Abstract

Predição de recorrência do câncer em pacientes com cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) atualmente conta com a avaliação de características clínicas, incluindo idade, estágio do tumor, e tabagismo. Uma melhor previsão de pacientes com câncer fase inicial dos pacientes de sobrevivência mais pobre e fase tardia com melhor sobrevida é necessário para projetar protocolos de tratamento sob medida para o paciente. Analisou-se a expressão de genes em ARN a partir de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) de doentes com NSCLC para identificar assinaturas preditivos de sobrevivência global do paciente. Nós achamos que os padrões de expressão genética PBMC de pacientes com NSCLC, como padrões de tumores, tem previsão de informações de resultados para o paciente. Nós identificar e validar um 26 gene painel de prognóstico que é independente do estágio clínico. Muitos genes prognósticos adicionais são específicos de células mielóides e são mais expressos em pacientes com menor sobrevida. Também observamos que um número significativo de genes prognósticos alterar os níveis de expressão em PBMC recolhidas após a ressecção do tumor. Estes perfis de expressão de gene de pós-cirurgia pode proporcionar um meio para voltar a avaliar o prognóstico ao longo do tempo. Estes estudos sugerem também que os resultados dos pacientes não são apenas determinada pelos perfis de expressão de genes de tumor, mas também pode ser influenciada pela resposta imunitária tal como reflectido em células imunitárias periféricas

citação:. Kossenkov AV, Dawany N, Evans TL, Kucharczuk JC, Albelda SM, Showe LC, et ai. (2012) periférica Immune Gene Expression celular prediz sobrevida de pacientes com Non-Small Cell Lung Cancer. PLoS ONE 7 (3): e34392. doi: 10.1371 /journal.pone.0034392

editor: Rui Medeiros, IPO, Inst Porto Oncology, Portugal |

Recebido: 16 de dezembro de 2011; Aceito: 27 de fevereiro de 2012; Publicado: 29 Março 2012 |

Direitos de autor: © 2012 Kossenkov et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Departamento de concessão de Liquidação Saúde Tabaco (SAP 4100020718) Pennsylvania; o Departamento de Saúde da Pensilvânia Commonwealth Universal Programa de Melhoramento de Investigação da; Apoio Grant Cancer Center Wistar (CA010815 P30); National Institutes of Health (K07 CA111952) para A. V. e (T32 CA 09171) para A.V.K. O projeto utilizou as Wistar Institute Genomics e instalações Bioinformática suportados pelo Suporte Grant Cancer Center Wistar (P30 CA010815). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é a causa mais comum de mortalidade por cancro em todo o mundo, sendo responsável por 157,300 mortes por câncer nos Estados Unidos sozinho em 2010 [1]. A sobrevida global de cinco anos para o câncer de pulmão é de 16%, eo prognóstico é fortemente associada com o estágio da doença no momento do diagnóstico [2]. cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) é responsável por 80% de todos os casos de câncer de pulmão.

Os protocolos de tratamento e avaliação prognóstica de pacientes com NSCLC são baseadas principalmente no estágio TNM. A ressecção cirúrgica para a doença em estágio inicial (fase I, II, e alguns Stage III) continua a ser o padrão de atendimento. Infelizmente, 30-60% dos pacientes (dependendo do estágio) irão desenvolver uma recorrência e morrer de sua doença, levando a uma taxa de sobrevida em 5 anos de 35-70% para os pacientes após a ressecção. É evidente que há uma necessidade não atendida de fatores prognósticos adicionais para um processo mais informada do tratamento.

Há uma heterogeneidade significativa nos resultados clínicos para pacientes com NSCLC fase inicial ea base é desconhecida. Vários estudos anteriores voltadas para a expressão do gene em tumores excisados ​​cirurgicamente para identificar assinaturas prognósticos foram recentemente revista [3], [4]. Nenhum ainda foi aprovado para uso clínico.

Nós já mostrou que pacientes com NSCLC têm alterações de expressão de genes significativas em sua PBMC que fornecem marcadores diagnósticos úteis (5) e esta assinatura câncer de PBMC é reduzido ou eliminado em um subconjunto de pacientes reanalisada após a ressecção do tumor [5]. Uma vez que as mudanças na expressão gênica PBMC são um reflexo das interações do tumor e do sistema imunológico, temos agora analisados ​​os dados de expressão gênica e demonstrar uma assinatura associado à sobrevida global. Mostramos também que alguns genes PBMC associados à sobrevida mudar sua expressão em amostras colhidas após a ressecção do tumor e pode fornecer um indicador adicional de recorrência.

Materiais e Métodos

População do estudo

Um total de 137 pacientes com diagnóstico recente de histologicamente confirmados de câncer de pulmão de células, não pequenas (NSCLC) foram recrutados a partir da Universidade da Pensilvânia Medical Center durante o período de 2003 a 2007. consentimento informado por escrito foi recebida de todos os participantes envolvidos no estudo e as amostras foram coletadas com a aprovação de ambos Universidade da Pensilvânia IRB e Wistar IRB. Para esta análise, apenas indivíduos com estágio I-III NSCLC submetidos a ressecção cirúrgica com intenção curativa foram incluídos. Os critérios de exclusão incluíram ressecção sub-lobar, margens cirúrgicas positivas e morte dentro de 30 dias da cirurgia. Isto resultou na inclusão de 108 pacientes nesta análise (Tabela S1). Todos os participantes tiveram a coleta de sangue antes da cirurgia e 15 dos 108 pacientes também tinham sangue coletado após a cirurgia. A tabela 1 resume os principais parâmetros prognósticos identificados pela Rede Comprehensive Cancer Nacional (NCCN) para a nossa população de estudo. Clínica informação sobre os resultados e sobrevivência foi obtida através de revisão de prontuários, telefone de contato, ou a partir do Índice de morte de Segurança Social (SSDI).

As amostras de sangue PBMC recolha e tratamento

foram tiradas na Universidade da Pensilvânia Medical Center, em dois tubos “” CPT (Becton Dickinson). As células mononucleares de sangue periférico (PBMC) foram isoladas dentro de 90 minutos de colheita de sangue, lavou-se em PBS, transferidas para RNAlater (Ambion), e, em seguida, armazenada a 4 ° C durante a noite antes da transferência para -80 ° C. purificação do RNA foi realizada usando TriReagent (Molecular Research), como recomendado, e para a qualidade controlada usando o Bioanalyzer. Somente amostras com índices 28S /16S de 0,75 foram utilizados para estudos posteriores. Uma quantidade constante (400 ng) de RNA total foi amplificado, como recomendado pela Illumina, para análise da expressão gênica.

Microarray pré-processamento

As amostras foram processadas e hibridizadas com o todo humano Illumina WG-6v2 matrizes genoma do grânulo. Todas as matrizes foram processados ​​na instalação Wistar Institute Genomics, como descrito anteriormente [6] e, em seguida, os valores de expressão gênica foram log

2 transformado para análise posterior. Os dados da matriz utilizados para estes estudos estão publicamente disponíveis no banco de dados GEO através do número de acesso GSE13255. Tabela S1 lista os 108 indivíduos usados ​​para análise.

Métodos Estatísticos

análise de fator de risco.

A análise de regressão univariada de Cox foi realizada para testar a associação de fatores de risco clínicos e individuais a expressão do gene com a sobrevida global. regressão multivariada de Cox foi utilizado para testar a associação de uma combinação de factores. A significância estatística foi definida como

P Art 0,05. taxa de detecção falsa para a associação de genes com a sobrevida global foi determinada de acordo com Storey et. ai. [7]. Associação de sobrevida global com o estágio do tumor foi feito tanto por tratamento de estágio como uma variável contínua e como dois grupos: a fase I e uma fase combinada II acrescido III. Os resultados foram significativos para ambas as abordagens com análises de regressão uni e multivariada. Como o número de tumores em estágio II foi pequena (14 pacientes) e ainda menor quando os dados foram divididos em conjuntos de treinamento e validação independente, decidimos combinar estágio II e III para ter um tamanho maior grupo na etapa de validação. Utilizamos a combinação de fase II e III em todo o manuscrito para a consistência.

curvas de Kaplan-Meier.

curvas de Kaplan-Meier foram plotados usando Matlab v7.2 baseada em dados de sobrevivência censuradas. Os pacientes foram estratificados pelo fator médio, salvo indicação contrária. Seleção

Painel de Gene.

Para identificar um conjunto de genes associados com a sobrevida global, dividir o conjunto de dados de 108 amostra para treinamento e testes conjuntos de igual tamanho (54 amostras aleatórias em cada). O conjunto de treino foi analisado primeiro a identificar um gene painel resultado informativa, identificando sondas com o menor valor-p de regressão de Cox univariada média nas 50 testes de 40 amostragens aleatórias (75% do conjunto de treinamento). Os 100 melhores genes foram então usadas para a regressão multivariada de Cox com estimativas L1 e L2 penalizadas [8]. O λ1 e λ2 hiperparâmetro par final selecionado deu o melhor desempenho utilizando 10-fold cross-validation no conjunto de treinamento. Este método resulta em um modelo consiste nos genes N, que têm coeficientes diferentes de zero de regressão c

1 … c

N. Esses coeficientes, juntamente com os correspondentes dados de expressão de genes para qualquer paciente

i

(X

1-I … X

Ni) foram utilizados para calcular um escore prognóstico gene (GPS) para o paciente como se segue: GPS = c

1X

1-J + … + c

NX

NJ.

a validação independente do painel gene preditivo.

os 54 pacientes de lado e não utilizados para selecção gene preditivo foram usados ​​como um conjunto independente de teste para avaliação do modelo desenvolvido no conjunto de treinamento. Significância dos GPS como fator prognóstico sobre o conjunto de validação externa foi estimada pela regressão de Cox univariada. Independência dos fatores de GPS e Palco foram testadas por meio de regressão multivariada de Cox.

robustez Testing da seleção painel gene.

Para mostrar que o significado da validação independente (performance) do modelo de GPS em o conjunto de teste não dependem da divisão de dados de teste de formação específica, realizamos 100 splits aleatórios e mostrou a qualidade de separação entre pacientes de baixo e alto risco em conjuntos de teste é independente de qualquer divisão de dados particular. (Figura S1)

testes de eficácia de indicadores de prognóstico.

A eficácia dos indicadores de prognóstico foi testada comparando as taxas de risco e concordâncias. As razões de risco foram calculadas entre os grupos de alto e baixo risco. Concordância foi estimada utilizando o pacote de R

clinfun

[9].

Análise

Gene enriquecimento.

O teste para funções biológicas e caminhos sobre-representadas em uma lista gene foi feito usando software DAVID [10] com os limites estabelecidos na taxa de descoberta de falsas (FDR) FDR 20% e enriquecimento 2 vezes. Para obter uma lista de genes com alta taxa de detecção falsa (52% em 1704 genes associados com a sobrevida global) relatamos apenas os resultados que passar o limiar da FDR 1% e também mostrar enriquecimento significativo pelo algoritmo GSEA [11], [12] com o FDR . 25% de corte

Enriquecimento de genes específicos de células do tipo imune

Obtivemos uma lista de genes especificamente expressos em 8 categorias de tipos de células imunitárias, incluindo células T, células B, NK. células, as células dendríticas, os monócitos, neutrófilos, células linfóides e células mielóides, a partir do banco de dados de resposta imune em silico (IRIS) [13], [14]. Testamos se esses genes foram sobre-representados na nossa lista de 1704 genes significativamente associados com a sobrevida global. Foi utilizado o teste exato de Fisher para cada tipo de célula para 3 grupos diferentes de genes separadamente: 1) todos significativamente associado à sobrevida global, 2) genes com HR 1 e 3) genes com HR 1. No geral, 24 testes (8 tipos de células × 3 grupos de genes) foram realizados e relatamos p-valores ajustados para testes múltiplos com correção de Bonferroni.

Gene sobreposições.

Significado das sobreposições entre dois grupos de genes (com um número e B de genes) selecionados a partir do mesmo conjunto de C = 20,341 genes expressos foi testada usando o teste hypergeometric. O número esperado de genes sobrepostos foi calculada como (A × B) /C.

Resultados

Associação de sobrevida global com fatores de risco clínicos

Vários fatores foram testados para a associação com a sobrevivência de regressão de Cox univariada, incluindo estágio do tumor, idade, sexo, raça, presença de DPOC, histologia do tumor, o uso do tabaco e quimioterapia adjuvante (Tabela 1). Descobrimos que dois fatores, a idade avançada e estágio do tumor, foram significativamente associados com a sobrevivência com taxas de risco de 1,04 por aumento ano e 2,49 para o estágio do tumor, respectivamente. A Figura 1 demonstra as curvas de Kaplan-Meier para os dois factores. Quando essas duas variáveis ​​foram testadas em conjunto em um modelo de regressão multivariada de Cox, ambos manteve-se estatisticamente significativa (Tabela 1), indicando que eles estão independentemente associadas com a sobrevivência em nossa população de estudo e que o nosso conjunto de dados está em conformidade com os marcadores previstos de prognóstico clínico.

Previsão da sobrevida global por um painel de genes PBMC

a fim de identificar e independentemente validar um painel gene compacto, que poderia ser usado para prever a sobrevida global, dividimos nossos 108 amostras em 2 grupos selecionados aleatoriamente de 54 amostras. Foi utilizado um conjunto de treinamento de 54 amostras para selecionar o painel gene prognóstico, e, em seguida, confirmou a sua utilidade sobre os restantes 54 amostras reservados como um conjunto de teste. Aplicamos regressão de Cox multivariada com estimativas L1 e L2 penalizadas [8] para o conjunto de treinamento, e identificou 26 genes (Tabela 2) cujos padrões de expressão quando combinados em um modelo linear, melhor previu os dados de sobrevivência observados. Para cada sujeito, este modelo proporciona uma pontuação de prognóstico Gene (GPS) que é calculada como uma combinação linear dos valores dos 26 genes de prognóstico de expressão. Os GPS atribuídos a cada paciente foi encontrado para ser significativamente associada com a sua sobrevivência para os 54 indivíduos no conjunto de treinamento com

P

= 3 × 10

-5. O desempenho foi confirmada no conjunto de validação (

P

= 0,009), demonstrando que a PBMC derivadas GPS é um preditor estatisticamente significativo de sobrevida global em pacientes novos. As curvas de Kaplan-Meier para pacientes do conjunto de validação e suas atribuições em qualquer um alto risco ou categoria de baixo risco com base no GPS média são mostrados na Figura 2A. Esses estudos mostram que os níveis de expressão PBMC para as sondas 26 genes desenvolvidos em nosso conjunto de treinamento também pode predizer com sucesso a sobrevivência no conjunto de validação e, por extensão, sobre quaisquer novos pacientes.

A. As curvas de Kaplan-Meier para pacientes do conjunto de teste estratificada por a mediana de GPS calculados a partir da expressão de 26 genes. p-valor para regressão de Cox univariada é mostrado. curvas B. Kaplan-Meier comparando as probabilidades de sobrevivência para pacientes do conjunto de teste estratificados por Stage sozinho e combinação de Palco e GPS com 35 pacientes no grupo de menor risco (número de pacientes em estágio I) e 19 maior grupo de risco (número de fase II /pacientes III).

dados

expressão do gene e estágio do tumor são preditores independentes de sobrevivência

Nós ainda avaliou se os GPS fornecida valor adicional para os fatores de risco clínicos para a sobrevivência nós tinha testado. Destes, apenas idade e estágio do tumor foram encontrados a ter valores prognósticos significativos para o nosso conjunto de dados. Embora a idade foi significativamente associada com a sobrevivência em análise utilizando informações todos os 108 pacientes “(Tabela 1), não tem valor prognóstico significativo quando aplicado ao conjunto de teste de 54 amostras (

P

= 0,34). Por esta razão, nós não incluem a variável idade nas seguintes análises.

Com base nos dados do conjunto de validação, o preditor palco sozinho gerou uma taxa de risco de 3,0 (

P

= 0,0095, IC 95% 1,3 a 6,9). Quando usado no modelo de regressão multivariada de Cox, ambos Palco e GPS foram significativas (

P

= 0,004 para o palco e

P

= 0,003 para o GPS), indicando que as duas variáveis ​​são preditores independentes de sobrevida global e que usá-los juntos deve aumentar o poder de prognóstico. Para avaliar este aumento, nós então comparadas as taxas de risco para a fase sozinho para as taxas de risco para os fatores de Estágio + GPS combinados. Palco sozinho dividir os pacientes em 19 pacientes de maior risco (o número de fase II /III casos) e 35 pacientes de menor risco (o número de estágio casos I).

.O Stage + GPS preditor combinada resultou em uma significativa hazard ratio de 4.9 (

P

= 0,0003, IC 95% de 2,1-11,4) entre os grupos de alto e baixo risco, um aumento em comparação com a taxa de risco demonstrado por si só Stage preditor (HR = 3.0) ou GPS preditor sozinho (HR = 1,9). Isto é ilustrado pelas curvas de Kaplan-Meier (Figura 2B).

Alternativa quantificação da capacidade da expressão do gene marcador para melhorar a previsão de sobrevivência foi realizada por determinação do índice de concordância para o modelo de regressão de Cox para a fase sozinho : 0,63 (0,56-7,0), GPS sozinho: 0,57 (0,51-0,62), e estágio + GPS: 0,69 (,62-,76). O aumento do índice de concordância, juntamente com a prova da independência dos dois fatores suporta a utilidade de usar ambas as pontuações de palco e de expressão de genes para determinar probabilidade de sobrevivência em comparação com apenas usando palco. Este resultado demonstra que uma pontuação de expressão do gene pode adicionar informações de prognóstico para a variável de estágio do tumor tradicional.

Como adicionar o fator de GPS com a classificação por etapa resultou na redistribuição de 6 pacientes entre os grupos de alto e baixo risco. Três dos 6 com a fase I NSCLC (um IA e dois IB pacientes) foram realocados para o grupo de alto risco. Dois desses pacientes realmente morreu no prazo de 18 meses (P1240, estágio IB) e 43 meses (p1183, estágio IA) da coleta de amostras. O paciente 1B adicional (p1246) permaneceu viva por pelo menos 65 meses. Este indivíduo era um dos pacientes mais jovens na nossa coorte (apenas 47 em comparação com 45 anos de idade mínima). Inclusão do fator idade no modelo pode ter alterado a atribuição ao grupo de alto risco. Os outros 3 pacientes apresentavam doença estágio II NSCLC. Eles foram classificados pelo palco como de alto risco e, em seguida, transferido para o grupo de baixo risco ao adicionar o fator de GPS. Todos os três pacientes (p1589, p1561 e p1445) estavam vivos no momento da avaliação do estado (44, 46 e 56 meses, correspondentemente). Estes resultados suportam a utilidade de um modelo de GPS + estágio combinado para a estimativa mais precisa do prognóstico.

funções do gene PBMC associados à sobrevida global

A fim de determinar se as funções ou caminhos específicos foram representados em os padrões de expressão de genes associados com sobrevivência PBMC, foi utilizada a regressão univariada de Cox para identificar os genes que foram significativamente associados com o resultado utilizando todos os 108 amostras de doentes. Encontramos 1704 sondas que apresentaram significância a

P Art 0,05 e selecionados essas sondas para funções enriquecidas e vias utilizando tanto DAVID e software GSEA. Esta análise revelou várias categorias funcionais altamente significativas com o enriquecimento de 2 vezes ou mais (Tabela S2). Em particular, uma lista de 32 genes estrutura e relacionadas com a função ribossomais (de enriquecimento de 2,3) tiveram maior expressão em pacientes com melhor sobrevida, enquanto os genes do ciclo celular em geral (de enriquecimento de 2,3) e, especificamente genes fase M (de enriquecimento de 2,2) foram predominantemente expresso em níveis mais baixos nos pacientes com melhor sobrevida.

tipos de células imunes associadas com a sobrevivência

Uma vez que a expressão do gene foi analisada em mRNA PBMC, determinou-se os genes significativamente associada à sobrevida foram também específicas para um determinado tipo de célula imune tal como definido pela resposta imune in silico (IRIS) do banco de dados [13], [14]. Dos 669 genes específicos de células imunitárias no nosso conjunto de dados, 79 verificou-se estar associada com a sobrevivência global (Tabela 3). Encontramos um enriquecimento significativo de genes específicos de células T (23 no total, 8 overrepresentation vezes,

P

= 2 × 10

-8), com 15 dos 23 genes tendo HR 1 indicando uma significativa correlação entre os níveis mais baixos de expressão e melhorou a sobrevivência. Nós também descobrimos que a menor expressão de 21 genes específicos mielóides (de enriquecimento de 2 vezes,

P

= 0,048) foi associado à sobrevida global melhorada. listas detalhadas de genes associados a cada tipo de célula e enriquecimentos e p-valores correspondentes estão listados na Tabela S3.

a retirada do tumor muda expressão de genes associados à sobrevivência

Nós mostramos anteriormente que a expressão do gene de PBMC na presença de um NSCLC é significativamente alterada em pós-cirurgia amostras de PBMC [5], [6]. Descobrimos que a expressão de mais de 20% (383) das 1704 genes de “sobrevivência” triados neste estudo também foi mudado significativamente através da remoção cirúrgica do tumor do pulmão (3485 genes com valor de p 0,05 pelo teste t emparelhado , FDR 20%). Este é um número estatisticamente significativo em comparação com a sobreposição 292 gene esperado pelo acaso (

P

= 10

-9 pelo teste hypergeometric). Foram identificados 4 classes de genes associados ao desfecho (Figura 3) que alteram os níveis de expressão pós-cirurgia. Dois dos grupos de genes (A e D) foram significativamente sobre-representados e que descrevem estes 2 classes. O maior grupo (grupo A) de 236 genes têm HR 1 (melhor de sobrevivência para maior expressão) e são reprimidos em PBMC após a remoção do tumor. O segundo grupo (grupo D) inclui 92 genes com HR 1 (pior sobrevida com maior expressão) foram regulados positivamente em PBMC após a remoção do tumor. Estes genes prognósticos, que também mudam de expressão após a remoção do tumor, poderia proporcionar um novo método para determinar a reincidência.

# obs. = Número observado de genes; # Exp. = Número esperado de genes por acaso; Pré = expressão na amostra pré-operatório; Post = expressão na amostra de pós-operatório; Rácio HR = Perigo em alta vs baixa expressão do gene.

análise de enriquecimento funcional de genes do grupo A mostra forte representação de proteínas associadas com ribossomas, a síntese de proteínas, a função mitocondrial, atividades factor de translação e dedo de zinco proteínas, características consistentes com PBMC ser mais ativo em resposta à presença do tumor e, aparentemente, uma melhor para a sobrevivência. Grupo D mostra o enriquecimento funcional apenas para os genes associados com a função da célula vermelha indicando possivelmente números mais baixos de eritroblastos que circula na presença de um tumor, mas a sobrevivência mais pobre com maior expressão.

Discussão

A capacidade de identificar com precisão os pacientes com cancro do pulmão que têm um mau prognóstico é particularmente importante para os pacientes com doença Estágio I que são conhecidos por variar significativamente em probabilidade de reincidência. Prevendo que os tumores são mais susceptíveis de se repetirem é fundamental para a concepção de tratamento após a cirurgia, em particular para a fase IA pacientes, o que normalmente não recebem quimioterapia adjuvante. Atualmente, os indicadores de prognóstico mais eficazes são características demográficas (idade do paciente, sexo, história de tabagismo) e parâmetros clínicos (tamanho do tumor, estágio e envolvimento de gânglios linfáticos). Um número de estudos de expressão de genes em tumores pulmonares que apresentam algoritmos de prognóstico foram recentemente revisto [4]. Uma análise [15] treinados e validados em dados publicamente disponíveis descreve uma assinatura prognóstico 5-gene para todas as fases, incluindo adenocarcinoma estágio I (mas não o carcinoma de células escamosas). Um problema com os estudos de tumores tem sido a falta de reprodutibilidade, possivelmente devido a diferenças na qualidade da amostra e representação de células de tumor nas amostras. Abordagens utilizando sangue ou soro para identificar os indicadores de prognóstico evitar alguns dos problemas associados a variabilidade do tumor e os perfis de expressão de microRNA no soro ou plasma têm sido aplicadas a ambos NSCLC diagnóstico [16], [17] e estudos de prognóstico por dois grupos [18], [19]. Hu et al [19], utilizando o soro de 243 pacientes, encontrou um conjunto de prognóstico de 4 miRNAs que, quando treinado em metade dos pacientes poderiam prever a sobrevivência na metade restante. Ambos os grupos sugerem que suas descobertas permitirá separação de baixo de pacientes de alto risco, melhorar o prognóstico somente pela fase.

As interações entre um tumor eo sistema imunológico têm sido um assunto de interesse na biologia do câncer [20]. Nós já descobriram que PBMC assinaturas de expressão de gene podia distinguir pacientes com cancro do pulmão de pacientes com doenças pulmonares não malignos. Os estudos aqui apresentados demonstram que as assinaturas de expressão de genes nas células do sistema imunológico periférico de doentes com NSCLC também conter informação que está correlacionado com a sobrevivência e, como assinaturas obtidas a partir de tumores do pulmão, pode melhorar preditores clínicos de resultado. Em nosso estudo, identificamos um painel de 26 sondas de genes cujos padrões de expressão estão significativamente associados com a sobrevivência e esta informação é independente das informações fornecidas pelos estágio do tumor. Mostramos também que alguns genes correlacionados com o prognóstico são linhagem de células imune específica. As mudanças mais marcantes estavam nos genes específicos mielóides que mostram uma correlação inversa entre a expressão e sobrevivência. Como mostrado na Tabela S3, 29 dos 30 genes especificamente associada com monócitos, neutrófilos, ou “células mielóides”, têm aumentos na expressão em pacientes com diminuição dos tempos de sobrevivência. Estes dados são consistentes com observações de que um aumento das populações de células mielóides imaturas no sangue e em tumores associados com cancros avançados e prognóstico pobre, provavelmente devido à capacidade destas células para promover a angiogénese e a suprimir as respostas imunitárias anti-tumor [21] [22], [23], [24]. Números elevados de neutrófilos têm se mostrado preditores de mau prognóstico no melanoma, câncer de ovário e câncer de cabeça e pescoço [25]. genes de células T associado com prognóstico, também têm taxas de risco predominantemente superiores, mas o mecanismo pelo qual estes genes afectam a sobrevivência do paciente não é ainda clara.

Um número significativo de genes que PBMC mudança na expressão após a remoção de um tumor também estão associadas com o prognóstico. A maior classe (grupo A, Figura 3) inclui os genes que são expressos em níveis mais elevados, na presença de um tumor em comparação com amostras do mesmo paciente tirada após a remoção do tumor e cuja expressão mais elevada indica uma melhor sobrevivência. O gene mais diferencialmente expressos neste grupo é o gene de resposta imune

CXCR4

, importante para o tráfico de linfócitos [26], [27]. O seu ligando,

SDF-1 | /

CXCL12

, é um factor chave dirigir a migração de células dendríticas associada a uma resposta imune adaptativa [27], [28] Em contraste, outro grande grupo de genes (grupo D) mostram o comportamento oposto que tem altos índices de perigo indicando função de sobrevivência pobres e níveis mais baixos na presença de um tumor. análise DAVID desta classe gene mostra enriquecimento para genes significativamente associados com as funções de oxigenação, hipóxia e ferro de ligação (

HGBD

,

HGB1

,

HGB2

) e eritróide associado fator (

ERAF

). Estes são presumivelmente constituintes dos eritroblastos conhecidos para co-purificar com a PBMC [29], [30]. menor expressão desses genes na presença do tumor pode indicar que a expressão do gene de eritroblastos (ou números de eritroblastos) é reprimido de acordo com outros estudos, como pobre oxigenação e anemia têm sido previamente associado com o cancro do pulmão [31], [32]. Relativamente mais alta expressão destes genes em pacientes com menor sobrevivência pode ser devido ao aumento da presença de eritroblastos em resposta à oxigenação deterioração associada à doença mais grave. Em geral, a sobre-representação significativa de genes dos grupos A e D sugere que a medição da alteração desses genes entre pré-emparelhado vs amostras pós-cirurgia a partir do mesmo paciente, pode reflectir a capacidade do sistema imune para responder ao tumor, e pode fornecer adicionados informações para a previsão do resultado, comparando amostras coletadas antes com amostras coletadas após a remoção do tumor. Além disso, os genes desses grupos podem ser candidatos para reavaliar probabilidades de recorrência do câncer em amostras de sangue pós-cirurgia regulares.

O uso de fatores prognósticos combinadas incluindo estágio clínico, tumor assinatura de expressão gênica e assinaturas de gene PBMC poderia fornecer adicional orientações para a prescrição de quimioterapia adjuvante para o câncer em estágio inicial que, atualmente, não de outra forma seriam tratados após a cirurgia. Achamos que a expressão do gene de paciente PBMC é um preditor independente de sobrevivência, e que quando a expressão do gene PBMC é combinado com informações do estágio do câncer, a taxa de risco de estar sozinho estágio é aumentada 3,0-4,9. O tamanho limitado do conjunto de dados não permitiu o teste para o prognóstico dentro de um único estágio do câncer, mas nós achamos que os pacientes duas fases I estão correctamente transferido para o grupo de alto risco, combinando a assinatura de sangue GPS com o prognóstico baseado palco.

a evolução de um tumor maligno inclui as interacções entre as células cancerosas e de sinalização com outras células do microambiente do tumor, incluindo células do sistema imunológico. Nossos estudos sugerem que estas interacções não são apenas localizados no local do tumor, mas também se estendem para o sistema imunitário periférico e que a informação relacionada com o prognóstico ou recorrência está presente nos perfis das células imunitárias periféricas de expressão de genes. Em contraste com as assinaturas de prognóstico baseia-tumorais que reflectem malignidade, assinaturas prognósticos baseados PBMC reflectir o tipo e intensidade da resposta imunitária à presença do tumor. É provável que através da combinação de características clínicas de sobrevivência derivadas de tumores no momento da cirurgia, com avaliações repetidas de dados de GPS de PBMC derivadas, um algoritmo mais robusto para prever a recorrência pode ser desenvolvido que pode ser reavaliada em vários intervalos após a cirurgia. Além disso, os genes de células imunológicas associadas com os resultados dos pacientes podem ser alvos para a manipulação clínica para alterar a expressão do gene da chave, a fim de potenciar a resposta imunitária anti-tumoral e ajudar a reduzir a incidência da recorrência.

Enquanto adicional estudos com maior número de racialmente diversos pacientes precisam de ser realizado, o presente estudo demonstra que a informação estatisticamente significativa resultado pode ser detectado nos padrões de expressão de genes de PBMC de doentes com NSCLC. Esforços para recolher as amostras adequadas para abordar estas questões estão em andamento.

Informações de Apoio

Figura S1.

Distribuição de p-valores para a aplicação de modelo de ajuste no conjunto de treinamento com amostras de ensaio previstas. Para testar a generalidade da nossa abordagem, realizamos 100 seleções aleatórias de treinamento /teste define para estimar a possibilidade de que o nosso resultado pode ser explicado por uma selecção fortuita de pacientes. Com base na distribuição dos valores de p que mostram importância do desempenho no conjunto de teste, vimos 39% dos conjuntos de teste atingiu significância estatística de

P Art 0,05.