Abstract

As epotilonas são uma nova classe de microtúbulos agentes com atividade pré-clínica e clínica promissora estabilização. O seu alvo celular é β-tubulina e factores que influenciam a sensibilidade intrínseca a epotilonas não são bem compreendidos. Neste estudo, o significado funcional de isotipos específicos de p-tubulina de sensibilidade intrínseca a epotilona B foi investigada utilizando ARNsi contra o silenciamento de genes βII-, βIII- ou βIVb-tubulinas em duas linhas celulares independentes do cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC), NCI-H460 e Calu-6. ensaios clonog�icas tratados com a droga mostraram que a sensibilidade à epotilona B não foi alterada seguinte knockdown de βII-tubulina em linhas celulares de NSCLC. Em contraste, knockdown de βIII-tubulina aumentou significativamente a sensibilidade a epotilona B. Interessantemente, knockdowns βIVb-tubulina foram significativamente menos sensível a epotilona B, em comparação com células de controlo mock- e siRNA. análise do ciclo celular de células knockdown βIII-tubulina mostrou uma maior percentagem de morte celular com concentrações de epotilona B tão baixas como 0,5 nM. Em contraste, as células knockdown βIVb-tubulina apresentado uma diminuição na induzida por epotilona B G

2-H acumulação do ciclo celular em comparação com células de controlo de ARNip. Importante, knockdowns βIII-tubulina apresentaram um aumento dependente da dose significativo na percentagem de células apoptóticas por meio de tratamento com epotilona B, como detectado usando a caspase 3/7 actividade e coloração com anexina-V. Concentrações mais elevadas de epotilona B foram necessárias para induzir a apoptose nas knockdowns βIVb-tubulina em comparação com ARNsi de controlo, evidenciando um mecanismo potencial subjacente a diminuição da sensibilidade a este agente. Este estudo demonstra que isotipos específicos beta-tubulina pode influenciar a sensibilidade à epotilona B e pode influenciar a sensibilidade diferencial a este novo agente promissor

Citation:. Gan PP, McCarroll JA, Byrne FL, Garner J, Kavallaris M (2011 ) beta-tubulina Isotipos específico pode Funcionalmente aumentar ou diminuir epotilona B Sensibilidade em Non-Small Cell Lung Cancer Cells. PLoS ONE 6 (6): e21717. doi: 10.1371 /journal.pone.0021717

editor: Paraskevi Giannakakou, Weill Cornell Medical College, da Universidade Cornell, Estados Unidos da América

Recebido: 13 de outubro de 2010; Aceito: 09 de junho de 2011; Publicado: 29 Junho 2011 |

Direitos de autor: © 2011 Gan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Cancer Infantil Institute Austrália para a investigação médica, que é afiliado com a Universidade de Nova Gales do Sul e do Hospital Sydney infantil e subsídios do Cancer Council de Nova Gales do Sul (MK). Endeavour Internacional de Bolsas de Pós-Graduação Pesquisa (PPG), da Universidade de New South Wales Faculdade de Medicina Fellowship (JAM), da Universidade de New South Wales Faculdade de Medicina Prêmio Early Career Research (JAM), Balnaves Award (JAM), Anthony Award Rothe de Pós-Graduação (JLB ), e por um NHMRC Senior Fellowship (MK). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. MK, PPG e JAM, pedido de patente 20100159030 métodos para detectar e modulando a sensibilidade do células tumorais para agentes anti-mitose e para modular tumorigenicidade 2010/06/24. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Os taxanos (incluindo paclitaxel e docetaxel) são drogas amplamente utilizadas no tratamento de várias estabelecida tipos de tumores sólidos, incluindo os do ovário, da mama, do pulmão e cancro da cabeça e pescoço, quer isoladamente ou em combinação com outros agentes quimioterapêuticos. O sucesso clínico de taxanos forneceu o ímpeto para procurar outros novos agentes com propriedades semelhantes, mas com maior eficácia. As epotilonas são uma nova classe de agentes de estabilização de microtúbulos não taxanos que têm mostrado actividade anticancro promissora. Entre eles, o análogo de epotilona B, ixabepilona (BMS-247550, aza-EpoB) foi aprovado em 2007 pela Food and Drug Administration para o tratamento de câncer de mama metastático ou localmente avançado resistentes a antraciclinas, taxanos e capecitabina, individualmente ou em combinação com esses agentes [1]. O que ocorre naturalmente epotilona B (patupilone, EPO906), também demonstrou actividade promissora em vários modelos pré-clínicos que são resistentes à quimioterapia baseada em taxano e está actualmente em fase II /III de ensaios clínicos [2], [3], [4], [5]. Apesar pouca semelhança estrutural entre as epotilonas e os taxanos, ambos os agentes de partilhar o mesmo ou um local de ligação de sobreposição em β-tubulina [6], [7]. Semelhante a taxanos, epotilonas induzir microtúbulos agregação [6], suprimir a dinâmica dos microtúbulos; conduzindo à inibição da proliferação de células e bloquear mitose [8]. Embora epotilonas e taxanos estabilizar microtúbulos contra a despolimerização, exibem diferenças distintas na actividade e eficácia (revisto em [9], [10]).

Ambas as epotilonas e taxanos pode estabilizar microtúbulos contra a despolimerização, ainda exibem diferenças distintas na actividade e eficácia (revisto em [9], [10]). As razões para as diferenças de atividade são mal compreendidos. Até à data, os estudos têm-se centrado na resistência adquirida à epotilonas utilizando populações de drogas selecionadas que apresentam múltiplos mecanismos de resistência, incluindo mudanças na expressão isótipo tubulina e mutações em β-tubulina [11], [12], [13], [14]. Temos anteriormente descrito células resistentes epotilona B analógicos de leucemia que apresentam alterações múltiplas de microtúbulos, incluindo o aumento da expressão de βIII-tubulina, o aumento da expressão de MAP4, e mutações em βI-tubulina [13]. Embora a resistência adquirida para epotilonas foi descrito, a investigação sobre factores intrínsecos que medeiam a sensibilidade epotilonas e relacionados com o alvo celular da droga, tubulina, têm sido escassos. Como estes agentes avançar para a clínica é importante para entender como esta classe de composto interage com diferentes isotipos de tubulina e como os níveis dessas proteínas intrínseca influenciar a eficácia.

Usando a tecnologia de RNAi, já anteriormente demonstrado que βIII-tubulina medeia sensibilidade ao paclitaxel e

Vinca

alcalóides nas células NSCLC [15]. Silenciar a expressão de βII- e isotipos βIVb-tubulina, por outro lado, aumentar a sensibilidade destas células à

vinca alcalóides

mas não paclitaxel [16]. provas correlativas que a regulação positiva de βIII-tubulina não mediar a resistência à epotilona B, também tem sido relatada [12]. No entanto, a sobre-expressão de βIII-tubulina em células HeLa faz com que as células menos sensíveis a epotilona B [17]. Não se sabe se a expressão diferencial de β-tubulina isotipos resposta influência para epotilonas. Compreender essa interacção é altamente desejável para o desenvolvimento de marcadores de previsão para proporcionar uma terapia mais especialmente para pacientes com NSCLC e outros pacientes a ser tratados com epotilonas.

Para investigar o significado funcional destes isotipos p-tubulina em resposta a epotilona B em NSCLC, que empregue tecnologia de ARNi para knockdown especificamente a expressão destes isotipos em duas linhas celulares de NSCLC independentes e caracterizar os efeitos na morfologia das células, a sensibilidade para a epotilona B e a apoptose induzida por drogas.

Materiais e Métodos

cultura de células, transfecção e siRNA droga citotóxica

H460 e Calu-6 as células foram obtidas de ATCC (Manasses, VA, EUA) e mantidas como anteriormente descrito [15]. As linhas celulares são rotineiramente e livre de micoplasma. Todos os procedimentos de transfecção foram realizadas como relatado anteriormente [15]. A potência e especificidade dos siRNAs segmentação cada isotipo β-tubulina foram validados anteriormente [15], [16]. Epotilona B (biociências Calbiochem, Merck) foi preparado numa concentração estoque de 100 mM em DMSO.

Imunofluorescência coloração

Resumidamente, siRNA-transfectadas Calu-6 células que crescem em lâminas de câmara de vidro foram tratados com a epotilona B, nas concentrações indicadas, durante 1 h. coloração por imunofluorescência de células transfectadas com ARNsi foi então realizada como previamente descrito [15], [16].

ensaios clonogénicos tratado com o fármaco

ensaios clonogénicos tratados com a droga foram realizados como previamente descrito [15 ], [16]. Os resultados foram expressos como uma fracção sobrevivente e dose inibidora (ID

50) foi extrapolada a partir da curva de dose-resposta utilizando o programa GraphPad Prism [15], [16].

ciclo celular análise

para análise do teor de ADN por coloração com iodeto de propídio, H460 e células Calu-6 foram semeadas em placas de seis poços contendo 6 × 10

4 células por poço e transfectadas com ARNsi. Após 72 horas da transfecção, as células foram expostas a epotilona B, nas concentrações indicadas, durante 24 h. No dia da análise, as células aderentes e ambos flutuantes foram recolhidas, lavadas com PBS e fixadas com etanol a 80% durante pelo menos 24 horas a 4 ° C. As células fixadas foram então coradas com uma solução contendo /ml de iodeto de propídio 50 ug e 2 ug /ml de RNase isenta de DNase durante 30 min a 37 ° C no escuro. teor de ADN foi medida por um fluxo FACSCalibur citómetro (BD). O programa CellQuest foi usado para quantificar a distribuição de células em cada fase do ciclo celular: Sub-L

1 (mortos ou fragmentado), L

1, S e G

2-H [15], [ ,,,0],16].

ensaios de apoptose

apoptose celular foi determinada por medição da actividade da caspase 3/7 3/7 utilizando o ensaio da caspase-Glo, como descrito anteriormente, com ligeiras modificações [18], [19 ]. Resumidamente, as células foram transfectadas com ARNsi durante 24 h e plaqueadas de novo em placas de 96 poços (5 x 10

3 células /poço) e deixou-se aderir durante um adicional de 24 h. As células foram então tratadas com concentrações variáveis ​​de epotilona durante 24 h. Após o tratamento, as células foram incubadas com a caspase-Glo 3/7 reagente durante 2 h à temperatura ambiente, e a luminescência foi medida com um luminómetro (Perkin Elmer Victor 3). Além disso, a apoptose também foi determinado pelo kit de coloração de anexina V-FITC (Becton Dickinson) como anteriormente descrito [15], [19].

A análise estatística

Os dados são expressos como a média ± SEM e analisados ​​utilizando ANOVA ou

t

teste do aluno seguido pelo Dunnett não paramétrico ou Mann-Whitney utilizando o programa GraphPad Prism. Um valor de p inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

sensibilidade diferencial a epotilona B seguinte βII-, βIII- ou knockdown βIVb-tubulina

A especificidade de cada do β-tubulina siARN foi confirmada ao nível da proteína (Figura S1). Consistente com os nossos estudos anteriores, βII-, βIII-, e siRNA inibiu potentemente a expressão da proteína βIVb-tubulina de cada um destes alvos, respectivamente, sem afectar a expressão de outros isotipos de grandes p-tubulina nas linhas celulares de NSCLC (Figura S1) [15] , [16]. Para investigar os efeitos destes isotipos p-tubulina em resposta a epotilona B em células NSCLC e para quantificar as alterações na sensibilidade ao fármaco, foram realizados ensaios clonogénicos tratados com a droga. Knockdown de expressão βII-tubulina em ambos H460 e células Calu-6 não afectam a sensibilidade à epotilona B (Fig. 1A). Em contraste, knockdown de βIII-tubulina sensibilizados significativamente ambas as linhas celulares de NSCLC a epotilona B (Fig. 1B). Recentemente, nós descrevemos o desenvolvimento e a caracterização de células H460 seleccionadas para expressão estável de shRNA contra βIII-tubulina, e a sensibilidade aumentada destas células para o paclitaxel, cisplatina e carboplatina seu análogo [19]. Importante, o aumento da sensibilidade à epotilona B usando knockdown transitória de βIII-tubulina foi também confirmada utilizando as células estáveis ​​H460 βIII-tubulina shRNA knockdown (Figura S2), fortalecendo ainda mais nossos resultados com este isotipo. Curiosamente, knockdown de βIVb-tubulina reduziu significativamente a sensibilidade para a epotilona B, em ambas as linhas celulares, em comparação com mock- e controlar células transfectadas com ARNsi (Fig. 1C), sugerindo que os tumores que expressam níveis elevados deste isotipo podem ser mais sensíveis à epotilona B do que os tumores com níveis reduzidos deste isotipo.

ensaios clonogénicos foram realizados sobre as reproduções (quadrados a cheio, linha a cheio), ARNsi de controlo (quadrados abertos, linha a cheio) e de células transfectadas com ARNsi de isotipos específicos de p-tubulina (fechado diamantes, linha a tracejado) em duas linhas celulares de NSCLC, H460 (painel da esquerda) e Calu-6 (painel direito). Os gráficos mostram a sobrevivência clonogénica de (A) βII-tubulina; células (B) βIII-tubulina e (C) knockdown βIVb-tubulina expostos a epotilona expressa como fracção sobrevivente. Barras, média ± SEM de pelo menos quatro ensaios individuais. As estatísticas foram calculados comparando a fracção sobrevivente de células de knockdown com as células pseudo-transfectadas em cada concentração de droga. *

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. 0,01

Nós também examinaram os efeitos diferenciais de epotilona B no microtúbulos e morfologia celular em βII -, βIII- e células knockdown βIVb-tubulina. Como mostrado na Figura S3, todas as células transfectadas com ARNsi não tratados não mostrou alterações óbvias para estruturas de microtúbulos, em concordância com os nossos estudos anteriores [15], [16]. No entanto, a epotilona B (5 nM) teve um efeito marcado sobre as células com βIII-tubulina microtúbulos empobrecido. feixes de microtúbulos foram mais proeminentes nas células knockdown βIII-tubulina. Em contraste, as redes de microtúbulos permaneceu em grande parte organizado e intacto em ARNsi de controlo, βII- e células knockdown βIVb-tubulina tratada com a mesma concentração. Aos 20 nM epotilona B, tanto células knockdown βII-tubulina o controle e começar a exibir feixes de microtúbulos comparados com os knockdowns βIVb-tubulina. Estas conclusões complementam os dados clonogênica e sugerem que as células responderam de forma diferente a epotilona B após knockdown específica de cada isotipo indivíduo β-tubulina.

Knockdown de βIII-tubulina reduz epotilona B induzida paragem do ciclo celular e aumenta a morte celular

análise do ciclo celular foi realizada em seguida para determinar se cada um knockdown da p-tubulina perfis do ciclo celular influências isotipo, na presença de epotilona B, durante 24 h. Quando tratados com concentrações tão baixas como 0,5 nM epotilona B, as células knockdown βIII-tubulina mostraram um aumento significativo na sub-L

1 conteúdo, indicativas de morte celular (Fig. 2). Uma maior diferença foi observada com 20 nM de epotilona B, com o controlo siRNA- e células tratadas com siRNA βII-tubulina que mostram uma marcada L

bloco 2-H enquanto que as células de knockdown βIII-tubulina apresentado um aumento na sub-L

1 população (Fig. 2). células knockdown βIII-tubulina tinham menos células que se acumulam no G2-M em relação aos controles, sugerindo que a morte celular pode estar ocorrendo independente da paragem da mitose. É evidente que o knockdown de βIII-tubulina aumenta fortemente a sensibilidade à epotilona B através do aumento da morte celular, porque a

uma população sub-G foi aumentado em todas as concentrações testadas. Em células knockdown βIVb-tubulina, por outro lado, foi observado um menor teor de G

2-M em comparação com as células tratadas com ARNsi de controlo a 20 nM epotilona B (Fig. 2). O

1 Conteúdo sub-G não diferiu entre knockdown βIVb-tubulina e os de controle de células tratadas com siRNA em 20 nm. Em contraste, knockdown de βIVb-tubulina, apresentaram um número inferior de células bloqueadas em G

2-M, confirmando assim a diminuição da sensibilidade destas células à epotilona B.

As concentrações de droga foram indicadas no topo da figura. As células foram colhidas após 24 horas de tratamento com fármacos e subsequentemente ensaiadas para o seu conteúdo de ADN por citometria de fluxo como descrito em Materiais e Métodos. valores representativos de quatro experiências independentes são apresentados. *

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Para determinar se induzida por B epotilona G

2-M do ciclo celular atraso estava a ocorrer em pontos de tempo anteriores, análise do ciclo celular utilizando H460 e células Calu-6 foi realizada a 4, 8 e 12 h na presença ou ausência de epotilona B (20 nM). Na presença da droga, L

2-H paragem do ciclo celular foi observado tão cedo quanto 4 h para H460 células (Tabela S1) e 8 h de células Calu-6 (Tabela S2) em ambos knockdown βIII-tubulina e siRNA controlo células transfectadas. Aos 8 e 12 h, a percentagem de células H460 bloqueados em G

2-M foi menor do que o controlo (Tabela S1), embora não uma tendência similar foi observada nas células Calu-6 (Tabela S2).

sensibilidade a epotilona B correlaciona-se com o nível de indução de apoptose

para abordar se o aumento ou diminuição da sensibilidade à epotilona B específicos para cada isotipo β-tubulina foi relacionado com a indução de apoptose, medimos a actividade de caspase 3/7 nestas células após 24 horas de tratamento da droga. Caspase 3/7 actividade nas células knockdown βIII-tubulina foi aumentada pelo menos duas vezes ao longo que nas células transfectadas com ARNsi de controlo em todas as concentrações testadas (Fig. 3). O aumento da actividade da caspase em células knockdown βIII-tubulina correlacionados com o aumento da morte celular observado nestas células por meio de tratamento de droga. Em contraste, a caspase 3/7 actividade manteve-se em níveis de fundo em células de knockdown e βII- βIVb-tubulina, semelhante à das células de controlo de ARNip em ≤1 nM epotilona B. Mais importante, não houve uma diminuição significativa na actividade de caspase nas células βIVb knockdown em ≥2 nM, sugerindo que as knockdowns βIVb-tubulina foram menos sensíveis à apoptose induzida pela epotilona.

H460 células foram colhidas após 24 horas de incubação na presença ou ausência de epotilona B e subsequentemente ensaiadas para a apoptose transfectadas com ARNsi indução por ensaio da actividade da caspase. bares abertos: células transfectadas com siRNA controle; cinza claro barras sólidas: células knockdown βII-tubulina; barras pretas sólidas: células knockdown βIII-tubulina; cinza escuro barras sólidas: células knockdown βIVb-tubulina. Os dados representam médias ± SEM de, pelo menos, três experiências independentes. *

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Para definir melhor o papel dos isotipos beta-tubulina na epotilona apoptose induzida por B, anexina V-FITC coloração também foi realizada seguindo 48 h tratamento com epotilona B. Como se mostra na Fig. 4a, o tratamento de células βIII-tubulina knockdown H460 apoptose induzida a partir de uma concentração tão baixa como 320 pM de epotilona B. A percentagem de células apoptóticas foi significativamente superior nas células tratadas com siRNA βIII-tubulina do que no controle, βII- ou βIVb- células tubulina siRNA-tratada em todas as concentrações testadas (Fig. 4a). Em contraste, foi necessária uma concentração mais elevada de epotilona B para induzir a apoptose em células de knockdown βIVb-tubulina em comparação com a utilização de células transfectadas com ARNsi βII-tubulina (Fig. 4B) ou controlo. Tomados em conjunto, estes dados mostram que o aumento da indução de apoptose pode ser um dos mecanismos subjacentes à hipersensibilidade a epotilona B seguinte knockdown βIII-tubulina. Knockdown de βIVb-tubulina, por outro lado, uma diminuição da sensibilidade à indução da apoptose induzida pela epotilona B em NSCLC

As barras abertas: as células de controlo transfectadas com ARNsi;. cinza claro barras sólidas: células knockdown βII-tubulina; barras pretas sólidas: células knockdown βIII-tubulina; cinza escuro barras sólidas: células knockdown βIVb-tubulina. Nota epotilona B foi capaz de induzir a apoptose nas células knockodown βIII-tubulina em concentrações tão baixas quanto 12:32 (A), enquanto que as concentrações mais elevadas de epotilona B induzir significativamente inferior a apoptose nas células knockdown βIVb-tubulina (B). Os dados representam médias ± SEM de, pelo menos, três experiências independentes. *

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Discussão

As epotilonas representam uma nova classe de agentes de estabilização de microtúbulos que potencialmente poderiam fornecer uma outra abordagem para superar a resistência paclitaxel. Epotilonas mostraram atividade clínica promissora em um estudo de fase II em pacientes com NSCLC [20] e foram recentemente aprovado para uso no cancro da mama metastático. Não se sabe como este tipo de composto interage com diferentes isotipos de tubulina e como estes influência epotilona B sensibilidade. Aqui dentro, nós mostramos que isotipos específicos beta-tubulina afetar diferencialmente a sensibilidade das células NSCLC para epotilonas (Tabela 1).

Apesar de expressão alterada de isotipos beta-tubulina foi associado extensamente com resistência taxano, informações limitadas está disponível sobre o papel de isotipos de p-tubulina de sensibilidade para epotilonas. Neste estudo, βII-tubulina não afectou a sensibilidade a epotilona B em qualquer uma das duas linhas independentes de células NSCLC H460 e examinados, Calu-6 células. Curiosamente, a sensibilidade para o agente de estabilização de microtúbulos paclitaxel parece não ser influenciada pela sobre-expressão ou supressão da expressão βII-tubulina [16], [21]. Este resultado contrasta com o nosso estudo anterior examinando

vinca

alcalóides, onde a supressão de βII-tubulina aumenta a sensibilidade a esses agentes [16].

pré-clínicos e estudos clínicos têm demonstrado que a resistência aos medicamentos para as parteiras tradicionais é frequentemente associada com a regulação positiva βIII-tubulina (revisto em [10], [22]). Tem havido especulação e provas correlativas que os efeitos citotóxicos de epotilonas são independentes de expressão βIII-tubulina por causa de sua atividade no βIII-tubulina células com superexpressão

in vitro

e em modelos de xenotransplante humanos [9], [12] . No entanto, não foi mostrado evidência definitiva de que a actividade de epotilona é verdadeiramente independente de expressão βIII-tubulina. Usando a tecnologia de ARNi, mostra-se que knockdown de βIII-tubulina leva a um aumento significativo na sensibilidade à epotilona B. Em acordo, a sobre-expressão estável de βIII-tubulina em células HeLa foi encontrado para conferir resistência a uma gama de TBA incluindo epotilona B [17 ]. Um relatório descreveu linhas celulares de cancro do ovário epotilona resistente com expressão βIII-tubulina diminuiu [12]. A resistência às drogas é modelos da linha celular multifatoriais e diferentes poderiam explicar as diferenças. Importante, as outras variações de isotipos de p-tubulina e mutações pontuais βI-tubulina foi também observada em linhas de células B resistente a epotilona [12], o que sugere que estes factores pode também ter contribuído para o fenótipo resistente. Temos células leucémicas resistentes epotilona B analógicos que exibiam múltiplas alterações de microtúbulos, incluindo o aumento da expressão de expressão βIII-tubulina e mutações βI-tubulina [13], descritos anteriormente. Até à data, as contribuições dos mecanismos de resistência B epotilona adquiridos não foram bem correlacionados com a sensibilidade intrínseca à epotilonas. Deve salientar-se que as duas células NSCLC independentes utilizadas no presente estudo também não foram submetidas a selecção de drogas antes nem expressam P-glicoproteína (dados não mostrados) e, portanto, proporcionar uma oportunidade para avaliar a sensibilidade à epotilona B conferida por cada um dos β isotipos de tubulina examinados.

Curiosamente, enquanto que derrubar βIII-tubulina hypersensitizes as células a epotilona B, knockdown de βIVb-tubulina diminuiu a sensibilidade das células NSCLC a epotilona B. recentemente, Cabral e co-trabalhadores têm relataram que as células que sobre-expressam βIVb-tubulina exibiu um pequeno mas significativo aumento na sensibilidade à epotilona a [23]. Tomados em conjunto com o nosso estudo, a expressão βIVb-tubulina pode ser um indicador terapêutico favorável para a terapia de epotilona B. Nós mostramos anteriormente que knockdown de βII- e βIVb-tubulinas nas células NSCLC usadas neste estudo não afectou significativamente a sensibilidade de paclitaxel, mas fez aumentar de forma significativa a sensibilidade da vinca alcalóides [16]. Assim, apesar de paclitaxel e epotilona B partilha sobreposição locais de ligação na β-tubulina, os níveis de expressão βIVb-tubulina provocar efeitos distintos sobre a sensibilidade ao paclitaxel e epotilona B. Existe evidência crescente que mostra que a ligação de epotilonas e o paclitaxel para tubulina pode não ser idêntica [13], [24]. Evidentemente, algumas mutações pontuais na paclitaxel subunidade confere β-tubulina mas não resistência epotilona em modelos de cultura celular [7], [25], o que sugere que as epotilonas e taxanos podem ter distintas interacções com isotipos p-tubulina. A racionalização para as diferenças na sensibilidade induzidas pela expressão de isotipo β-tubulina pode estar relacionada com a amino ácido diferenças entre os isotipos. isotipos beta-tubulina βI, βII, βIVa e βIVb, partilham pelo menos 95% de identidade e tem um número limitado de substituições não conservativas de aminoácidos (Figura S4) [26]. Em contraste, βIII-tubulina difere uma vez que partilha apenas 92% de identidade com os isotipos β-tubulina acima. Dentro do bolso de paclitaxel /ligação epotilona, ​​em βII e βIVb isotipos, Ser275 tem sido implicado como um mediador da difusão paclitaxel através nanoporos [27] e pode ligação de hidrogênio com Gln279 e Lys216, estabilizando a M-loop (Fig. 5). Por sua vez, isto pode aumentar as ligações de hidrogénio que são observadas entre Arg276 para o carbonilo da lactona e Thr274 para o oxigénio em C5-cetona de epotilona A (e, presumivelmente, a epotilona B). Em βIII-tubulina, existe uma mutação Ser275Ala que pode desestabilizar a M-circuito e assim enfraquecer as ligações de hidrogénio Arg226 e Thr274 com o ligando, contribuindo para a sua reduzida sensibilidade. No entanto, isto não explica a sensibilidade diferencial observada entre βIII-tubulina e βIVb, como as sequências de aminoácidos identificadas como sendo importantes dentro do paclitaxel /epotilona bolsa de ligação, ou o PIB local de ligação não diferem entre estes dois isotipos [24]. O estudo actual não se pode excluir a possibilidade de que a expressão diferencial de isotipos específicos de p-tubulina afecta a ligação de epotilonas a parede do microtúbulo, ou através da estabilização de contactos entre dímeros na formação protofilamentos. No entanto, um estudo recente com epotilona A mostrou que liga igualmente bem tanto para βI- e βIII-tubulina [28]. Um estudo semelhante examinar a ligação de epotilona B e isotipos específicos beta-tubulina seria importante para determinar como estes isotipos afetam a interação da droga com a tubulina.

A epotilona B é mostrado como varas (carbonos cinza claro). Os resíduos bolsa de ligação de 1TVK são mostrados como varas (carbonos cinza escuro). hidrogénios não-polares são omitidos para maior clareza. As ligações de hidrogênio são mostrados como linhas verdes tracejadas. Ser275 pode formar 3 ligações de hidrogênio com Gln292 e Lys216. As imagens geradas no DS Modelling 3.0 (Accelrys®).

A actividade antitumoral de epotilonas é mediada pela supressão da dinâmica dos microtúbulos, paragem da mitose no G

2-M fase do ciclo celular seguido de apoptose. Para lidar com os potenciais mecanismos subjacentes à resposta diferencial à epotilona B seguinte knockdown de um isotipo β-tubulina específica, examinámos a propensão das células sofrem uma paragem do ciclo celular induzida por droga e apoptose. Após a incubação com a epotilona B, knockdown βIII-tubulina mostrou um aumento na sub-L

1 (morte celular), enquanto que um decréscimo no bloco L

2-H, quando comparado com as células transfectadas com ARNsi de controlo. Knockdown de βIII-tubulina pode reduzir significativamente a extensão de bloco mitose induzida por incubação com paclitaxel ou vincristina [15], enquanto que o aumento do nível de morte celular. O efeito sobre a sensibilidade de epotilona B não pode ser simplesmente explicada por uma alteração na dinâmica dos microtúbulos, como se demonstrou recentemente que a dinâmica dos microtúbulos não se alteram em células H460 seguinte knockdown βIII-tubulina [29]. Colectivamente, estes estudos demonstram que o knockdown de βIII-tubulina pode aumentar a morte celular por apoptose induzida por TBA através de uma via separada que é independente de paragem da mitose. Um outro estudo mostrou que os efeitos anti-tumorais de paclitaxel, em correlação com a apoptose induzida por paclitaxel, mas não com a paragem da mitose [30]. Epotilonas pode ter um mecanismo de acção semelhante. Interessantemente, as células knockdown βIVb-tubulina teve uma diminuição no número de células bloqueadas em G

2-M (epotilona B 20 nM), em comparação com células de controlo e de knockdown βII-tubulina, embora a um nível mais elevado que o βIII- tubulina células Queda. No entanto, ao contrário das células de knockdown βIII-tubulina, células knockdown βIVb-tubulina sofrem morte celular induzida por droga a um nível semelhante ao do knockdown células βII-tubulina e controlo. Além disso, tanto a actividade da caspase 3/7 e coloração de anexina V mostrou que as células de knockdown βIII-tubulina tiveram um aumento significativo na indução da apoptose induzida pela epotilona B em todas as concentrações testadas. Em contraste, knockdown de células protegidas βIVb-tubulina contra a epotilona B, tal como reflectido na indução de apoptose diminuiu. Assim, a indução da apoptose pode servir como um dos mecanismos subjacentes ao aumento ou diminuição da sensibilidade observada com estes isotipos específicos de p-tubulina em resposta a epotilona B.

A ligação molecular entre β-tubulina e a epotilona B-apoptose induzida ainda não foi estabelecida. Foi demonstrado recentemente que a epotilona B apoptose induzida em células de neuroblastoma humano ao aumentar a geração de espécies reactivas de oxigénio de mitocôndrias e subsequentemente relocalização da proteína Bim pró-apoptótica no compartimento de mitocôndrias [31]. Investigações futuras irá determinar se a geração e mitocôndrias ou expressão de diferentes proteínas pro- e anti-apoptóticas ROS são responsáveis ​​pela capacidade de βIII-tubulina ou βIVb-tubulina de afectar diferencialmente sinais apoptóticos induzidos epotilona-B, e se estes sinais ocorrem independente de paragem da mitose .

a importância do diferencial de β-tubulina isotipos em sensibilidade à epotilona B exige uma validação adicional no contexto clínico para avaliar a sua aplicabilidade em predizer a eficácia da epotilona B. também será de grande interesse para determinar se a expressão de βIVb-tubulina irão correlacionar com a resposta clínica em cancros tratados com epotilona, ​​como com base nos resultados deste estudo, os tumores com altos níveis de βIVb-tubulina seria esperado para ser mais sensível a este agente.

Tomados em conjunto , estes resultados mostram que a composição do isotipo β-tubulina de uma célula afecta a sensibilidade para estudos epotilona B. clínicos são necessários para avaliar o valor terapêutico da expressão diferencial de isotipos de p-tubulina em NSCLC e o seu papel na resposta clínica para epotilonas.

Informações de Apoio

Figura S1.

siRNA segmentação βII, βIII ou βIVb-tubulina silencia especificamente sua expressão em H460 e Calu-6 células NSCLC. As transferências de Western representativa mostrando siRNA alvejando βII (A), βIII (B), ou βIVb-tubulina (C) inibe a expressão de proteínas em H460 e Calu-6 células NSCLC, quando comparado com células tratadas com ARNsi de controlo ou Mock (lipofectamina 2000 apenas) . Não foram observadas alterações significativas na expressão de outros isotipos β-tubulina. O gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (

GAPDH

) expressão foi usado como um controlo de carga. géis representativas.