Abstract

gliomas de alto grau (Organização Mundial da Saúde grau III anaplásico astrocitoma e IV glioblastoma multiforme grau), o cérebro maligno primário mais prevalente tumores, exibir uma hierarquia celular com células, auto-renovação tumorigênicos-tronco cancerosas (CSCs) no ápice. Embora a hipótese CSC tem sido um modelo atraente para descrever muitos aspectos do comportamento do tumor, ele permanece controversa devido a questões não resolvidas, incluindo o uso de

ex vivo

análises com condições de crescimento diferencial. Uma população CSC foi confirmada em gliomas malignos por formação de tumores preferencial a partir de células isoladas directamente a partir de amostras de biopsias de pacientes. No entanto, a comparação directa de várias populações de células tumorais com a análise dos fenótipos resultantes de cada população dentro de um ambiente tumoral representante não foi claramente descrito. Para testar diretamente o potencial tumorigénico relativa de CSCs e células tumorais não estaminais no mesmo microambiente, nós interrogado populações tumorais combinados purificada a partir de um tumor humano primário transplantadas para um rato modelo de xenotransplante e monitorados

in vivo

crescimento competitivo tumor estudos utilizando série

in vivo

microscopia intravital. Enquanto CSCs foram uma pequena minoria da população de células cancerosas transplantadas inicial, o CSCs, não as células tumorais não-tronco, levou a formação de tumores e produziu tumores exibindo uma hierarquia celular. Nos tumores resultantes, uma fração dos CSCs transplantados iniciais mantida expressão de marcadores de células-tronco e de proliferação, que foram significativamente maiores em comparação com a população de células tumorais não-tronco e demonstraram que CSCs gerado heterogeneidade celular dentro do tumor. Estas comparações head-to-head entre CSCs combinados e células tumorais não-tronco fornecem a primeira evidência funcional usando imagens ao vivo que no mesmo microambiente, CSCs mais do que as células tumorais não-tronco são responsáveis ​​pela propagação do tumor, confirmando a definição funcional de um CSC

Citation:. Lathia JD, Gallagher J, Myers JT, Li M, Vasanji A, McLendon RE, et al. (2011) direto

In Vivo

Evidência para a propagação do tumor em células-tronco cancerosas Glioblastoma. PLoS ONE 6 (9): e24807. doi: 10.1371 /journal.pone.0024807

editor: Ilya Ulasov, da Universidade de Chicago, Estados Unidos da América

Recebido: 17 de junho de 2011; Aceito: 22 de agosto de 2011; Publicado: 22 de Setembro, 2011 |

Direitos de autor: © 2011 Lathia, et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Trabalho em o laboratório rico é suportado pelo Runyon Fundação Damon Cancer Research, Sociedade Nacional de Tumores cerebrais, Fundação Goldhirsh, James S. McDonnell Foundation, e NIH concede CA112958 (JNR), CA116659 (JNR), CA154130 (JNR), CA151522 (ABH), 5P50-NS-20023-26 (REM) e um Prêmio de Serviço de Pesquisa CA142159 Nacional (JDL). REM é apoiado pela Fundação Pediátrica do tumor cerebral. JNR é um investigador clínico Damon Runyon-Lilly apoiado pela Fundação de Pesquisa do Câncer Damon Runyon. ABH é apoiado pela Sociedade Nacional de Tumores do cérebro. AYH é suportado pela Fundação do St. Baldrick, a Fundação Dana, Cancer Research Institute, e Fundação Anjo da Gabrielle. JDL é apoiado por uma associação Brain Tumor americana Fellowship (patrocinado pelo Fundo Syverson Joelle). AYH e JDL reconhecer fundos do subsídio piloto do Processo Comprehensive Cancer Center (RES50-5509). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

tumores humanos comumente exibir uma heterogeneidade dentro de seu compartimento neoplásica que pode ser derivado de uma combinação de alterações no número de cópias genéticas estocásticos e uma hierarquia epigenética que co-evoluir com o tempo [1]. Integrando o conceito de que os tumores podem incluir uma população de células-tronco como responsável pela sua manutenção e propagação pode ser informativa, tanto para o cancro e células estaminais campos [2]. A hipótese CSC pode fornecer insights sobre resistência e tumor terapêutica recorrência e ressaltam a complexidade do cancro. A excitação em torno da hipótese CSC é temperada pela controvérsia em relação a apropriar sistemas modelo experimental para definir funcionalmente CSCs, frequência CSC, e imunofenótipos universalmente informativas [3]. células-tronco normais e neoplásicas estão actualmente definidos por ensaios funcionais de auto-renovação e diferenciação, com o ensaio mais preciso até o momento para CSCs sendo propagação do tumor. modelos de xenotransplante confirmaram a capacidade de formação de tumor melhorada das fracções CSC-enriquecidos em uma variedade de tumores humanos e têm sido usados ​​para estimar a frequência de células tumorais de propagação [4], que é bastante elevado para algumas malignidades [3]. À medida que o nicho no qual ambas as células estaminais normais e neoplásicas residir instrui auto-renovação e manutenção, animal vivo em técnicas de imagiologia in vivo têm sido aplicadas a algumas populações de células estaminais – células estaminais nomeadamente hematopoiéticas e leucémicas – para determinar os padrões de crescimento no microambiente nativa [ ,,,0],5], [6], [7], mas a aplicação a tecidos sólidos tem sido limitada. CSCs de tumores sólidos foram caracterizados em ensaios ex vivo ou populações como segregadas, que foram informativo para determinar as vias diferencialmente reguladas, mas têm impedido a análise direta do potencial de propagação do tumor entre as frações de células tumorais diferentes. Para avaliar o potencial das CSCs em comparação directa com células tumorais não estaminais num microambiente representativo, marcado diferencialmente fracções de células GBM derivadas de um tumor humano e monitorizado o comportamento do tumor num modelo de xenotransplante com o tempo usando microscopia intravital. Apesar de um pequeno número de CSCs no transplante, a propagação do tumor foi impulsionado por CSCs e seus descendentes, demonstrando a capacidade de CSCs, mas as células tumorais não non-tronco, para conduzir a formação de tumores e propagar heterogeneidade celular.

Materiais e Métodos

O transplante de células de glioma

células de glioma humanas foram obtidas com consentimento informado por escrito e sob aprovados protocolos IRB de Cleveland Clinic (protocolo 2559) e da Universidade de Duke (protocolo 7409). células de glioma foram transitoriamente passadas como xenoenxertos em ratinhos nus sob aprovado Cleveland Clinic IACUC protocolo ARC 8699 e in vivo de imagens foi realizada sob Case Western Reserve University Protocolo 2009-0109). Para os estudos iniciais de formação de tumor CSC, a amostra de tumor utilizadas (T4302) era um recém-diagnosticados grau III astrocitoma anaplásico em um homem de 40 anos que foi removido cirurgicamente na Universidade de Duke. No momento da remoção, o espécime foi caracterizada para ter polissomia EGFR (EGFRvIII negativo), MGMT negativo, PTEN intacto, e polissomia de cromossomos 7 e 10. Para os estudos de mistura de células (ou seja, ensaio de competição), a amostra de tumor utilizadas (T4121) foi um glioblastoma multiforme recorrente (GBM) diagnosticada em um homem de 26 anos que foi removido cirurgicamente na Universidade de Duke. No momento da remoção, o espécime foi caracterizado por ter amplificado EGFR (EGFRvIII, mas negativo), MGMT positivo, perda de PTEN, perda do cromossomo 9p21 e polissomia de cromossomos 1p36, 1p32 e 19q13. Para os estudos experimentais, as células tumorais foram removidas a partir de xenoenxertos e CSCs foram enriquecidos com base na expressão CD133 por citometria de fluxo (usando uma /2-APC anticorpo CD133, Miltenyi) e depois funcionalmente ensaiadas para auto-renovação, a diferenciação de multi-linhagem, caule expressão do marcador de células e propagação do tumor tal como previamente descrito [8]. CSCs putativos de GBM espécime T4302 foram transduzidas com um lentivírus para expressar a proteína fluorescente verde (GFP). Para espécime de tumor T4121, CSCs putativos foram marcadas com proteína fluorescente amarela (YFP) ou células tumorais e não estaminais foram marcadas com uma proteína fluorescente ciano (PCP, T4121 espécime de tumor) por lentivírus (Sigma). CSCs rotulados e células tumorais não-haste (derivados de T4121) foram misturados em um 10%: (CSC: células tumorais não-tronco) 90% [01:09 ou] Relação e transplantadas para o córtex de um rato nu a uma profundidade de 1,5 – 2 mm. cranianos janelas foram instalados como previamente descrito [9]. Estudos de imagem utilizada 25.000 células transplantadas. Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados no âmbito de um protocolo de Cleveland Clinic IACUC aprovado.

imaging Multiphoton

microscopia intravital foi realizada utilizando imagens multiphoton como descrito anteriormente [10], utilizando um sistema de imagem SP5 Leica com um femto 16W a laser -Segundo sintonizado 840-860 nm e focado através de um 20X lente de imersão em água (abertura numérica de 1,0). Antes da imagiologia, os ratinhos foram anestesiados e injectados intravenosamente com elevado peso molecular de dextrano fluorescente ( 150 kD) para realçar a vasculatura. As imagens foram adquiridas ao longo de um intervalo de 200 mm em 2 m z-stacks. projeções intensidade máxima, representando 200 mm de profundidade, foram uniformemente ajustada no Photoshop (Adobe) antes de exibir. Para reconstruções tridimensionais, os dados foram importados para o software Imaris (bitplane) para processamento de superfície e volume foi quantificado para cada população de células.

imunocoloração e análise estatística

As secções congeladas foram cortadas usando um criostato (Leica) e imunocoloração foi realizada como previamente descrito [11] com anticorpos contra Tra1-85 (R D Systems, 1:500), SOx 2 (R D Systems, 1:200), Histona H3 fosforilada (PH3, Millipore , 1:500), e CD31 (Dako, 1:200). Os núcleos foram contra-coradas com DRAQ5 (Biostatus limitado, 1:5000). As imagens foram adquiridas utilizando um microscópio confocal Leica SP5 como previamente descrito [11]. Análise de todo o tumor foi feito por 3 profundidades anatômicas em 3 ratos representativos, totalizando 400.000 células. A imunofenotipagem das populações de células transplantadas foi confirmada por citometria de fluxo utilizando a expressão CD133 (CD133 anticorpo /2-APC, Miltenyi) de cada população de células conforme anteriormente descrito [8]. A imunocoloração de cada população de células in vitro foi realizada utilizando os anticorpos descritos acima e quantificada com base num mínimo de 150 células a partir de 10 campos. A significância estatística foi calculada utilizando-se ANOVA.

imagem Automated análise

Grande campo de visão (FOV) imagens de tumor secções transversais foram adquiridas usando uma Leica DM4000, uma objetiva de 40X , um CCD Q-Imaging, um 8-slide palco motorizado Antes, imagem-Pro 6.2, e YFP, PCP, Cy5 (DRAQ5 núcleos marcados) e Texas Red (Sox2, TRA-1-85, ou PH3) cubos de filtro. imagens FOV grandes (-500 MB /canal) foram importados para Imagem-Pro para a análise usando macros personalizadas. Para cada secção transversal, o canal de DRAQ5 foi importada e espectralmente reforçada para equalizar a aparência de cada núcleo. Os núcleos foram então segmentado, morfologicamente “dilatado” para estender suas fronteiras para o citoplasma, e “divisor de águas” filtrada para a separação celular. A região de interesse (ROI) foi desenhada em torno do tumor granel e PCP, YFP, e Texas Red canais foram carregados em sucessão. Cada canal foi filtrada espectralmente e “multiplicado” pela máscara de células descrito supra. Segmentação via morfométricas e intensidade de perfis específicos para cada marcador /mancha seguido por operações lógicas imagem fornecidos YFP, PCP e contagem de células positivas para o anticorpo. Para a imunofenotipagem da população transplantada, a máscara binária nuclear resultante foi “multiplicado” com o canal correspondente PH3 /Sox2. A positividade foi automaticamente atribuído com base na intensidade nuclear médio de PH3 ou Sox2 acima de um limite pré-definido.

Resultados

gliomas malignos são sólidos cancros para os quais hierarquias celulares foram reproducibly definidos, permitindo o interrogatório de células que podem ser prospectivamente enriquecido para características CSC, incluindo auto-renovação, potencial de diferenciação, caule expressão do marcador celular, e na propagação do tumor in vivo. Para abordar diferencial no potencial de propagação do tumor in vivo, utilizou-se modelos em que já havia demonstrado a capacidade para enriquecer ou para esgotar características CSC em ensaios ex vivo utilizando marcação fluorescente marcador da superfície celular [8], [11] funcionalmente. Embora haja controvérsia em torno CD133 como um marcador CSC, muitas propostas de glioma marcadores CSC (incluindo L1CAM [12], A2B5 [13], e integrina alfa 6 [11]) sobreposição com CD133. Descobrimos que CD133 enriquece para os CSCs nas amostras de GBM utilizados para o estudo e segrega para tumorsphere eficiência de formação, em comparação com a integrina alfa 6 (dados não apresentados). Além disso, as fracções CD133 propagar eficientemente tumores secundários e enriquecimento de CD133 CSCs desses tumores foi recentemente usada para validar uma quinase específica CSC-tirosina não receptora e óxido nítrico sintase isoforma [14], [15]. CD133 expressão foi avaliada após marcação por citometria de fluxo com 11% de células YFP (CSC derivado) e 1% de células da PCP (não estaminais derivadas) sendo CD133 positivo (dados não mostrados). O procedimento de etiquetagem viral não alteram as propriedades de crescimento (dados não apresentados).

In vivo

observação do crescimento das células de haste do cancro em um tumor

Até à data, o crescimento de CSCs de tumores sólidos não foi avaliada em resolução única célula ao longo de um curso de tempo temporais in vivo. Para observar o potencial para a propagação do tumor por CSCs sozinho, utilizou-se microscopia intravital, em um modelo de rato xenotransplante ortotópico para identificar e rastrear o crescimento de um número pequeno de CSCs em um tumor ao longo do tempo (Fig. 1A). Logo no início do período de observação, quando quantidades limitadas de CSCs estavam presentes (T4302, dias 3 a 13), CSCs foram associados com os vasos sanguíneos no nicho perivascular (Fig. 1B, C), como descrito por Gilbertson e colegas de trabalho [16] e cresceu em proximidade com os vasos sanguíneos (Fig. 1D, E). Ao longo do tempo (do dia 13 a 20), um nódulo tumoral rapidamente formado e células de tumor foram observados a infiltrar-se as regiões periféricas (setas azuis), uma característica histológica comum dos gliomas malignos. Os resultados fornecem a primeira curso de tempo temporal, o crescimento do tumor de CSCs por imagens ao vivo e confirmam o potencial tumorigénico dos CSCs transplantados.

formação de tumores em um modelo de xenotransplante foi observada a partir CSCs marcado com GFP ao longo do tempo, como mostrado na experimental desenho esquemático (A). micrografias de projeção (BD) demonstram a formação do tumor ao longo do tempo e reconstruções tridimensionais representadas nas micrografias (E, E ‘) revelou células tumorais estavam intimamente associados com os vasos sanguíneos (E’, mostrado com setas brancas em D, E) e em áreas periféricas (D, E, mostrado na setas azuis). dextrano fluorescente (mostrado em vermelho) foi injectada na circulação para iluminar os vasos sanguíneos antes da imagiologia. barra de escala representa 50 um.

células-tronco cancerosas superar as células tumorais não estaminais

in vivo

Numerosos estudos têm demonstrado capacidade de formação de tumores diferencial entre CSCs e não células tumorais -stem [8], [15], [17], [18], no entanto uma comparação head-to-head entre as duas populações em alta resolução ou em um tempo de forma dependente não foi executada. Esta avaliação é crítica como um glioma maligno é composta de várias populações de células, não há conversa cruzada entre as populações, e a forma como as populações de células interagem é susceptível de ser informada no que diz respeito aos processos tumorigénicas. Para avaliar o comportamento das CSCs e células tumorais não estaminais num microambiente idêntica, que transplantado marcado diferencialmente CSCs humanos e células tumorais não estaminais derivadas do mesmo tumor parental na mesma rato destinatário e monitorizados no comportamento in vivo ao longo do tempo utilizando microscopia intravital (Fig. 2A). avaliação sequencial in vivo do mesmo hospedeiro tendo uma mistura inicial de CSC (10%, YFP marcado) e células tumorais não-tronco (90%, PCP marcado) demonstraram que os CSCs ultrapassou não estaminais células tumorais, com um aumento de volume de 51,9 dobra para os CSCs e um aumento de 0,92 vezes para as células tumorais não estaminais (Fig. 2B) e misturaram crescimento foi limitado entre as populações (Fig. 2C e D). A utilização de várias populações de células do mesmo tumor, estes resultados de imagem fornecem a primeira evidência para a capacidade de formação de tumores diferencial entre CSCs e células tumorais não estaminais in vivo utilizando imagiologia sequencial alta resolução.

CSCs fracionados e não-tronco tumorais As células foram marcadas com diferentes proteínas fluorescentes e transplantadas em ratinhos a uma célula-tronco câncer 10% (YFP) a relação de 90% de células tumorais não-haste (PCP), como mostrado no desenho experimental esquemática (a). CSCs não ultrapassou os CSCs in vivo, como mostrado no gráfico de resumo (B), que foi calculada com base em reconstruções tridimensionais das micrografias de projecção (B, C). Além disso, as populações tumorais não se misturam in vivo (população tumor não-tronco indicado pelo oval amarelo). dextrano fluorescente (mostrado na púrpura) foi injectada na circulação para iluminar os vasos sanguíneos antes da imagiologia. barra de escala representa 100 m.

tumores resultantes células-tronco cancerosas contido e seus descendentes

Os tumores secundários formados por CSCs transplantados conter várias populações de células, estudos no entanto anteriores foram amplamente focada na histologia de tumores secundários ou expressão de marcadores tumorais, mas houve pouca informação no que diz respeito ao grau de heterogeneidade, bem como a contribuição de vários tipos de células para o desenvolvimento de heterogeneidade. Depois de os ratos desenvolveram sinais neurológicos (variando de 37 a 42 dias após o transplante), utilizou-se o exame histológico para confirmar o fenótipo das células transplantadas nos tumores resultantes. Para delinear as fronteiras dos tumores, os tecidos foram corados para um antigénio específico humano, Tra-1-85. Descobrimos que enquanto ambos YFP positivo (CSC derivada) e CFP positivo (não-tronco derivadas) eram detectáveis, a esmagadora maioria das células tumorais foram derivados de CSCs; 94,5 por cento de TRA-1-85 células positivas dentro do tumor foram YFP positivo (CSC derivado) versus 0,2 por cento, que foram PCP positivo (derivado não-haste, a Fig. 3A, B).

tumores a partir de células experiências de mistura (n = 3) foram avaliados para determinar a sua composição. avaliação subsequente dos tumores resultantes demonstra que a maioria das células no interior da massa do tumor era de origem humana e derivados de CSC, como confirmado por coloração Tra-1-85 e expressão YFP, mostrado em micrografias representativas (A) e gráfico de barras (B) . células tumorais transplantadas periféricos (CSCs positivos YFP e seus descendentes) foram observados para ter uma associação com os vasos sanguíneos. Micrografia da imagem multiphoton e reconstrução tridimensional (C) mostram estreita associação de células tumorais (verde) com vaso sanguíneo adjacente (roxo, iluminado por injecção dextrano fluorescente na circulação antes da imagem). O exame histológico dos tumores resultantes confirma estreita associação de células tumorais periféricas à vasculatura usando CD31 imunocoloração (D; CD31 em vermelho, as células tumorais em verde, núcleos em roxo). A barra de escala representa 50 um. Dados apresentados como valores médios +/- E.P.M. ***, P 0,001, avaliada pela análise de uma via de variância (ANOVA)

Associação entre vasos sanguíneos e células-tronco do câncer e seus descendentes

A capacidade de tumor. células a crescer ao longo dos vasos sanguíneos é um fenótipo que é frequentemente identificado em espécimes cirúrgicos de glioma humano. Para avaliar se este fenótipo foi recapitulado em tumores resultantes da co-transplantação de CSCs e células tumorais não estaminais combinados, avaliou-se a vasculatura tumoral utilizando microscopia multifotônica e exame histológico de tumores resultantes (Fig. 3C e D). No dia 38 (mostrado na Fig. 2B), fomos capazes de identificar um grupo de células tumorais na periferia do tumor e análise tridimensional demonstrado que os CSCs e seus descendentes (células YFP) estavam em estreita proximidade com a vasculatura (Fig. 3C). O exame histológico do resultante do tumor utilizando um anticorpo contra CD31 para marcar vasos sanguíneos também confirmou que CCC e seus descendentes (células YFP +) eram de facto perto da vasculatura em regiões separadas da massa tumoral em massa, um fenómeno também observado em pacientes GBM (Fig. 3D).

células-tronco cancerosas se propagam heterogeneidade

in vivo

Para determinar se as células tumorais transplantadas células-tronco semelhantes contidos, avaliamos a expressão do marcador CSC, sox2 [19], e descobriram que 25,9 por cento das CSCs transplantados e seus descendentes (células YFP) foram sox2 positiva em comparação com 0,1 por cento de células tumorais não estaminais e seus descendentes (células da PCP, Fig. 4A, B). Também se avaliou a proliferação usando o marcador de fase M fosforilado-histona H3 (PH3) e descobriu que 1,7 por cento das CSCs e seus descendentes (células YFP) foram activamente na fase M, em comparação com menos do que 0,01 por cento de células tumorais não estaminais e seus descendentes (células PCP, Fig. 4C, D). Essas diferenças na proliferação visto em nossos relatórios clínicos de apoio modelo que sugerem CSCs proliferação (com base no status CD133-positive) caracterizar uma classe agressiva de tumores GBM [20].

O exame histológico foi realizado a partir de tumores resultantes na célula experiências de mistura (n = 3) para determinar a fracção de células estaminais do tipo tal como avaliado por expressão Sox2 e a presença de células em proliferação conforme confirmado pela M-fase marcador histona fosforilada 3 (PH3). micrografias representativas (A) e gráfico de barras (B) demonstram expressão Sox2 (vermelho) está associada com células-tronco cancerosas e seus descendentes (verde), mas não com as células tumorais não estaminais e seus descendentes (azul). micrografias representativas (C) e gráfico de barras (D) demonstrar a expressão PH3 (vermelho) está associada com células-tronco cancerosas e seus descendentes (verde), mas não com as células tumorais não estaminais e seus descendentes (azul). A barra de escala representa 50 um. Dados apresentados como valores médios +/- E.P.M. ***, P . 0.001, avaliada pela análise de uma via de variância (ANOVA), núcleos contra-coradas com DRAQ5 (roxo)

Para ganhar uma apreciação para o grau de heterogeneidade estabelecido pelo transplantado CSCs (YFP células positivas), avaliou-se o fenótipo das células antes do transplante. As culturas CSC continha 74,8 por cento de células positivas Sox2 (isto é, in vitro), em comparação com 24,9 por cento de células positivas YFP Sox2 (CSC derivado) no interior do tumor (i.e., in vivo, a Fig. 5A-C). Estes resultados sugerem que o ambiente in vivo fornece sinais instrutivos para recriar um equilíbrio de estado de diferenciação e heterogeneidade celular assim. Uma redução similar foi observada em células tumorais Sox2 não estaminais (células positivas PCP) a partir de uma população inicial de 7,1 por cento em cultura a 0,1 por cento no tumor (Fig. 5A-C). As diferenças de crescimento também foram observadas entre as populações em cultura, em comparação com o dentro do tumor. Usando o PH3 marcador fase M como substituto de proliferação, observou-se 2,1 por cento células positivas YFP (CSC derivado) e 0,2 por cento PCP células positivas (não estaminais derivadas) em cultura, em comparação com as células positivas de 1,7 por cento YFP e menos do que 0,01 por cento PCP em células positivas para os tumores (Fig 5A-C). Estes resultados demonstram que, embora as células tumorais não estaminais predominou nos pontos de tempo iniciais, devido às proporções no momento do transplante, os tumores de crescimento tinha um número limitado de células derivadas de células tumorais não-tronco, dos quais alguns expressavam marcadores de células estaminais ou estavam activamente proliferando. Os tumores resultantes eram constituídos por CSCs e seus descendentes, de uma fracção que continha ainda haste expressão do marcador de células e foram activamente em proliferação.

micrografias representativas (A) e gráfico de barras (B) de células expandidas antes do transplante demonstram sox2 e expressão PH3 (vermelho) é maior na fracção de CSC de células, em comparação com as células tumorais não estaminais. Resumo figura ilustra a expressão do marcador de in vivo e in vitro análises (C). A barra de escala representa 50 um. Dados apresentados como valores médios +/- E.P.M. ***, P 0,001 e N.S. representa não significativa (p 0,05). avaliada pela análise de uma via de variância (ANOVA), núcleos contra-coradas com Hoechst 33342 (azul)

Discussão

O microambiente do tumor é um regulador crítico da formação de tumores e de manutenção com as suas contribuições em resposta terapêutica e fracasso. No entanto, muitos estudos CSC e tumor cerebral não adequadamente modelada do microambiente. Muitas vezes, CSC e células tumorais não-tronco são cultivadas em condições diferentes, que incluem diferentes meios e CSCs cultivadas como esferas e células tumorais não-tronco cultivadas aderente. Como estas condições activar diferentes vias de sinalização celular, alguns resultados CSC pode ser devido a artefactos de cultura em vez de diferenças intrínsecas celulares. Muitos estudos são realizados com as populações em isolamento, que não permitem a sinalização entre as células que é fundamental para o crescimento celular ou a avaliação da contribuição de cada tipo de célula para a formação do tumor in vivo. Além disso, as interações nicho com componentes como a vasculatura ou estroma não pode ser completamente avaliada a menos que estudos são realizados in vivo. Para modelar melhor o microambiente do tumor, nós marcado diferencialmente CSCs e células tumorais não estaminais e introduziu as células na mesma condições in vivo. Nossa avaliação de crescimento proporciona a primeira evidência directa para a propagação do tumor por um tumor sólido CSC subpopulação in vivo utilizando imagens ao vivo e mostra que uma pequena fracção de células de tumor pode propagar um tumor heterogénea. Nossos estudos oferecem vantagens substanciais sobre ex vivo ou estudos populacionais combinados devido à nossa capacidade de modelo mais adequado ao ambiente in vivo e avaliar o comportamento de populações múltiplas em tempo real usando microscopia de alta resolução.

Há muitos aspectos da modelos de xenotransplante que oferecem vantagens potenciais, no entanto ainda existem limitações. Conceitualmente, estes ensaios de transplante de oferecer uma melhor no ambiente vivo às custas de uma apreciação de processos tumorigênicos em tempo real, que só podem ser inferidas após a formação do tumor. No entanto, esta abordagem caixa negra pode ser tratada com o uso de imagens ao vivo, tal como descrito no presente relatório. Usando imagens ao vivo, os meandros do modelo de xenotransplante pode ser elucidada e as previsões informativas podem ser feitas para o desenvolvimento do tumor, manutenção e resposta à terapia. O uso cuidadoso de modelos de xenotransplante permitirá uma maior compreensão da interação entre CSCs e células tumorais não estaminais, bem como a comunicação celular com vasos sanguíneos, um nicho CSC em vários tumores cerebrais [16]. Além disso, estas abordagens podem esclarecer o fenômeno recentemente identificada de diferenciação GBM CSC em células vasculares e esclarecer o papel deste plasticidade em processos tumorigênicos [21], [22], [23], [24]. De nota, não foi observada a integração de células marcadas para a parede vascular (dados não mostrados). Essas interações vasculares têm profundas implicações terapêuticas, especialmente no contexto da angiogênese, onde muitas terapias estão sob investigação. Além disso, uma maior apreciação da interacção entre o microambiente do tumor e as células transplantadas podem ajudar a explicar o atraso no crescimento do tumor em modelos de transplante. Este é destacado por nossas observações apresentadas na Figura 1, onde o crescimento CSC entre o dia 35 e dia 38 é bastante notável, mas congruente com a dinâmica de crescimento do tumor dentro de um modelo de transplante [25], [26]. Estas diferenças são susceptíveis de ser um reflexo de um processo em várias fases que inclui a sobrevivência de células de tumor, a adaptação ao ambiente hospedeiro, seguido de crescimento exponencial, que pode ser extrapolada para compreender a recorrência em pacientes.

Os nossos dados também demonstram que esta abordagem pode ser usada para definir melhor heterogeneidade celular do cancro, que será crítico para tanto o conhecimento básico de tumorigénese e um modelo para testar terapias mais apropriadamente pré-clínicos promissores. Nos nossos estudos, os tumores resultantes que se formaram continha uma população heterogénea, tal como avaliado por expressão Sox2, apesar de a representação substancial de células YFP (CSC derivado). Este tipo de rastreio in vivo linhagem tem sido limitado em estudos de GBM e os nossos resultados confirmam que os CSCs expressando um marcador de células estaminais podem gerar células que não expressam o marcador de células estaminais, o que demonstra a transição entre estados de células estaminais in vivo. Estudos pré-clínicos dependem do tamanho do tumor como uma estimativa da eficácia. A nossa demonstração de que uma pequena fracção de células cancerosas propaga um tumor in vivo, representa uma abordagem complementar para avaliar a eficácia de um determinado tratamento por rastreio linhagem. Tomado em um contexto clínico, uma terapia que mata a maioria das células e deixa para trás uma pequena população de células (refractários susceptíveis de ser enriquecida em CSCs) aparece eficaz se o tamanho do tumor é o resultado de medição. No entanto, as células restantes, alguns dos quais são CSCs, são passíveis de contribuir para a recorrência do tumor, como muitas vezes observados em pacientes após terapias eficazes na redução do tamanho do tumor [27]. Assim, avaliar linhagens celulares em um tumor após a terapia em combinação com a avaliação do tamanho do tumor e análise histológica é susceptível de proporcionar uma visão mais precisa do impacto do tratamento. A capacidade de avaliar o comportamento das células tumorais se em um modelo clínico relevante é valioso. Nossos dados (este relatório e [11], [28]) e os de outros grupos [16] indicam que as células tumorais têm uma relação íntima com a vasculatura; No entanto, a FDA aprovou o factor de crescimento endotelial vascular de células (VEGF) neutralização do anticorpo bevacizumab (Avastin) tem tido um sucesso misto clinicamente, apesar do sucesso em modelos pré-clínicos [29]. Resistência a terapias anti-VEGF é postulado para ocorrer através de evasão ou indiferença e envolvem angiogénese modulada, vasculogénese, normalização vascular [30], [31]. No entanto, o modo dominante de resistência é ainda a ser determinado e nossa abordagem usando várias populações de células tumorais e alta resolução em microscopia vivo é susceptível de proporcionar uma visão crítica. Para maior impacto, estes métodos podem ser combinados com a utilização de sistemas repórter fluorescentes para avaliar a actividade de transcrição em tempo real e em correlação com a resposta terapêutica. Outra área em que estas abordagens de imagem será útil é a avaliação de inibidores de hedgehog Sonic (Shh). Não é claro se o modo de acção é directamente sobre as células tumorais, o estroma tumoral, ou ambos, e a elucidação do mecanismo de acção é uma prioridade imediata como vários inibidores de Shh estão actualmente sob investigação para uma variedade de tumores incluindo GBM [32] , [33].