Abstract

Resveratrol (trans-3,4,5 -trihydroxystilbene ‘) é um composto ativo em alimentos , tais como uvas vermelhas, amendoins, e bagas. Resveratrol exibe um efeito anti-cancro em várias células cancerosas humanas. No entanto, o mecanismo de efeito anti-cancro induzido pelo resveratrol, a nível molecular continua por ser elucidado. Neste estudo, o mecanismo subjacente ao efeito anti-cancro do resveratrol em células de cancro do ovário humano (OVCAR-3 e Caov-3) foi investigado utilizando várias técnicas de biologia molecular, tais como citometria de fluxo, Western blotting, e interferência de RNA, com um foco principal sobre o papel potencial de autofagia na morte celular por apoptose induzida pelo resveratrol. Nós demonstramos que a geração de resveratrol induzida espécies reactivas de oxigénio (ROS), o que desencadeia a autofagia e subsequente morte celular por apoptose. Resveratrol induzida expressão Atg5 e clivagem LC3 promovido. A morte celular por apoptose induzida pelo resveratrol foi atenuada pela inibição tanto farmacológica e genética de autofagia. A cloroquina inibidor autofagia, que funciona na fase tardia de autofagia, reduziu significativamente a morte celular induzida pelo resveratrol e a actividade da caspase 3 em células de cancro do ovário humano. Também demonstramos que a segmentação Atg5 por siRNA também suprimiu a morte celular por apoptose induzida por resveratrol. Assim, concluímos que uma via comum entre autofagia e apoptose existe na morte celular induzida por resveratrol em células de cancro do ovário humanos OVCAR-3

Citation:. Lang F, Qin Z, Li F, Zhang H, Fang Z , Hao E (2015) apoptose morte celular induzida por Resveratrol é parcialmente mediada pela autofagia via em células do cancro do ovário humano. PLoS ONE 10 (6): e0129196. doi: 10.1371 /journal.pone.0129196

Editor do Academic: Dominique Delmas, UMR INSERM U866, França |

Recebido: 31 de outubro de 2014; Aceito: 07 de maio de 2015; Publicação: 11 de junho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Lang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Dados Disponibilidade: Todos os dados são fornecida no manuscrito

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo fundo de pesquisa de promoção de jovens e de meia-idade, os cientistas da província de Shandong (Grant No. 21/07). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de ovário é uma das principais causas principais de morte relacionada ao câncer para as mulheres e uma alta taxa de recorrência após a cirurgia [1] [2]. Na maioria dos casos, o diagnóstico é feito em estágios tardios do câncer, e torna-se um desafio para ressecção e recuperação cirúrgica [2]. Assim, os estudos sobre os ingredientes ativos de produtos alimentares pode fornecer abordagens terapêuticas alternativas úteis para esta malignidade.

Resveratrol é um ingrediente ativo de nossas fontes de alimentos, como uvas, amendoins, e bagas, que tem sido muito utilizado na medicina tradicional chinesa. Numerosos estudos demonstraram os efeitos benéficos de resveratrol em doenças cardiovasculares, doenças neurais, obesidade e desordens inflamatórias [3-5]. Uma das principais áreas de investigação resveratrol está na vanguarda da pesquisa do câncer [6, 7]. É bem conhecido que uma dose elevada de resultados de resveratrol na morte celular apoptótica de células de cancro do ovário [8-10]. Vários mecanismos de morte celular do cancro do ovário têm sido propostos. Fosforilação de Cdc2-tyr15 por um resultado de tratamento com resveratrol na parada do ciclo celular de OVCAR-3 [9]. A sub-regulação de Akt /GSK e vias de sinalização de ERK foi mostrado para ser crítico para a morte celular mediada pelo resveratrol [10]. Recentemente, Lin et ai. descrito o papel importante de ceramida e COX-2 na morte celular por apoptose por resveratrol em OVCAR-3 [8].

Autophagy é uma via de auto-degradação conservadora em que os componentes citosólicos são sequestradas para os lisossomas para a degradação e a reciclagem [11]. Em tecidos saudáveis, este é um processo de purificação das organelas danificadas. No entanto, é um processo complexo em células cancerosas, onde ele pode suprimir ou induzir o crescimento de células cancerosas de acordo com o microambiente celular [12].

No presente estudo, foram investigados o papel potencial de autofagia em resveratrol induzida morte celular por apoptose em células cancerosas OVCAR-3. Descobrimos que o tratamento com resveratrol induzida geração de ROS e apoptose, bem como activação da via autofagia em células OVCAR-3. A inibição da autofagia por um inibidor farmacológico ou um ARNsi contra Atg5 morte celular por apoptose mediada pelo resveratrol significativamente atenuada. Assim, o nosso estudo estabeleceu um importante papel da autofagia na apoptose induzida pelo resveratrol em células de cancro do ovário humanos.

Materiais e Métodos

Reagentes

Resveratrol, NAC (N cisteína acetil ), a cloroquina, a caspase 3 kit de ensaio e anticorpo LC3 foram adquiridos a partir de Sigma (EUA). O resveratrol foi dissolvido em DMSO (Sigma, EUA) e foi preparada de fresco antes de cada vez para a célula de tratamento. anticorpo anti-Atg5 foi comprado de Pequim Biossíntese Biotecnologia, Atg5-ATG12 Antibody Complexo era de AbD Serotec, e o anticorpo anti-caspase 3 foi encomendado a partir de tecnologias de sinal celular. ARNsi contra Atg5 foram obtidos a partir de Xangai GenePharma Co. Ltd. Z-VAD-FMK foi adquirido a R D

cultura celular

OVCAR-3 e Caov-3 linhas de células de cancro do ovário humano. foram obtidas a partir de ATCC (EUA). As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Life Technology, EUA) suplementado com 10% de soro fetal de bovino, insulina, e penicilina-estreptomicina. A linha celular foi cultivada num CO

2 incubadora a 37 ° C. Humanos ovarianos células epiteliais da superfície células (HOSEpiC) foram cultivadas com epitelial de ovário Médio celular fornecida fabricante (ScienCell Research Laboratories). o tratamento com resveratrol foram descritos no texto e figuras.

ensaios de viabilidade celular

A viabilidade das células foi realizada utilizando ensaios MTT de acordo com as recomendações do fabricante. Resumidamente, as células foram plaqueadas em placas de 96 poços e cultivadas durante a noite. As células foram tratadas com resveratrol, ou outros compostos, tal como indicado, durante 48 h. As células foram lavadas com meio e o MTT foi adicionado 6 horas antes do ponto de extremidade, e a absorvância a 490 nm foi medida utilizando um leitor de microplacas.

Ensaio de Apoptose utilizando citometria de fluxo

A morte celular apoptótica foram medido por coloração com Sytox verde e anexina V-APC (Life Technology, EUA) como previamente descrito [13].

celular ROS ensaia

total intracelular ROS foram medidos por citometria de fluxo utilizando o H2DCFDA tingir de acordo com a recomendação do fabricante (Life Technology, EUA).

Determinação de elétrons mitocondrial potencial mudança

potencial de membrana mitocondrial foi avaliada utilizando um ensaio de células vivas com o corante catiônico lipofílico fluorescente TMRE (Sigma )). Este corante é um corante permeante célula que facilmente se acumula na mitocôndria ativa devido à sua carga negativa relativa. Após tratamento OVCAR-3 células foram coradas com 500 nM TMRE durante 30 min a 37 ° C, depois lavadas duas vezes em meio e ressuspensas em PBS. As células foram analisadas num citómetro de fluxo no canal FL2 e a intensidade média é representada graficamente. potencial itochondrial também analisadas por outro corante JC-1. Após tratamento como descrito no texto, as imagens fluorescentes foram imediatamente usando um âmbito invertido Zeiss AX10 (Carl Zeiss MicroImaging Inc., Alemanha).

Determinação de aductos de proteína 4HNE

O 4- nível de HNE em lisados ​​celulares foi medida utilizando o OxiSelect HNE Aduto ELISA Kit (Cell Biolabs) de acordo com as instruções do fabricante. Western blot também foi realizada utilizando um anticorpo anti-HNE (Abcam).

Western blotting analisa

células foram lavadas com PBS frio e lisadas com tampão RIPA (Sigma, EUA), contendo um inibidor de protease cocktail (Roche, Alemanha). As concentrações de proteína foram determinadas usando um reagente de ensaio de proteína (Bio Rad, EUA), e quantidades iguais de proteína (50 ug) foram carregados em cada poço de 4-20% ou 12% SDS-PAGE. Depois de as proteínas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose, as membranas foram bloqueadas com leite a 5%, seguido por incubação com o anticorpo primário diluído adequado durante a noite. Depois de três lavagens com tampão de TBS-T, as membranas foram incubadas com anticorpos secundários conjugados com HRP apropriadamente diluído durante 2 h. Os imunotransfer�cias foram desenvolvidos usando o kit SuperSignal Oeste Femto (Fisher Scientific, EUA).

RNA Interferência

células OVCAR foram transfectadas com qualquer inespecífica ou Atg5 siRNA usando lipofectamina (Life Technologies, EUA) de acordo as instruções do fabricante. As células foram incubadas 48 horas antes do tratamento com resveratrol para o bloqueio máximo de expressão Atg5.

caspase 3 actividade

3 caspase actividade foi medida utilizando o kit de ensaio de caspase 3 (Sigma, EUA) de acordo com a as instruções do fabricante. As concentrações de proteína foram determinadas usando o método previamente descrito e quantidades iguais de proteína foram carregadas numa placa de 96 cavidades para o ensaio da caspase 3.

actividade de PARP

actividade de PARP, utilizou-se o HT kit de ensaio universal colorimétrico PARP de Trevigen. actividade da PARP é determinada pela quantidade de PAR depositada sobre proteínas histona imobilizadas. O procedimento foi realizado de acordo com as recomendações do fabricante.

imagens de células vivas com indicador de autofagia tingir

autofágica fluxo também foi determinada utilizando Cyto-ID Autophagy Kit de Detecção (Enzo Life Sciences) de acordo com a instruções do fabricante.

imagens de células vivas com substrato de caspase fluroscent

ativação caspase foi determinada utilizando CellEvent caspase-3/7 Green Detection Reagent (Life Technologies, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

analisa

estatística

Todos os dados foram expressos como a média com o erro padrão da média. As experiências foram repetidas quatro vezes em duplicado em todas as experiências. teste t de Student ou ANOVA de uma via foi realizada como apropriado, para determinar a significância estatística. A significância foi estabelecido em p . 0,05

Resultados

Resveratrol induzida morte celular por apoptose de células de cancro do ovário humanos de uma forma

dose-dependente

OVCAR-3 é um quimio a linha de células de cancro resistente à estabelecida de um paciente com adenocarcinoma do ovário. Utilizamos células OVCAR-3 como um

in vitro

modelo de célula cancerosa para testar os efeitos anticancerígenos de resveratrol. Como mostrado na Fig 1A, o tratamento com resveratrol a 1 uM a 100 uM durante 48 horas resultou em uma perda dependente da dose da viabilidade das células, conforme determinado utilizando ensaios MTT. O tratamento com 30? M e 100? M resveratrol mostrou uma perda estatisticamente significativa da viabilidade celular em 48 h.

A. células OVCAR3 foram tratados com 1 a 100 uM de resveratrol durante 48 h. A viabilidade celular foi determinada utilizando ensaios MTT. Os dados foram obtidos a partir de uma média de quatro experiências independentes. * P 0,05 comparado com o controlo do veículo, n = 4 /grupo. B. representativas fluxo de citometria de gráficos de pontos para a medição de apoptose em células OVCAR-3. A apoptose induzida por resveratrol foi medida por coloração com corante verde Sytox (eixo Y, FL1) e anexina V-APC (X-eixo, FL4). C. Determinação quantitativa de morte celular por apoptose precoce como o número de células de anexina V-positivo com células verdes-negativas Sytox, e morte celular por apoptose tardia /necrótica como o número de células de anexina V-positiva e Sytox verde-positivos.

os efeitos do resveratrol sobre a morte celular por apoptose de células OVCAR-3 foram examinadas por citometria de fluxo utilizando Sytox verde (FL1H) e anexina V- aloficocianina (FL4H). O tratamento com 100 uM de resveratrol durante 48 h significativa induzida por apoptose /morte celular por necrose precoce e tardia por apoptose (Fig 1B e 1C). O tratamento com 30 uM de resveratrol durante 48 h significativa também induziram /morte celular apoptótica precoce e tardia de apoptose necrótica (Fig 2A e 2B), mas o efeito foi menos em comparação com 100 uM.

. Western blotting de análises representativas OVCAR-3 lisados ​​celulares totais com anticorpos Atg5, LC3, e p62. β-actina e GAPDH foram utilizados como controlos de carga. Três amostras replicadas foram carregados para cada grupo de tratamento. B. activação caspase 3 foi medido a partir de lisados ​​de células e expressa como a alteração dobra. * P . 0,05 em comparação com o controle do veículo, n = 4 /grupo

Resveratrol autofagia induzida em células de cancro do ovário humanos

Também avaliamos o efeito de resveratrol na autofagia. marcadores chave da autofagia foram avaliados. Como mostrado na Fig 2C e Fig 3A, o resveratrol ainduced LC3-II e p62 em células OVCAR-3. As análises de transferência de Western revelou um aumento na Atg5 marcador específico autophagic, que é essencial para a formação autophagosome (Figuras 2A e 3A). Além disso, a actividade de caspase 3 foi significativamente aumentado nas células tratadas com resveratrol OVCAR-3 (Figuras 2D e 3B).

. células OVCAR-3 foram tratadas com 30? M de resveratrol durante 48 h, e a morte celular foi determinada por citometria de fluxo. B. resultado quantitativo da citometria de fluxo. C. Representante western blot análise de OVCAR-3 lisados ​​celulares totais com Atg5, LC3, e anticorpos p62 com β-actina como um controlo de carga.

Resveratrol estresse oxidativo induzido em OVCAR-3 câncer de ovário humano células

em seguida, examinamos se o tratamento com resveratrol tiveram quaisquer efeitos sobre os níveis de estresse oxidativo nas células cancerosas. Na primeira abordagem, utilizou-se uma célula de permeante-2 ‘, 7’-diacetato dichlorodihydrofluorescein (H2DCFDA) corante para medir intracelular ROS, e descobriram que o resveratrol a 30 uM resultou na produção de ROS em significantincrease intracelular em células OVCAR3 (Fig 4A). Para confirmar ainda mais este resultado, foi também utilizado um método complementar para medir a pegada oxidativo medindo adutos proteína HNE (4-hydroxynonenal). Consistente com os dados de ROS intracelular, aductos de proteína HNE foram significativamente aumentados em comparação com células OVCAR tratados com veículo (Figura 4B e 4C). Além disso, mostramos que o resveratrol também diminuiu significativamente o potencial de elétrons mitocondrial (Fig 4D).

A

. ROS intracelular de OVCAR-3 foram medidos por citometria de fluxo utilizando H

2DCFDA e expressa como a alteração dobra. O resveratrol a 30 uM induzida estatisticamente significativa ROS. * P 0,05 comparado com o controlo do veículo, n = 4 /grupo.

B

. proteínas modificadas marcador de stress oxidativo 4HNE foram determinados utilizando ELISA a partir dos lisados ​​celulares de veículo e tratados com resveratrol (30 uM) de células OVCAR-3. As proteínas modificadas quantificados foram expressos como a% de amostras de controlo do veículo. * P 0,05 comparado com o controlo do veículo, n = 4 /grupo. C. Representante transferência de Western mostrando resveratrol elevação induzida de adutos HNE. D. mitocondrial de elétrons potencial mudança de tratamento após resveratrol foi determinada pelo fluxo quantitativa citometria e imunofluorescência.

Resveratrol induzida semelhante apoptose e autofagia em células de câncer de ovário humanos Caov-3

Para determinar se o efeito resveratrol é a linha de célula específica, utilizamos outra linha de células de cancro do ovário humano Caov-3. Coerente com o efeito observado em células OVCAR-3, o resveratrol também induziu apoptose e autofagia em Caov-3 células (Fig 5). No entanto, o resveratrol nas mesmas doses e de tempo de estrutura não induziu apoptose precoce em células epiteliais do ovário humanos primários superfície HOSEpiC embora não é aumentar ligeiramente em /morte celular apoptótica necrótico tarde (Fig S1).

. células Caov-3 foram tratadas com 30? M de resveratrol durante 72 h, e a morte celular foi determinada por citometria de fluxo. B. resultado quantitativo da citometria de fluxo. C. análises representativas western blotting de Caov-3 lisados ​​celulares totais com anticorpos LC3, e p62.

A inibição farmacológica da autofagia morte celular induzida pelo resveratrol atenuados em células OVCAR-3

para testar se a autofagia é uma ligação para a morte celular por apoptose, que trataram células OVCAR-3 com cloroquina (CQ), um inibidor de autofagia farmacológica, antes do tratamento com resveratrol. A apoptose e morte celular foram determinados utilizando Sytox verde e AnnexinV-aloficocianina. Como mostrado na Fig 6A, a morte celular pelo resveratrol a 30 uM foi significativamente atenuada por pré-tratamento com 2 uM de CQ. Resveratrol reduziu significativamente a morte celular total por inibição da autofagia. também analisou resveratrol induzida marcadores de apoptose atividade da caspase 3 e atividade de PARP e ambos foram atenuadas por tratamento CQ (Fig 6C). Além disso, observou-se que os marcadores autophagosome induzida pelo resveratrol LC3II e p62 também foram atenuados pelo tratamento CQ (Fig 6D).

A

. fluxo representativas citometria diagramas ponto que representa células cada OVCAR-3. apoptose celular foi medida pelo mesmo método, como na Figura 1. A cloroquina reduziu a morte celular efeito de resveratrol. B. Determinação quantitativa de morte celular total, o que foi expresso como a percentagem de células totais. * P 0,05 comparado com o controle do veículo; # P 0,05 comparado com as amostras tratadas com resveratrol. n = 4 /grupo. C. caspase 3 e actividades de PARP foram ensaiadas e representada graficamente como a mudança de dobragem. D. representativas western blotting análises de OVCAR-3 lisados ​​celulares totais com anticorpos LC3, e p62.

A inibição da autofagia por ATG siARN melhorada morte celular induzida pelo resveratrol em células OVCAR-3

Atg5 é a marca de autofagia e um jogador-chave na formação de autofagossomas. Para além do inibidor farmacológico, foi utilizada uma abordagem genética por expressão derrubar Atg5 usando um siRNA específico e examinou o seu efeito na morte de células de cancro induzido pelo resveratrol. Como se mostra na figura 7, a morte celular pelo resveratrol (30 uM) foi reduzida de 27,9% a 16,22% por Atg5 siARN. Um padrão similar foi também observado em actividade da caspase 3 e LC3 western blot (Fig 7B e 7C). A eficácia da tecnologia siARN foi confirmado usando análises de transferência de Western, o que indicou uma redução significativa dos níveis de proteína Atg5 (Fig 7A). Curiosamente, verificou-se que as células tratadas com siRNA Atg5 em combinação com Z-VAD-FMK (50 uM) são significativamente mais protegidas da morte celular induzida pelo resveratrol em comparação com os tratados com inibidor sozinho (Figura 7E). Nós também empregou uma nova tecnologia imagens de células vivas usando Cyto-ID corante para o fluxo de autofagia e os resultados acima foram confirmados.

A. a expressão da proteína Atg5 foi determinada a partir de lisados ​​celulares obtidos a partir de células OVCAR-3 colocado com ARNsi de controlo aleatório ou Atg5 siARN. B. caspase 3 actividades foram determinadas a partir de lisados ​​celulares obtidos a partir de células OVCAR-3 colocado com ARNsi de controlo aleatório ou Atg5 siARN. As actividades foram expressas como a variação de dobragem. * P 0,05 comparado com o controlo de veículo, # P 0,05 comparado com as amostras tratadas com resveratrol. n = 4 /grupo. C. representativas western blotting análises de OVCAR-3 tratado com veículo (Veh) ou resveratrol aos 30 uM (RV) com e sem siATG5 e os lisados ​​celulares totais foram anlyzedwith imagem célula D. ao vivo LC3 e β-actina de microscópio confocal (com 20X objectivo) usando corante cito-Id carregado por 15 minutos, após o tratamento com resveratrol a 30 uM em células OVCAR-3 transformadas com aleatório ou Atg5 siARN. E. Determinação quantitativa de morte celular em células OVCAR utilizando citometria de fluxo. morte celular induzida pelo resveratrol é atenuada em células siATG5-tratada e siATG5 além de Z-VAD-FMK (50 uM) tratada OVCAR-3. * P 0,05 comparado com o controle do veículo; # P 0,05 comparado com as amostras tratadas com resveratrol. n = 4 /grupo.

Nós usamos imagens de células vivas para o fluxo autofágica e caspase 3 corante substrato (marcador de apoptose precoce) através de microscopia (Fig 8A e 8B). Foi evidente que o fluxo autophagic foi iniciado mais cedo (12 h) do que a apoptose (24 horas) quando tratados com 30M resveratrol, que está de acordo dos dados acima mencionados Atg5 siRNA. Nós também realizado um estudo de campo de tempo com análises de Western blot utilizando-se dois conjuntos de amostras a partir de experiências independentes em cada um dos pontos de tempo (Figura 8C) e descobriram que autofagia foi activado mais cedo do que a apoptose, sugerindo que a autofagia está a montante da apoptose em células de cancro do ovário tratados com resveratrol. No entanto, há sobreposição entre os dois processos, que é um padrão típico de uma população de células cancerígenas.

A. imagens de células vivas por microscopia confocal (com objetiva de 10X) com Cyto-ID corante em OVCAR-3 células tratadas com 30 mM resveratrol em 0, 12, 24 e 48 pontos no tempo hora. imagens de células vivas B. por microscopia confocal (com objetiva de 10X) com caspase 3 corante de detecção verde em células OVCAR-3 a 0, 12, 24 e 48 pontos no tempo hora. C. células OVCAR-3 foram tratadas com 30? M de resveratrol durante 12 h, 24 h e 48 h. Western blotting de lisados ​​de células totais foram realizadas com anti-Atg5-ATG12, LC3, e caspase 3 anticorpos. Não foi observada a clivagem do Atg5. Os resultados apresentados representam uma experiência, na qual cada ponto de tempo de tratamento foi duplicado.

Discussão

Neste estudo, demonstramos que a morte celular induzida pelo resveratrol no cancro do ovário humano células era mediada tanto por apoptose e autofagia. Resveratrol induzida geração de ROS intracelular significativa e estresse oxidativo nas células cancerosas, o que resultou na iniciação da via de morte celular. As características de autofagia, LC3 e Atg5, ambos foram upregulated em células cancerosas tratadas com resveratrol. Também mostramos que a inibição farmacológica de autofagia por cloroquina atenuada morte celular induzida pelo resveratrol em OVCAR-3, e resultados semelhantes foram obtidos por expressão de bloqueio Atg5 utilizando siARN.

Vários estudos recentes têm demonstrado algumas vias intrigantes que medeiam induzida pelo resveratrol morte celular por apoptose. Vergara et ai. descreveu a sinalização ERK papel e vias AKT /GSK na morte celular por apoptose utilizando uma abordagem proteómica [10]. Em outro estudo elegante, Lin et al. demonstrado que a apoptose induzida pelo resveratrol partilhada vias semelhantes com a apoptose de COX-2 dependente induzida por ceramida em células de cancro do ovário [8]. ere, que têm demonstrado que a morte celular por apoptose de OVCAR-3 induzida pelo resveratrol é muito mais complexa e autofagia desempenha um papel crucial neste processo.

Uma das nossas observações principais era a produção de ROS e intracelular oxidativo stress na morte celular induzida pelo resveratrol em células OVCAR-3. ROS está envolvido na modulação de várias vias, incluindo a via de sinalização de ERK [14-16]. Curiosamente, ROS poderia induzir a autofagia em células OVCAR-3 tratadas com resveratrol [17]. O resveratrol é conhecido por ter efeitos antioxidantes benéficos sobre as células saudáveis ​​[18], mas essas actividades antioxidantes têm consequências diferentes em altamente proliferação de células cancerosas. Antioxidantes, incluindo o resveratrol, têm sido mostrados para contribuir para a morte celular induzida por ROS em outros tipos de células de cancro [19, 20]. Nossos dados sugerem que a produção de ROS por resveratrol em OVCAR-3 células está associada a apoptose de células cancerígenas, o que é consistente com os resultados obtidos em estudos anteriores focada em células colorretal e carcinoma de cólon.

Em geral, a autofagia inibe a indução de apoptose e ativação caspase associada à apoptose desliga o processo de autofagia. No entanto, há muitos casos em que ambos os processos ocorrem simultaneamente ou co-activam a produção de ROS induzida tanto autofagia e apoptose em células cancerosas [21]. si Autophagy pode induzir a morte celular, um processo conhecido como morte celular autophagic [22]. Também tem sido relatado que a indução de autofagia facilita a activação da apoptose [23]. Puissant et ai descobriram que tanto autofagia e apoptose estão envolvidos na morte celular induzida pelo resveratrol em uma linha de células de leucemia mielóide [24-26]. Em células cancerosas da mama MCF-7, o resveratrol induzida beclin-1 autofagia dependente e independente [27] .Aqui, também observamos tanto caspase existe via dependente e independente de resveratrol induziu a morte celular em células de câncer de ovário. Ou inibidores de caspases ou autofagia foram incapazes de restaurar resveratrol induziu a morte celular. Uma das principais proteínas envolvidas neste processo é a proteína p53 supressora de tumores e dos seus níveis de proteína na activação modular citosol ou inibição da autofagia [28, 29]. translocação nuclear de p53 também é importante para a indução de apoptose. Tem sido demonstrado que a p53 é crucial para a morte celular mediada pelo resveratrol em células OVCAR-3 [8]. Outros mediadores comuns de ambos autofagia e apoptose várias proteínas BH3-only (BCL-3 homologia 3). Durante a apoptose, BH3-somente proteínas interagem directamente com a família Bcl-2, silenciando deste modo a função anti-apoptótica e estimular a apoptose. Vários BH3-somente proteínas, tais como BAD e BNIP3 também pode promover a autofagia por inibição competitiva entre Beclin1 e proteínas apoptóticos BCL-2 [30-32]. Curiosamente, ambos BCL2 e Bad foram mostrados para ser desreguladas em células OVCAR-3 [8].

O envolvimento de p62 em resveratrol induziu a morte celular em linha celular de leucemia é fundamental [25]. Também observamos indução de p62 em células de cancro do ovário em resposta ao tratamento com resveratrol.

Em nosso estudo, descobrimos que a inibição da autofagia atenua (mas não completamente abole) a morte de células de câncer de ovário induzida pelo resveratrol. Nós também realizado um estudo de curso de tempo, e descobriram que o resveratrol ativa autofagia mais cedo do que a apoptose, sugerindo que a autofagia está a montante da apoptose. Juntos, estes dados confirmam que o resveratrol induz a apoptose parcialmente através autofagia. Concordamos que alguns mecanismos mais clássicos são provavelmente também envolvido em resveratrol apoptose induzida.

A autofagia é um mecanismo de sobrevivência crucial para as células cancerosas sob condições estritas para satisfazer as suas necessidades nutricionais. inibição concomitante de autofagia durante a terapia anti-câncer é benéfica no câncer urológico [33]. Neste estudo, foi utilizado o inibidor da cloroquina autofagia fase tardia e verificou que autofagia medeia a morte celular OVCAR-3 induzida pelo resveratrol, que foi confirmado por transfecção de um ARNsi contra Atg5. Os nossos dados sugerem que não seria benéfico para o tratamento de cancro do ovário com um inibidor autofagia em adição ao resveratrol. Combinação de resveratrol, com um gatilho autofagia possivelmente aumentar o efeito anti-cancro. Este seria um importante tema de estudo ainda mais interessante e importante. Importante, estudos anteriores em carcinoma de células escamosas do esôfago demonstrado o efeito oposto por inibição da autofagia na morte celular induzida pelo resveratrol [34]. Isso pode ser parcialmente devido às diferentes doses e tipos de células cancerosas utilizados neste estudo, e autofagia é um processo complexo que funciona como uma espada de dois gumes, quando aproveitada como uma maneira de lutar contra o câncer [35-39].

Informações de Apoio

S1 Fig. O resveratrol não induz a apoptose em células epiteliais da superfície do ovário saudáveis.

Análises de citometria de fluxo da superfície do ovário humano Células Células Epiteliais (HOSEpiC), que foram cultivadas com meio de células epitelial do ovário desde o fabricante (ScienCell Research Laboratories). o tratamento com resveratrol foi realizada a 100 uM durante 48 horas. As células foram então coradas com AnnexinV e Sytox verde para apoptose precoce e apoptose tardia /marcadores de morte celular por necrose, respectivamente. A determinação quantitativa de citometria de fluxo de dados não demonstrou nenhuma diferença significativa em marcadores de morte celular apoptic cedo, mas pouco aumento significativo na apoptose tardia /marcadores de morte celular por necrose. * P 0,05 comparado com o controle do veículo; n = 3 /grupo

doi:. 10.1371 /journal.pone.0129196.s001

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