando a intervenção cirúrgica, quimioterapia e radioterapia, a sobrevida global permanece pobre, com uma taxa de sobrevivência relativa de 5 anos abaixo de 50% (estatísticas SEER CECP). Cabeça e gestão do cancro do pescoço tem um potencial considerável para a utilização de terapias biológicas específicas, uma estratégia que tem vindo a fazer avanços significativos no tratamento de outras histologia incluindo cancros da mama [3], cólon [4], e cancro do pulmão [5] . O fator causal primário para pulmão e câncer de cabeça e pescoço é o tabagismo, e ambos possuem características moleculares semelhantes que têm sido implicados na patogênese da doença, tais como um papel-chave do receptor do factor de crescimento epidérmico humano (EGFR) no crescimento do tumor.

EGFR, o que é altamente expressa na maioria significativa (até 80-100%) de carcinoma epidermóide, é do receptor protótipo da família de receptores de tirosina-quinase HER, que inclui HER1 /ErbB-1 /EGFR, HER2 /neu /erbB-2, HER3 /ErbB-3 e HER4 /ErbB-4 [6]. A ligação de um dos seus sete ligandos (que inclui o EGF e TGF-alfa) induz a homodimerização e heterodimerização com outro membro da família e a fosforilação em vários resíduos de tirosina no domínio C-terminal [7]. A ligação do ligando específico, tal como o factor de crescimento epidérmico (EGF) e factor de transformação de crescimento (TGF-alfa) para EGFR, resulta na dimerização do receptor e iniciação de vias de sinalização intracelular. sinalização a jusante principal é através da via Ras-Raf-MAPK. A activação de Ras inicia uma cascata de fosforilação de múltiplos passos que conduz à activação de MAPK ERK1, ERK2 e, que em última instância regulam a transcrição de moléculas envolvidas na proliferação celular [8]. Outro objectivo importante na sinalização do EGFR é fosfatidilinositol 3-quinase (P13K) e a jusante de proteína-serina /treonina-quinase Akt. Esta última proteína quinase transduz sinais moleculares que desencadeiam passos cruciais para o crescimento e sobrevivência celular [8], [9].

activação aberrante de EGFR e as suas vias a jusante tem sido implicada em várias doenças malignas [10]. A sobre-expressão de EGFR em HNSCC tem sido associada com menores taxas de resposta à quimioterapia padrão, e aumentado de recorrência e resistência ao tratamento de radiação [11], [12], [13]. Vários compostos de segmentação EGFR foram introduzidas com êxito prática clínica em medicina do cancro, incluindo pequenas moléculas que se ligam ao domínio de tirosina-cinase de EGFR tal como gefitinib [14] (AstraZeneca, cancro do pulmão) e erlotinib [15] (OSI /Genentech, do pulmão e do cancro do pâncreas) e os anticorpos monoclonais cetuximab [16] (BMS /Imclone, colorretal, pulmão e câncer de cabeça e pescoço) e panitumumab [17] (Amgen, cancro colorectal) que se ligam seu domínio extracelular.

O potencial de EGFR terapia dirigida para tratar pacientes com carcinoma epidermóide foi validado em ensaios recentes em que os pacientes que receberam o cetuximab e radiação demonstraram aumento da sobrevivência e controle loco-regional, em oposição ao tratamento com radiação sozinha [16]. melhorias semelhantes foram observados com a adição de cetuximab a terapia base de platina no ensaio EXTREMO [18]. No entanto, os aumentos de controlo e sobrevivência do tumor resultantes da adição de cetuximab nestes ensaios são ainda modesto, muitas vezes, medida em meses ou semanas. Por esta razão a identificação de marcadores preditivos para melhorar a seleção dos pacientes, bem como o desenvolvimento de agentes mais eficazes visando este importante via são necessárias para alcançar melhores resultados em pacientes com CECP.

Uma resposta razão para terapia dirigida-EGFR pode ser baixa é a redundância de cooperação e de sinalização entre os diferentes membros da família de receptores ErbB [19]. Apesar da inibição do mesmo a um membro da família mais altamente expresso (como é o caso quando o cetuximab inibe EGFR), a proliferação pode permanecer sem entraves devido a sinalização alternativa a partir de outros receptores estão mantendo a activação das vias a jusante comuns partilhadas por membros da família de receptores ErbB. Assim, tendo como alvo vários membros do grupo de receptores ErbB é uma abordagem racional, especialmente em indivíduos cuja doença tenha progredido inicialmente ou tenham desenvolvido resistência à terapia com cetuximab. Esta noção é suporte por pacientes com cancro da mama que experimentaram a progressão do tumor após o tratamento com trastuzumab (Herceptin, Genentech), um anticorpo monoclonal dirigido contra HER2, demonstraram respostas ao duplo de EGFR e HER2 lapatinib inibidor de tirosina-quinase (Tykerb, GSK) [20] .

Dacomitinib (Pfizer) é um segundo inibidor de geração Pan-ErbB que se liga irreversivelmente vários membros da família, incluindo ErbB-1, erbB-2 e ErbB-4 [21]. Respostas significativas in vitro foram observados com baixas concentrações de dacomitinib em linhas celulares de cancro de pulmão resistente a gefitinib [22] e em linhas celulares de cancro da mama resistentes ao trastuzumab e lapatinib [23]. Na clínica, uma fase I dose escalada estudo em pacientes com tumores sólidos malignos em estado avançado demonstrou doses bem toleradas com actividade antitumoral significativa [24]. Fase recente I e II ensaios em NSCLC avançado têm se mostrado promissoras actividade clínica medida pelo estabilização da doença e melhora da sobrevida livre de progressão em pacientes que evoluíram na terapia de platina e foram previamente tratados com erlotinib [25]. Com as suas propriedades farmacocinéticas melhoradas, incluindo o aumento da biodisponibilidade, semi-vida e depuração mais baixa em comparação com inibidores irreversíveis de primeira geração Pan-erbB tais como CI-1033, dacomitinib é um agente atraente para potencial uso clínico em HNSCC [21]. O objetivo do estudo foi determinar in vitro efeitos anti-proliferação de Dacomitinib em linhas de células de carcinoma epidermóide. Isso inclui a elucidação dos mecanismos que explicam a atividade ErbB dirigido terapia em modelos de linha de células de carcinoma epidermóide, bem como aferição sua eficácia contra o único FDA aprovou terapia-alvo para o tratamento HNSCC.

Resultados

Linhas Celulares resistente a cetuximab são sensíveis a Dacomitinib em

baixa concentração

Um painel de linhas celulares 27 CECP refletindo a heterogeneidade anatômica da doença foi usado para testar os efeitos antiproliferativos de dacomitinib (PF-00299804) e cetuximab, a única FDA aprovado terapia-alvo em HNSCC. (Tabela 1).

Dacomitinib inibiu o crescimento de todas as linhas celulares de cancro da cabeça e do pescoço de uma forma dependente da concentração. No entanto, houve uma heterogeneidade significativa em g valores de IC50 através do painel, com uma diferença de 4 log vezes entre as linhas de células mais sensíveis e menos sensíveis (Figura 1A). Um corte de 1 uM foi usada para estratificar linhas de células sensíveis com base em um estudo anterior no painel linha de células do cancro da mama [23]. 17/27 linhas celulares foram definidos como dacomitinib responsivo e tinha um g IC50 inferior a 1 uM. O tratamento com 100 ug /ml de cetuximab resultou numa inibição superior a 50% em 7/27 linhas celulares (Figura 1b). A resposta de linhas de células para qualquer composto não se correlacionou com a localização anatómica do tumor primário.

As células foram contadas após cinco dias de tratamento. barras SE foram derivados a partir de experiências repetidas pelo menos duas vezes. g valores A. Dacomitinib IC50 estão dispostos menor para o maior IC50 g em uma escala logarítmica. As células foram tratadas com concentrações de 0,001 a 10 uM. B. Percentagem de inibição de crescimento com tratamento com cetuximab. As células foram tratadas com uma dose fixa de 100 ug /mL. g valores C. Erlotinib IC50 estão dispostos menor para o maior IC50 g em uma escala logarítmica. As células foram tratadas com concentrações de 0,015 a 10 uM. O vermelho indica o ponto de corte de sensibilidade. Para dacomitinib e erlotinib, o ponto de corte de sensibilidade é fixado em 1 uM, e por cetuximab é fixado em 50%.

Além disso, o mesmo painel utilizado para avaliar a sensibilidade de cetuximab e dacomitinib em células de CECP foi utilizado para avaliar a sensibilidade de erlotinib, um inibidor de cinase de EGFR de tirosina específica de molécula pequena. Embora erlotinib não é uma terapia aprovada pela FDA em HNSCC, que é uma classe semelhante de terapia direcionada como dacomitinib. Assim, para avaliar se a diferença entre entre dacomitinib e cetuximab observado acima está relacionada com as diferenças farmacológicas entre as classes de drogas, ou seja, anticorpos contra o inibidor de molécula pequena, ao invés de seus alvos biológicos que também avaliou a sensibilidade do erlotinib. Apenas 25,6% (7 em 27) linhas de células de carcinoma epidermóide foram erlotinib responsivo e tinha um valor de IC50 inferior a 1 uM (Figura 1C). Esta taxa de linhas celulares altamente sensíveis (definidos como aqueles com IC50 inferior a 1 uM) foi (o termo “taxa de resposta” deve ser reservado para um estudo clínico real utilizando total completa /parcial normal para gerar este valor. É específico para isto e que não se deve confundir os leitores de um estudo pré-clínico a menos que seja de estudo de xenoenxerto de tumor, etc.).

de forma semelhante ao do cetuximab tal modo que apenas sete das 27 linhas de células de carcinoma epidermóide também tinha maior do que 50% inibição com 100 ug /ml do tratamento com cetuximab. Isto está em contraste gritante com dacomitinib que alcançou uma taxa altamente sensível de 62,9% com o mesmo 1 uM sensibilidade de corte. Dos sete linhas CECP sensíveis ao erlotinib (IC50 1 uM), cinco tiveram% de inibição superior a 50 após o tratamento com 100 ug /ml de cetuximab. As outras duas linhas celulares (UMSCC-25 e UMSCC-38) que tinha um IC50 de 0,367 g e 0,508 uM, respectivamente, tinha 25,9% e 41,2% de inibição com 100 ug /ml de tratamento com cetuximab. Havia duas linhas de células que tinham inibição superior a 50% após o tratamento com cetuximab, mas não têm menos 1 uM IC50 g com erlotinib. As linhas celulares UMSCC-4 e FADU que tiveram uma inibição de 75,6% e 56,4% com o tratamento com cetuximab, tinha g de IC50 de 1,19 e 1,192 uM, respectivamente, após tratamento com erlotinib. Todos os sete das linhas de células que respondem erlotinib foram também dacomitinib responsivo. Das 20 linhas de células restantes, 16 tiveram IC50 g entre 1 uM e 10 uM e 4 linhas celulares não alcançou IC50 g na concentração máxima testada, de 10 uM.

sensibilidade HNSCC ao erlotinib foi semelhante à sensibilidade cetuximab de modo que apenas 25,6% (7/27) do painel foram responsivos à erlontinib e cetuximab enquanto que 62,9% (17/27 HNSCC tinha IC50 g 1 uM) foi responsivo a dacomitinib. Desde cetuximab demonstrou valor clínico e é, portanto, um padrão de tratamento para câncer de cabeça e pescoço, o resto da comparação foi feita entre dacomitinib e cetuximab.

Common Oncogene mutações e amplificações são raros em CECP e não se correlacionam com sensibilidade para Cetuximab nem Dacomitinib

As mutações no EGFR, K-Ras e PI3K foram mostrados para afetar a resposta para terapias direcionadas [4], [26]. No entanto, estas mutações não são abundantes na cabeça e pescoço amostras de tumores [27], [28]. Queríamos avaliar se 1) o nosso painel de linha celular foi refletindo a mesma tendência e 2) se mutações nestes genes foram associados com sensibilidade ao cetuximab e dacomitinib. Foi realizada a análise de mutações no painel de linhas celulares de cancro da cabeça e pescoço utilizados na análise de proliferação e descobriram que mutações foram raros e não poderia ser utilizada para explicar a sensibilidade ao cetuximab e dacomitinib (Tabela 1). Nenhuma das linhas celulares nutria mutações de EGFR em 19 exões nem 21. Apenas a linha de células de CAL-33 exibiram uma mutação em exões 9 ou 20 de PI3K (H1047R um mutante heterozigótica) e apenas UMSCC-74A exibiu uma mutação KRAS (G12D um heterozigoto mutante). Ambas as linhas celulares tinham uma sensibilidade inferior a dacomitinib embora CAL33 foi um pouco responsiva ao cetuximab.

A amplificação de tirosina-quinases receptoras tem sido associada a sensibilidade a terapias dirigidas a esses receptores [29]. Estudos anteriores mostraram até 20% de HNSCC são EGFR amplificado, mas o valor preditivo e prognóstico de esta aberração foi misturado [30]. Foram realizadas análises FISH para avaliar o número de cópias do EGFR em 19 das 27 linhas de células. Nenhuma das linhas de células foram amplificadas para EGFR e apenas 4/19 linhas celulares (UMSCC-5, UMSCC-11A, CAL-27 e NCI-33) mostraram um aumento do número de cópias do EGFR (Tabela 1). Curiosamente, o aumento do número de cópias do EGFR não foi associada com a sensibilidade dacomitinib; um dos mais linhas de sensibilidade (CAL-27) e uma das linhas mais resistentes (CAL-33) estavam entre as quatro linhas com ganhos de EGFR.

níveis basais fosforilada e total de EGFR com e sem EGF Atimulation correlacionada com a sensibilidade dirigida-EGFR terapia

para avaliar o grau em que dacomitinib e de sinalização de EGFR cetuximab em bloco de linhas celulares de cancro da cabeça e pescoço e se verificar a sua eficácia em EGFR bloqueio está associada com a sua capacidade para inibir o crescimento, foi realizada a análise de Western blot para avaliar os níveis de proteína e estado de fosforilação de moléculas-chave na via de sinalização de EGFR.

Foram realizadas análises de mancha de Western num subconjunto de linhas celulares representativas da resposta diferencial ao dacomitinib tratamento. Quatro linhas foram seleccionadas a partir do grupo mais sensível (IC50 10 nM), três linhas do grupo moderado (1 uM IC50 10 nM) e três linhas de o grupo resistente (IC50 1 UM). A média dacomitinib IC50 g de linhas celulares seleccionadas em cada grupo é apresentado na Figura 2. As células foram tratadas com 100 nM dacomitinib ou 100 ug /mL com cetuximab em ambos os estados estimulada por EGF e não estimuladas. Ambos os níveis de proteína total e EGFR fosforilado (pEGFR) tEGFR e foram avaliadas (Figura 3a). nível total de EGFR foi associada com a sensibilidade dacomitinib; três dos quatro linhas no grupo altamente sensível tinha os mais elevados níveis de EGFR fosforilado e total de entre as dez linhas seleccionadas, enquanto que as três linhas resistentes tinha colectivamente os níveis mais baixos (Figura 3a). As linhas celulares no grupo moderado tinha níveis intermediários de EGFR fosforilada e total. Para comparar os níveis pEGFR entre os grupos sensíveis, moderada e resistentes, imagens de Western blot foram quantificados e o nível médio de PEGR para cada grupo de sensibilidade foram calculados e normalizar. O tratamento com qualquer um dos compostos bloquearam significativamente os níveis de pEGFR estimulada por EGF em grupos altamente sensíveis e moderados, mas não no grupo resistente (Figura 3b).

Quatro linhas celulares foram seleccionadas a partir do grupo extremamente sensível (IC50 g 10 nM), três de entre o grupo moderada (CI50 nM G10 – 1 uM) e três do grupo resistente (g IC50 1 uM). Estas dez linhas são usados ​​na transferência de Western e citometria de fluxo experiências. Média IC50 g das linhas sensíveis selecionados é de 5 nM; moderada de 75 nm; resistente 2186 nM.

As células foram cultivadas a log-fase e tratou-se com 100 nM dacomitinib ou 100 ug /ml cetuximab durante 1 hora, com ou sem tratamento com 10 ng /ml de ligando de EGF recombinante. Células lisados ​​foram então colhidos, e a proteína foi resolvido utilizando análise de Western blot. B. imagens de Western blot foram quantificados usando software ImageJ. Os níveis de proteína foram quantificadas para cada linha de células e-se a média por grupo. EGFR fosforilado foi normalizada a EGFR total. *. p . 0,05, t de Student

O tratamento com drogas não reduziu os níveis totais de EGFR (Figura 3a). No entanto, houve uma notável redução no EGFR totais nas células de controlo, com a estimulação EGF. Sabe-se que EGFR é internalizado e muitas vezes degradados após a estimulação pelo EGF ou outros ligandos, o que pode explicar a observação [31]. A adição de uma ou outra droga, no entanto, negou esse efeito, o que acrescenta evidências de que compostos que se ligam EGFR pode inibir a internalização e degradação.

Dacomitinib mas não o cetuximab inibe EGF Stimulated EGFR vias a jusante

O PI3K- AKT-mTOR e Ras-Raf-MAPK vias de sinalização são efectores a jusante de sinalização de EGFR [8]. Quisemos avaliar o efeito de dacomitinib e cetuximab sobre estas vias. Primeiro, foram avaliados os níveis de proteína de AKT total (Takt) e AKT fosforilada (pAKT) após tratamento com qualquer dacomitinib ou cetuximab. Em condições de controlo, nem os níveis de pAKT nem TAKT foram associados com a sensibilidade (Figura 4A) em qualquer linha de base ou EGF estimulada condição. estimulação EGF aumentou significativamente pAKT em todas as linhas celulares.

As células foram cultivadas a log-fase e tratadas com 100 nM ou 100 ug dacomitinib cetuximab /mL durante 1 hora, com ou sem tratamento com 10 ng /ml de EGF recombinante ligando. Células lisados ​​foram então colhidos e proteína foi resolvido utilizando análise de Western blot. B. imagens de Western blot foram quantificados usando software ImageJ. Os níveis de proteína foram quantificadas para cada linha de células e-se a média por grupo. AKT fosforilada foi normalizada para AKT total. *. p. 0,05, teste t de estudante

Dacomitinib níveis reduzidos de pAkt em todas as sete linhas de células nos grupos sensíveis e moderadas e uma linha de células no grupo resistente (UMSCC-1) na linha de base e ambos EGF condições estimuladas (Figura 4A). Dacomitinib foi capaz de reduzir os níveis de PAKT em linha de células resistentes UMSCC-17B na FEG só estimuladas condições. Na linha de células resistentes (UMSCC-74A) níveis PAKT foram ligeiramente reduzidas no EGF estimulado condição. tratamento com cetuximab foi menos potente na redução pAKT. O tratamento com cetuximab causou redução na pAKT em apenas cinco das dez linhas celulares (2/4 linhas sensíveis, 3/3 linhas moderadas e 0/3 linhas resistentes), eo nível de redução foi significativamente menor do que as causadas por tratamento com dacomitinib , independentemente da estimulação EGF (Figura 4a).

Tal como acontece com EGFR, Western blot foram quantificados e grupo específico níveis de pAKT normalizar a tAKT foram determinadas e comparadas (Figura 4b). Sem estimulação EGF, ambos os compostos reduziu significativamente os níveis PAKT no grupo altamente sensível e não os grupos moderados ou resistentes. Em condições de EGF estimulada, dacomitinib foi capaz de reduzir os níveis de pAKT em todos os três grupos. Em todos os cenários testados, dacomitinib causou maiores reduções nos níveis de pAKT que cetuximab.

A activação de Ras pela sinalização de EGFR inicia uma cascata de fosforilação de múltiplos passos que conduz à activação de MAPK, ERK1 e ERK2, e, finalmente, regula a transcrição de genes envolvidos na proliferação celular. ERK total e fosforilada (ERK1 e 2) proteína níveis (TERK e pERK) foram analisadas mediante tratamento com dacomitinib ou cetuximab. Nas condições de controlo, e os níveis de proteína TERK pERK foram menores no grupo altamente sensível e mais elevada no grupo resistente (figura 5a e 5b), independentemente da estimulação EGF. O tratamento com qualquer composto reduziu significativamente os níveis de pERK em sete linhas de células nos grupos altamente sensíveis e moderados, e apenas 1 (UMSCC-1) a partir de três linhas celulares no grupo resistente no estado inicial (Figura 5a). Após estimulação com EGF, os níveis de pERK aumentou significativamente em todas as linhas celulares. Sob esta condição, Dacomitinib ainda bloqueou a fosforilação de ERK níveis em todas as sete linhas celulares no grupo sensível e moderada. Para além de reduzir os níveis de pERK na linha resistente UMSCC-1, sob condição de EGF estimulada, dacomitinib também reduzidos níveis de pERK na linha resistente UMSCC-74A. Cetuximab só foi capaz de reduzir os níveis de pERK em um um moderado (FaDu) e uma linha sensível (SCC-9), resistente (UMSCC-74A). Em todos os cenários, dacomitinib causou maiores reduções nos níveis pERK que cetuximab.

As células foram cultivadas para log-fase e tratadas com 100 nM dacomitinib ou 100 ug cetuximab /mL durante 1 hora, com ou sem tratamento com 10 ng /ml de ligando de EGF recombinante. Células lisados ​​foram então colhidos e proteína foi resolvido utilizando análise de Western blot. B. imagens de Western blot foram quantificados usando software ImageJ. Os níveis de proteína foram quantificadas para cada linha de células e-se a média por grupo. Fosforilada ERK foi normalizada para ERK total. *. p 0,05, **. p . 0,01, t de Student

Western blot foram quantificados e grupo níveis específicos de pERK normalizar a TERK foram determinadas e comparadas (Figura 5b). Sem estimulação EGF, ambos os compostos reduziu significativamente os níveis pERK no grupo altamente sensível e grupos moderados, mas não grupo resistente. Em EGF estimulada condições, apenas a dacomitinib foi capaz de reduzir os níveis de privilégio. Em todos os cenários testados, dacomitinib causou maiores reduções nos níveis pERK que cetuximab.

Dacomitinib causa parada Greater G0 /G1 do que Cetuximab

Dacomitinib e cetuximab pode ter atividade antiproliferativa, induzindo a parada do ciclo celular e apoptose . Os mesmos dez linhas celulares seleccionadas para os ensaios de transferência de Western, que representam as respostas de proliferação de diferentes para os dois compostos, foram utilizados para analisar os efeitos sobre o ciclo celular e apoptose.

Dacomitinib causado maior do que a paragem do ciclo celular cetuximab. Após o tratamento com 100 nM de dacomitinib ou 100 ug cetuximab /mL durante cinco dias, houve um aumento significativo na percentagem de células na fase G0 /G1 nos grupos sensíveis e moderadas com dacomitinib mas não com cetuximab em comparação com o controlo (Figura 6a ). Embora cetuximab causou alguns detenção G0 /G1, este efeito não foi significativo comparado com o controlo e significativamente menor do que o efeito de dacomitinib em ambos os grupos sensíveis e moderadas. Havia menos do que cinco por cento de diminuição na fase S em todas as condições, excepto para o grupo tratado com dacomitinib moderada, que apresentaram uma redução significativa (Figura 6b). A tendência geral dos efeitos na fase S imitava os efeitos na fase G0 /G1. Consistentemente, dacomitinib tratamento dos grupos sensíveis e moderadas causou uma maior diminuição no G2 do que o tratamento com cetuximab (Figura 6c).

As células foram tratadas com 100 nM dacomitinib ou 100 ug cetuximab /mL durante cinco dias antes da análise usando fluxo citometria. Os dados apresentados é a porcentagem média de células nos trabalhos de grupo a partir da Figura 2. A. Mudança na percentagem de células na fase G0 /G1. B. Mudança na percentagem de células em fase S. C. Alteração na percentagem de células em fase G2. *. p . 0,05, t de Student

Dacomitinib foi tão eficaz como cetuximab na indução de apoptose. Nos grupos sensíveis e moderados, ambos os compostos provocaram uma diminuição na percentagem de células que estavam vivos (Figura 7A). Houve um aumento concomitante na percentagem de células que estavam num estado de apoptose precoce ou tardia (Figura 7B, Figura 7C). Menos de 6% das células foram mortas em qualquer uma das experiências (Figura 7D). Nenhuma das drogas causou apoptose significativa no grupo resistente. Não houve uma diferença significativa entre os compostos na indução de apoptose.

A. Alterações nas células% de vida. B. Alterações na célula em apoptose precoce. C. alterações nas células no final de apoptose. D. Mudanças em células mortas%.

Dacomitinib é mais eficaz no bloqueio de EGFR Sinalização do que a pequena molécula de tirosina-quinase Inibidor Erlotinib

Tal como referido anteriormente, a resposta ao altamente específico EGFR-dirigida a terapia pode ser baixa porque há talvez cooperação e sinalização redundância entre os diferentes membros da família de receptores ErbB. Assim, avaliou-se dacomitinib, um inibidor panHER com especificidade ampla, em um painel de 27 HNSCC e mostrou linhas de células de carcinoma epidermóide são mais sensíveis a ele do que a pequena erlotinib inibidor da molécula anti-EGFR de tirosina-quinase e o cetuximab anticorpo anti-EGFR em ensaios de proliferação (ver Figura 1) e utilizando um subconjunto de dez linhas de células que mostrou que dacomitinib foi mais eficaz a bloquear a sinalização do EGFR do que o cetuximab. A caracterização de dacomitinib foi feito em comparação com cetuximab, a única FDA aprovou agente anti-EGFR no tratamento de carcinoma epidermóide. No entanto, erlotinib e dacomitinib são ambos inibidores de moléculas pequenas como o cetuximab oposição que é um anticorpo e, assim, a capacidade do erlotinib para bloquear a sinalização do EGFR foi avaliada utilizando Western blotting.

Três linhas de células que representam as três classes de sensibilidade descrito antes foram examinados . Na linha sensível HN5 dacomitinib foi mais eficaz a bloquear a sinalização do EGFR que seja cetuximab ou erlotinib (Figura 8A). Apenas as células HN5 tratados com 100 nM de dacomitinib tinham níveis significativamente mais baixos ou pEGFR comparação com o controlo. EGFR sinalização na linha moderadamente sensível, UMSCC-38 e UMSCC-17B foi baixa.

As células foram cultivadas para log-fase e tratadas com 100 nM dacomitinib, 100 erlotinib nM ou 100 ug cetuximab /mL durante uma hora . Células lisados ​​foram então colhidos e proteína foi resolvido utilizando análise de Western blot. B. imagens de Western blot foram quantificados usando software ImageJ. Os níveis de proteína foram quantificadas para cada linha celular. Fosforilada ERK e AKT foram normalizados para alfa tubulina e apresentado como um% do controle.

mudanças mais significativas foram observadas nos downstreams PI3K-AKT-mTOR e Ras-Raf-MAPK caminho, como dacomitinib foi significativamente mais eficaz no bloqueio de ambas a fosforilação da AKT e ERK (Figura 8A). As transferências de Western foram quantificadas e os níveis de pAKT e pERK foram apresentados como percentagem do controlo após normalização para alfa tubulina para controlar a proteína total (Figura 8B). HN5 células tratadas com 100 nM de erlotinib tiveram duas vezes mais pAKT como as tratadas com 100 nM de dacomitinib. UMSCC-38 de células tratadas com 100 nM de erlotinib tinham 17 vezes mais pAKT do que aqueles tratados com a mesma concentração de dacomitinib. Do mesmo modo, embora todas as três drogas foram eficazes uma ERK fosfo bloqueio na linha sensível HN5, UMSCC-38 tratadas com 100 nM de erlotinib tinha sinal 4 vezes mais do que pERK UMSCC-38 células tratadas com a mesma concentração de dacomitinib. Erlotinib foi menos eficaz em bloquear tanto ERK fosfo e AKT na UMSCC-38 em comparação com cetuximab e dacomitinib. Na linha resistente UMSCC-17B, nem erlotinib nem dacomitinib teve efeito significativo sobre pAKT mas dacomitinib foi mais eficaz no bloqueio de nível pERK de erlotinib (Figura 8B).

Para avaliar se uma dependência da dose pode ser visto usando um maior concentração de dacomitinib (1 uM) foi testado no bloqueio de ERK e sinalização mediada por AKT na linha resistente, UMSCC-17B. Em comparação com 100 nM de tratamento, as células UMSCC-17B tratados com 1 uM dacomitinib teve uma redução de 25% no pAKT e redução de 21% no pERK (Figura 8A e 8B).

Discussão

O irreversível pan-ErbB dacomitinib inibidor está atualmente na Fase III de ensaios clínicos para o tratamento de pacientes com câncer de pulmão e mostrou atividade promissora no tratamento desta doença maligna (https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01000025). Buscou-se comparar os efeitos de dacomitinib com cetuximab, um inibidor EGFR, que é a atualmente a única terapia direcionada aprovado pelo FDA para o tratamento HNSCC e erlotinib uma pequena molécula inibidora EGFR ainda não aprovado pela FDA para CECP. Nós fornecemos evidências de que o tratamento com um pan-HER inibidor tais dacomitinib é mais eficaz do que usar o EGFR inibidores específicos cetuximab e erlotinib.

Nossos dados demonstram a eficácia da dacomitinib em que revoga o crescimento das linhas de células de carcinoma epidermóide in vitro. Os nossos dados mostram que as linhas celulares que exibem inibição do crescimento dramático com cetuximab também exibiram inibição significativa do crescimento com dacomitinib, o que demonstra, no mínimo, a falta de inferioridade de dacomitinib comparação com cetuximab. De interesse clínico é que 3/27 linhas celulares, 11% do painel, experimentou mais de 90% de inibição de crescimento com cetuximab, que é uma reminiscência da observação clínica de uma taxa de resposta de 10% observado em pacientes recebendo terapia com cetuximab. Estes três linhas de células eram sensíveis a dacomitinib bem com g valores de IC50 inferior a 10 nM. Se esta observação pré-clínico detém clinicamente, nós poderia prever aqueles pacientes que respondem ao cetuximab responderia também às dacomitinib.