Abstract

NKX2-1

, que codifica um fator de transcrição homeobox, é amplificado em aproximadamente 15% dos cancros do pulmão de não pequenas (NSCLC), onde se pensa que a conduzir a proliferação de células de cancro e de sobrevivência. No entanto, seu mecanismo de ação permanece em grande parte desconhecido. Para identificar alvos de transcrição a jusante, aqui foi realizado um combinado NKX2-1 transcriptoma (knockdown NKX2-1 seguido de RNA-Seq) e cistrome análise (sites por ChIPseq ligação NKX2-1) em quatro

NKX2-1 viajantes – linhas de células NSCLC humanas amplificadas. Enquanto NKX2-1 genes regulados diferiu entre as quatro linhas celulares ensaiadas, a proliferação celular emergiu como um tema comum. Por outro lado, em 3 das 4 linhas celulares, o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) foi entre o topo NKX2-1 upregulated alvos, que confirmou ao nível da proteína por western blot. Curiosamente, EGFR knockdown levou a regulação positiva de NKX2-1, sugerindo um ciclo de feedback negativo. Consistente com este achado, knockdown combinada de NKX2-1 e de EGFR em células de cancro do pulmão NCI-H1819 reduziu a proliferação celular (bem como MAP-quinase e de sinalização de PI3-cinase) mais de knockdown de quer sozinhos. Da mesma forma, NKX2-1 knockdown aumentou o efeito inibidor do crescimento do EGFR erlotinib-inibidor. Tomados em conjunto, os nossos resultados implicam EGFR como um efetor a jusante da NKX2-1 em

NKX2-1

amplificado NSCLC, com possíveis implicações clínicas, e fornecer um conjunto de dados rico para investigar mediadores adicionais de NKX2-1 oncogênese conduzido.

Citation: Clarke N, Biscocho J, Kwei KA, Davidson JM, Sridhar S, Gong X, et al. (2015) Integrative Genomics implica EGFR como um mediador Downstream no

NKX2-1

celular Amplified Non-Small câncer pulmonar. PLoS ONE 10 (11): e0142061. doi: 10.1371 /journal.pone.0142061

editor: Jen-Tsan Ashley Chi, da Universidade de Duke, Estados Unidos

Recebido: 26 Janeiro, 2015; Aceito: 16 de outubro de 2015; Publicação: 10 de novembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Clarke et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: O conjunto de dados completo de RNA-Seq cru e ChIPseq lê está disponível no NCBI Sequence Leia Archive (Adesão SRP045118)

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiada por uma bolsa da-Related Tobacco Research Program Doenças (21XT-0054). NC foi apoiado por bolsas de estudo do Millennium Gates Foundation e do Programa de Biologia do Câncer de Stanford, e JMD do Programa de Biologia Formação Stanford Tumor. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de pulmão para o maior número de mortes relacionadas ao câncer nos Estados Unidos [1]. Existem duas classes principais, o cancro do pulmão de células pequenas e cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC), este último representando cerca de 85% dos casos, e incluindo o adenocarcinoma, o carcinoma de células escamosas e carcinoma de células grandes histologias [2]. Entre CPNPC, os motoristas de câncer reconhecidos incluem mutações ativadoras em

EGFR

,

KRAS

,

BRAF Comprar e

ERBB2

(HER2), bem como rearranjos de

ALK

e

ROS1

[3]. Alguns destes, só recentemente identificado, agora são valiosos alvos terapêuticos, ressaltando a importância da definição de novas metas e mecanismos moleculares.

NKX2-1

(também chamado

TITF1

e

TTF-1 |) codifica um fator de transcrição homeobox, e é encontrado amplificado pelo cytoband 14q13 em cerca de 15% dos CPNPC (predominantemente adenocarcinomas) [4, 5]. Compreender os seus mecanismos podem proporcionar uma nova visão sobre a carcinogênese de pulmão, e novas estratégias para terapia. NKX2-1 é expresso no pulmão normal desenvolvimento (bem como da tiróide e cérebro anterior) [6], em que é essencial para a organogénese. No pulmão adulto, expressão NKX2-1 é restrita a células clube (Clara) e pneumócitos tipo II, onde regula a produção de surfactante.

Durante anos, a expressão NKX2-1 tem sido usado por patologistas para deduzir um pulmão origem de carcinomas [7]. Recentemente,

NKX2-1

tem sido associada mais directamente para o cancro do pulmão, em que o locus do gene é amplificado em certos casos, conduz à proliferação celular do cancro pulmonar melhorada e sobrevivência [8-11]. Enquanto seus dois papéis em impulsionar o desenvolvimento do pulmão e diferenciação, por um lado, e cancro do pulmão (muitas vezes visto como desdiferenciação), por outro parecer paradoxal, NKX2-1 se encaixa bem em uma classe emergente de “linhagem de sobrevivência” oncogenes, muitas vezes dominar os reguladores de transcrição da linhagem de células normais que se tornam desregulamentado em cancros derivados de que a linhagem [12]. Outros exemplos incluem receptor de andrógeno (AR) no câncer de próstata, e MITF em melanoma.

Mediadores a jusante candidatos

Estudos recentes identificaram e colaboradores da NKX2-1 oncogênese, incluindo ROR1 [13] e LMO3 [14]. No entanto, os mecanismos pelos quais NKX2-1 contribui para carcinogênese de pulmão permanecem largamente desconhecidos. Na verdade, em alguns contextos (sobretudo no mouse), NKX2-1 parece funcionar mais como um supressor de tumor, inibindo o câncer de pulmão Kras-driven e metástase de câncer de pulmão [15, 16]. Aqui, para descobrir mecanismos oncogênicos no câncer de pulmão humano, foi realizado um transcriptoma combinada (knockdown NKX2-1 seguido de RNA-Seq) e cistrome análise em

NKX2-1

(NKX2-1 locais por Chip-seq obrigatório) amplificados linhas celulares de NSCLC. Entre os nossos resultados, identificamos EGFR como um efetor a jusante da proliferação celular NKX2-1 conduzido. Nossos resultados fornecem uma nova visão sobre os mecanismos de câncer de pulmão NKX2-1 mediada, e um conjunto de dados para a exploração continuou.

Materiais e Métodos

cultura celular

NCI-H1819, NCI-H661, HCC1195 e HCC1833 linhas celulares foram obtidas do Dr. John Minna (University of Texas Southwestern Medical Center) [17-20], onde foram autenticado por análise de repetição em tandem curto. Todas as linhas celulares foram cultivadas a 37 ° C em meio RPMI-1640 com L-glutamato, suplementado com 10% (vol /vol) de soro fetal bovino e 1X Pen /Strep.

Expressão

NKX2-1 isoforma

a de comprimento completo do clone de ADNc NKX2-1 (em pOTB7) foi obtido a partir de Origene. Construções de ADN correspondendo a uma transcrição variante NKX2-1 (NM_001079668.2; codificando 401 aminoácidos) e NKX2-1 variante de transcrito 2 (NM_003317; codificando 371 aminoácidos, na ausência dos aminoácidos N-terminais de 30 isoforma 1) foram PCR- amplificado a partir do plasmídeo molde Origene, verificou-sequência, e, em seguida, sub-clonado nos locais BamHI e Xhol de pcDNA6 (Invitrogen). Os iniciadores de PCR foram: Variante 1-F TCGAGGATCCCATGTGGTCCGGAGGCAG; a variante 2-F TCGAGGATCCCATGTCGATGAGTCCAAAGCAC; variante 1/2-R GATCCTCGAGTCACCAGGTCCGACCG. As construções de expressão foram transfectados para células 293T (American Type Culture Collection) utilizando Lipofectamina 2000 (Life Technologies) seguindo o protocolo do fabricante, e os lisados ​​celulares recolhidos 48 horas mais tarde.

siARN transfecção

para ARNsi transfecção , 25,000-100,000 células por placa de 6 poços ou bem 750,000-1,500,000 células por 10 centímetros placa foram semeadas e transfectadas utilizando Lipofectamine 2000 (Life Technologies) seguindo o protocolo do fabricante. Todos os siRNAs foram piscinas no TARGETplus adquiridos de Dharmacon /GE Healthcare (Tabela A em arquivo S1) e transfectadas com uma concentração siRNA final do 50nM (exceto quando indicado) durante 16 horas.

Western blot

As células foram lisadas em tampão RIPA (Millipore) suplementado com 1 mM de ortovanadato de sódio, 5 mM de NaF, 1 mM de PMSF, e cocktail de inibidor de protease 1X (Roche). Em seguida lisado 40ug foi corrido num gel de poliacrilamida a 4-12% (BioRad) e transferidas para membrana de PVDF (BioRad). Os anticorpos primários utilizados foram NKX2-1 (Santa Cruz Biotechnology, H-190, 1: 200), EGFR (Cell Signaling, D38B1, 1: 1000), a MAPK (ERK1 /2) (Cell Signaling, 137F5, 1: 1000), p-MAPK (ERK1 /2) (Thr202 /Tyr204) (Cell Signaling, D12.14.4E, 1: 1000), AKT (Cell Signaling, C67E7, 1: 1000), p-AKT (Ser473) (Cell Signaling, D9E , 1: 1000), e α-tubulina (Santa Cruz Biotechnology, 1: 1000). Todos os anticorpos secundários foram conjugados a HRP e SuperSignal West Pico Quimioluminescência (Pierce) utilizado para a detecção. As transferências de Western foram quantificadas utilizando o ImageJ. Todos os resultados de Western blot são representativas de várias experiências independentes.

proliferação celular /ensaio de viabilidade

proliferação celular /viabilidade foi quantificada 0, 24, 48, 72 e 96 horas pós-transfecção por ensaio colorimétrico com base na clivagem metabólica do sal de tetrazólio WST-1 em células viáveis, de acordo com o protocolo do fabricante (Roche). Em algumas experiências, erlotinib (Santa Cruz Biotechnology) foi adicionado a concentrações indicadas (ou de controlo de veículo). IC

50 valores foram determinados ajustando um registro não-linear (inibidor) versus curva de resposta usando GraphPad Prism.

RNA-Seq

As linhas celulares foram transfectadas com um pool siRNA NKX2-1-alvo ou um controlo não segmentação piscina (NTC) ARNsi durante 16 horas. proteína total (para verificar NKX2-1 knockdown) e RNA (por Qiagen RNAeasy Mini) foram recolhidas 40 horas após a transfecção. qRT-PCR foi feito em primeiro lugar para verificar a transcrição reduzida para NKX2-1, bem como um gene conhecido regulado NKX2-1, SFTPB [21]. Para Q-RT-PCR, o ADNc foi feita utilizando Superscript II (Life Technologies), e, em seguida, qPCR foi realizado em reagentes TaqMan pelo menos em triplicado usando (Applied Biosystems) em um abs rápido 7500 instrumento. níveis de transcrição relativos foram calculados pelo método ΔCT, e normalizadas para GAPDH. Os iniciadores utilizados são listados na Tabela B em Ficheiro S1. bibliotecas de ADNc de código de barras foram então preparadas a partir de ARN total utilizando o kit RNA-Seq Ilumina TruSeq, e sequenciados (de um único final de 36 pb lê) sobre um instrumento Ilumina HiSeq a uma profundidade de 24-63000000 leituras por amostra (Centro de Stanford para genómica e personalizados medicina) (Tabela C no arquivo S1). Sequência lê foram mapeados para o transcriptoma RefSeq e transcrições quantificado como leituras por quilobases por milhão lê (RPKM) usando DNAnexus. posterior análise limitou-se a expressa adequadamente transcrições, definidos como RPKM ≥1 tanto no NKX2-1 e knockdowns controle. Gene Conjunto de Análise de Enriquecimento foi realizada utilizando o pacote de mesa [22]. O conjunto de dados completa de RNA-Seq cru lê está disponível no NCBI Sequence Leia Archive (Adesão SRP045118).

Q-RT-PCR

Para selecionar genes, os resultados RNA-Seq foram posteriormente validados pela Q-RT -PCR. A transcrição reversa foi realizada utilizando os reagentes Superscript II, conforme o protocolo do fabricante (Life Technologies). qPCR foi realizado em, pelo menos, triplicado, utilizando TaqMan ou reagentes de SYBR Green (Applied Biosystems) em um abs rápido 7600 instrumento. níveis de transcrição relativos foram calculados pelo método ΔCT, e normalizadas para GAPDH. Os iniciadores utilizados estão listados na Tabela B no Arquivo S1.

cromatina imunoprecipitação (CHIP) seq

Cinco milhões de células por imunoprecipitação (IP) ou controlar amostra de entrada foram reticulado em 1% de formaldeído em 25 ° C durante 10 min, lavadas em PBS gelado, lisadas em tampão de lise celular (tubos de 5mM (pH 8), 85 mm de KCl, 1% de Igepal, 1X Roche completa Mini Protease Inhibitor Cocktail) a 4 ° C durante 15 minutos, homogeneizou-se mecanicamente com 25 pancadas de um homogeneizador Dounce, lisadas em tampão de lise nuclear (Tris 50 mM (pH 8), EDTA 10 mM (pH 8), 1% (w /v) de SDS, 1X Roche completa Mini Protease Inhibitor Cocktail) 30 min e sonicado com Bioruptor XL obter 200-600bp fragmentos de cromatina. fragmentos sonicados foram diluídos 10 vezes em tampão IP (20 mM de Tris (pH 8), EDTA 2 mM (pH 8), 2% de Triton X-100, 0,2% desoxicolato de sódio, 200 mM de NaCl) e incubados durante a noite com uma mistura 1: 1 de Proteína A /proteína G grânulos bloqueado (5 mg /mL de BSA, 1X Roche completa Mini cocktail inibidor de protease) e pré-incubou-se com anticorpo anti-NKX2-1 5 ug (Santa Cruz Biotechnology, H-190). Para as experiências de ChIP-PCR, IgG de coelho (Santa Cruz Biotechnology, sc-2027) foi usado como um controlo negativo. As amostras foram lavadas 3x em tampão IP de lavagem (50 mM de Tris (pH 8), NaCl 150 mM, 0,05% de Triton X-100), uma vez em tampão TE, e eluiu-se a partir das pérolas em tampão IP de eluição (SDS a 1%, 100 mM de NaHCO

3) a 65 ° C durante 1 h. As ligações cruzadas foram revertidas por incubação a 65 ° C durante 16 horas em tampão de eluição modificada (1% de SDS, 100 mM de NaHCO

3, 200 mM de NaCl). DNA ChIP’ed foi purificado utilizando um Qiagen PCR limpar kit. Para validar primeira especificidade de anticorpo Chip, qPCR foi realizada com sondas TaqMan personalizado projetado para um sítio de ligação NKX2-1 conhecido (

SFTPB

promotor) [21], em comparação com um controle negativo (um gene irrelevante,

genes WNT5A

), e normalizada para GAPDH. Os iniciadores utilizados são listados na Tabela B em Ficheiro S1. Chip e de ADN de entrada de bibliotecas de código de barras, em seguida, foram preparadas utilizando o kit de Ilumina TruSeq ChIPseq, e, em seguida, sequenciados (de um único final de 36 pb lê) sobre um instrumento Ilumina HiSeq a uma profundidade de 18-60000000 leituras por amostra (Centro de Stanford e para Genomics personalizado Medicina) (Tabela C no arquivo S1). Sequência leituras foram mapeados para o genoma humano (NCBI36, hg18) e picos de ligação significativos chamado usando DNAnexus. picos de ligação foram anotados ao gene mais próximo (dentro de 100kb) usando um script Perl personalizado. MEME [23] foi usado para

de novo

digitalização motivo de picos de ligação NKX2-1 (100 pb centradas nas 500 maiores picos de ligação associados com genes). Enriquecimento de vias canônicas foi avaliada pelo Banco de Dados assinaturas moleculares função de “sobreposição de computação” [24]. O conjunto de dados completa de ChIPseq cru lê está disponível no NCBI Sequence Leia Archive (Adesão SRP045118).

integração de dados TCGA

Processados ​​de adenocarcinoma de pulmão TCGA [25] (n = 488) de dados, incluindo o número de cópias de ADN (Affymetrix SNP 6,0) e níveis de transcrição (RNA-Seq), foram acessados ​​a partir do gasoduto Broad Firehose. Casos com

NKX2-1

amplificação foram definidas pelo

NKX2-1

tumorais rácios /normal 1,5, e na ausência de amplificação por tumor normal / 1.1. NKX2-1 alta expressão foi definida como o top 25 percentil de espécimes. Os genes diferencialmente expressos entre

NKX2-1

amplificado /altamente expresso (n = 30) e não amplificado /altamente expresso (n = 60) foram identificados por análise de duas classes SAM [26], utilizando um taxa de falsa descoberta (FDR) 0,05

resultados

análise de RNA-Seq do NKX2-1 regulamentado transcriptoma

Para investigar mecanismos de NKX2-1 oncogênese mediada, nós em primeiro lugar. procurou identificar NKX2-1 genes regulados em

NKX2-1

amplificados linhas celulares de NSCLC. Nós anteriormente caracterizados duas linhas de células NSCLC, HCC1195 e HCC1833, que porto

NKX2-1

amplificação e são dependentes NKX2-1 (com base em estudos knockdown) para a proliferação celular [10]. Aqui, nós examinamos as linhas NSCLC adicionais [19, 27], e identificou mais dois

NKX2-1

amplificado e linhas dependentes, H1819 e H661, para um total de quatro linhas celulares (Fig 1). Três das quatro linhas de células derivam de adenocarcinomas do pulmão (H1819, HCC1195, HCC1833) enquanto que a quarta (H661) é de grande origem carcinoma de células. Análise de duas linhas (HCC1195 e HCC1833) indicou que a menor de duas isoformas NKX2-1 relatados (com a variante N-terminais) [6] foi o único predominantemente expresso (Figura A no arquivo S2).

( a) eficiente mediada por siRNA knockdown NKX2-1 em quatro linhas celulares de NSCLC, demonstrada por western blot. NTC, controle não-alvo. α-tubulina serve como um controlo de carga. (B) NKX2-1 knockdown leva a uma redução significativa da proliferação celular, medido pelo ensaio de viabilidade de WST-1. ***,

P

-valor 0.001 (bicaudal teste t de Student).

Para identificar NKX2-1 genes regulados em cada uma das quatro linhas de células, nós transfectadas as células com uma piscina no TARGETplus siRNA para derrubar NKX2 -1, ou um controlo não-alvo (NTC) piscina siRNA. (Porque nós já tinha demonstrado que siRNAs independentes visando NKX2-1 exibiu NKX2-1 knockdown e reduziu a proliferação celular comparável à piscina NKX2-1 siRNA [10] (Figura B, Painéis A, B e C no arquivo S2), a maioria dos experimentos foram realizadas utilizando a piscina siRNA, com posterior validação dos principais resultados selecionar usando siRNAs independentes.) em seguida, ensaiadas mudanças transcriptoma resultantes de RNA-Seq, comparando células de controlo e NKX2-1 knockdown. Transcriptomes foram ensaiadas 40 horas deixar siRNA-transfecção, um ponto de tempo em que foi observada knockdown de tanto a transcrição e proteínas NKX2-1, bem como a redução da transcrição de proteína tensioactivo B (SFTPB), um alvo regulado NKX2-1 conhecido [21 ] (Fig 2A)

(a) Validação da abordagem:. NKX2-1 knockdown leva à expressão reduzida (por Q-RT-PCR) do alvo regulado NKX2-1 conhecido, SFTPB. ***,

P

-valor 0,001 (teste t de Student de duas caudas). (B) sobreposição entre as quatro linhas celulares de NSCLC de genes substancialmente (≥25%) para baixo ou upregulated seguinte knockdown NKX2-1. (C) Através das quatro linhas celulares de NSCLC, GSEA revela enriquecimento significativo de conjuntos de genes de proliferação; plot GSEA representante indicado (ver também Quadro G no arquivo S1). (D) Heatmap de topo subregulado (azul) e genes regulados positivamente (vermelho), seguindo knockdown NKX2-1 nas quatro linhas celulares de NSCLC. Observe os padrões de expressão subregulado compartilhados em H1819, H661 e HCC1195 (destacado pela caixa verde). ***,

P

-valor 0,01; ***,

P

-valor 0,001 (correlação de Pearson

P

-valor, corrigido para comparações múltiplas de teste).

Confinar a análise de genes bem-medidos (RPKM ≥1), aproximadamente 10.000 genes foram expressos em cada uma das linhas de células, com 9.041 genes comuns em todas as quatro linhas celulares (Figura C, painel a em ficheiro S2, e Tabela D no ficheiro S1). O número de genes substancialmente alteradas pela NKX2-1 knockdown, definido como pelo menos 25% de diminuição ou aumento da expressão, variou de 1,160 a 1,615 entre as quatro linhas de células (Figura C, Painel B no ficheiro S2, e na Tabela E Ficheiro S1) . Apesar disso, alguns genes por esse critério foram consistentemente alterado em todas as quatro linhas celulares. Após a NKX2-1 knockdown, apenas 4 genes foram consistentemente subregulado (

NBL1

,

UNC84B

,

RRBP1

, e

FA2H

), e apenas 9 genes foram consistentemente regulada (

C7ORF60

,

CHD7

,

HIST1H2BC

,

HIST1H2BD

,

HIST1H2BE

,

ID3

,

PIK3CB

,

TP53INP1

,

ZBTB4

) (Fig 2B). Estes genes têm diversas funções celulares (Tabela F no ficheiro S1), entre os quais as funções RRBP1 em resposta ao stress retículo endoplasmático e foi encontrado regulados positivamente em cancro do pulmão [28], e a sobre-expressão do repressor transcricional ID3 tem sido relatado para reduzir o crescimento do cancro do pulmão

in vivo

[29].

Para explorar temas em vez de genes individuais, também realizou uma análise genética de duas classes conjunto de enriquecimento (GSEA) [24], comparando os níveis de transcrição (em frente todas as quatro linhas celulares) após NKX2-1 knockdown

vs

. controle não-alvo. As vias superiores cónicos enriquecidas incluídos vários relativos ao ciclo celular e a proliferação celular (Fig 2C, e Quadro G no ficheiro S1), consistente com o papel conhecido de NKX2-1 na proliferação de células [10, 30]. GSEA avaliação de cada linha celular individual também mostrou enriquecimento de biologia relativa a proliferação celular (Tabela H em Ficheiro S1).

Embora alguns genes atingido o limite de rigorosas para expressão alterada através de todas as quatro linhas de células (apenas 4 consistentemente downregulated e 9 genes regulados positivamente), investigamos se mais genes pode mostrar uma tendência similar. Examinando os 100 melhores genes reprimidos e regulados positivamente em cada linha de células (Tabela I no arquivo S1), uma visualização heatmap (Fig 2D) revelou padrões de expressão compartilhados entre 3 das linhas de 4 células (H1819, HCC1195 e H661), particularmente entre os genes reprimidos com NKX2-1 knockdown. Esta constatação, apoiada por análise de correlação (Fig 2D), sugeriu que estas três linhas celulares pode melhor modelo

NKX2-1

amplificado NSCLC.

Com foco nas três linhas de células (H1819, HCC1195 e H661) com padrões de expressão compartilhadas, 69 genes foram consistentemente subregulado (pelo menos 25%) sobre NKX2-1 knockdown (Fig 2B e Tabela J no arquivo S1), indicando que NKX2-1 regula positivamente a sua expressão. Embora vários foram de possível interesse biológico, notável entre eles era receptor de factor de crescimento epidérmico (EGFR), classificados, respectivamente, 8

th (de 763), 68

th (de 504), e 18

th (de 708) entre os genes regulados negativamente sobre NKX2-1 knockdown nas três linhas celulares. redução da expressão de EGFR, bem como outros genes Select (para substanciar os resultados RNA-Seq), foi verificado por: Q-RT-PCR (Figura C, Painel C no ficheiro S2). Dois siRNAs independentes visando NKX2-1 cada um também reduzidos níveis de transcrição de EGFR (por Q-RT-PCR; Figura B, Painel D em S2 Arquivo) e os níveis de proteína (por western blot; Figura B, painel E no Arquivo S2), EGFR apoio redução ser um fenótipo interferência de ARN alvo em-; outros genes candidatos NKX2-1 regulada não foram avaliados de modo semelhante. Nós não tínhamos anteriormente conseguido resgate de NKX2-1 knockdown pela expressão ectópica de NKX2-1 (não publicado), possivelmente devido a níveis de expressão NKX2-1 não ideais. Portanto, nós não tenta verificar outra interferência RNA no alvo ao resgatar o efeito knockdown NKX2-1 sobre os níveis de EGFR.

ChIPseq análise da NKX2-1 cistrome

Enquanto a estratégia acima (NKX2-1 knockdown juntamente com RNA-Seq) revelou genes NKX2-1 regulamentados, não fez distinção direta de NKX2-1 indireta alvos de transcrição. Por isso, em paralelo, realizou-se cromatina imunoprecipitação -seq (CHIP) para definir os locais de ligação do genoma NKX2-1 e genes associados na mesma quatro

NKX2-1

amplificados /linhagens de células NSCLC dependentes. ChIP-PCR do

SFTB

promotor foi feito antes de ChIP-seq para validar a especificidade do anticorpo anti-NKX2-1 para Chip (Fig 3A).

(A) Validando o anticorpo NKX2-1 para Chip: Chip-PCR identifica o local de ligação NKX2-1 conhecido no promotor SFTPB. Nota o enriquecimento de SFTPB em comparação com um gene irrelevante (genes WNT5A). (B) sobreposição entre as quatro linhas celulares de NSCLC de NKX2-1 ligação genes do local associada (dentro de 100Kb). (C)

De novo

motivo análise re-descobre o NKX2-1 conhecido motivo de ligação de consenso, e identifica o enriquecimento de outros motivos de ligação a fator de transcrição nas proximidades locais de ligação NKX2-1. (D) NKX2-1 picos identificados no locus EGFR em células H1819 vinculativo. Os dois chamados picos são identificados por triângulos azuis, e apoiar as leituras são mostrados na inserção close-up. picos de ligação ao EGFR em outras linhas de células são apresentados na Figura D, Painel B no Arquivo S2.

Nos quatro linhas celulares, ChIPseq identificados 150-1,844 NKX2-1 genes do local associado de ligação (mais próxima gene dentro 100Kb) (Fig 3B e Quadro K no arquivo S1). A maior parte dos locais de ligação ocorreu dentro de 100 KB de genes, como seria de esperar para os promotores ou estimuladores (Figura D, painel A em Ficheiro S2).

De novo

análise motivo recuperou o sítio de ligação Nkx2 conhecido (CACTY) [31] (Fig 3C), validando a qualidade dos dados ChIPseq. Além disso, a análise dos picos de ligação motivo NKX2-1 identificado enriquecimento nas proximidades do motivo FOXA1 em HCC1833 células, consistente com a interacção reportada de NKX2-1 com FOXA1 [32]. Outros local de ligação associado motivos fatores de transcrição NKX2-1 em HCC1833 incluídos MYOD1, NFE2 e TCF3 (Fig 3C)

Apesar do grande número de locais de ligação NKX2-1, apenas um pequeno subconjunto (2 genes associados:. PVT1 e ZC3H7A) foi identificado em todos os quatro

NKX2-1

linhas celulares amplificados (Fig 3B), refletindo os resultados da análise do transcriptoma. De nota, os picos de ligação NKX2-1 foram encontrados associados com

EGFR

em todas as três linhas celulares (H1819, H661 e HCC1195) compartilhando respostas transcrição semelhantes aos NKX2-1 knockdown (Tabela K no arquivo S1, Fig 3D, e Figura D, Painel B no ficheiro S2). NKX2-1 motivos do local de ligação pode ser identificado no ChIPseq picos de ligação ao

EGFR

(Figura D, Painel B no Arquivo S2). Quando considerados em todas as linhas celulares em conjunto, os genes mais próximo (e dentro de 100Kb) para sítios de ligação NKX2-1 foram enriquecidos por vias canônicas específicas, incluindo a sinalização MAPK, a orientação do axônio, a adesão focal e comunicação célula-célula (Tabela L no arquivo S1) , possivelmente refletindo o duplo papel de NKX2-1 na proliferação e diferenciação celular epitelial.

Integrative análise -omic identifica EGFR como efetoras a jusante da amplificada

NKX2-1

Para identificar direta alvos de transcrição de NKX2-1, que integrou as RNA-Seq e ChIPseq conjuntos de dados acima. Entre as quatro linhas celulares diferentes, 2-13% dos genes cuja expressão mudou ≥25% após a NKX2-1 knockdown também nas proximidades (a 100Kb) NKX2-1 ligação picos (Tabelas M e N no arquivo S1 e Figura E em S2 Arquivo). Por outro lado, 6-17% de genes associados com locais de ligação NKX2-1 exibiu mudanças de expressão substanciais (≥25%) seguintes knockdown NKX2-1. Para promover talhar para baixo a lista de candidatos interessantes, e para assegurar a relevância às amostras NSCLC primários, atravessamos-comparado a nossa lista de genes para transcriptoma de dados de 488 adenocarcinomas primários de pulmão de The Cancer Genome Atlas (TCGA) [25]. Em particular, nós identificamos o subconjunto de NKX2-1 regulada alvos diretos presumíveis cuja expressão foi significativamente maior (por duas classes de análise SAM) em adenocarcinomas pulmonares TCGA com

NKX2-1

amplificação /superexpressão (n = 20) , em comparação com os adenocarcinomas sem amplificação (mas ainda assim expressam NKX2-1 num contexto não amplificado) (N = 60) (Tabela 1). Entre as restantes candidatos foi EGFR, que, em síntese foi reprimidos com NKX2-1 knockdown em 3 de 4 linhas de células, foi associada a um chamado de pico ChIP nas mesmas três linhas celulares, e foi significativamente sobre-expressos (FDR = 0,054) no ensino primário CPNPC com

NKX2-1

amplificação /superexpressão. Decididamente, nossas experiências de acompanhamento subsequentes focada em EGFR.

EGFR

é moderadamente amplificado em H1819 células, e é do tipo selvagem (ou seja, sem mutações ativadoras) em todas as quatro linhas [33 -36]. a expressão da proteína EGFR varia, mas foi maior em H1819 (Figura F, Painel A em arquivo S2). Consistente com os resultados RNA-Seq, em todas as três linhas celulares (H1819, HCC1195 e H661) onde NKX2-1 knockdown levaram a uma redução da transcrição de EGFR, NKX2-1 knockdown também conduziu a uma redução de 40-90% da proteína EGFR, avaliada por Western blot (Fig 4A). Consistente com o EGFR, possivelmente, funcionando como um efector a jusante de NKX2-1, derrubar de EGFR (200 nM utilizando siRNA [37]) conduziu a uma redução comparável na proliferação celular, medido pelo ensaio de WST-1 (Figura 4B). Inesperadamente, knockdown de EGFR levou ao aumento dos níveis de proteína de NKX2-1 (Fig 4C), sugerindo um regulador negativo. Dois siRNAs independentes visando EGFR (Figura B, painéis F e G em Arquivo S2) cada um também aumentou os níveis de proteína NKX2-1 (por western blot; Figura B, Painel h em Arquivo S2), de apoio a um fenótipo interferência de RNA em-alvo. Curiosamente, EGFR knockdown não alterou os níveis de transcrição NKX2-1 (Figura B, Painel I no arquivo S2), sugerindo que o aumento dos níveis de proteína NKX2-1 observados foram provavelmente a consequência da regulação pós-transcricional.

( a) NKX2-1 knockdown conduz a níveis reduzidos de proteína EGFR quantificados por western blot (% residual indicado). Os níveis normalizados de a-tubulina de controlo de carga. (B) o EGFR knockdown por siRNA reduz a proliferação celular comparável à NKX2-1 knockdown (ver Figura 1A). **,

P

-valor 0,01 (teste t de Student de duas caudas). (C) EGFR knockdown leva a níveis de proteína NKX2-1 elevadas (% de aumento indicada; níveis normalizados para a-tubulina de controle de carga), sugerindo um regulador negativo

De acordo com um loop de feedback negativo, batida. baixo de NKX2-1 em conjunto com o EGFR reduzida proliferação das células H1819 significativamente mais do que o knockdown de quer isoladamente (Figura 5A). (O knockdown combinada não podia ser testada em células H661 HCC1195 e, porque a concentração necessária para ARNsi maior knockdown EGFR era tóxico para as células). Além disso, combinado NKX2-1 e EGFR knockdown reduzida MAP-quinase (níveis de p-MAPK) e PI3-quinase de sinalização (níveis de p-AKT) crescimento -conhecido /sobrevivência vias de sinalização a jusante de EGFR [38] -mais de knockdown da isoladamente (Fig 5B).

(A) knockdown combinada de NKX2-1 e EGFR reduz a proliferação das células H1819 mais do que qualquer um sozinho. **,

P

-valor 0,01; ***,

P

-valor 0,001 (teste t de Student de duas caudas). (B) knockdown combinada de NKX2-1 e de EGFR em células H1819 diminui sinalização MAPK (p-MAPK) e PI3K (p-AKT) mais do que qualquer um sozinho. Percentagem residual indicado; níveis normalizados de a-tubulina de controlo de carga. Note-se, no oeste particular mostrada, o EGFR knockdown não parece aumentar os níveis de NKX2-1 apreciavelmente, embora o aumento foi reprodutível observada em várias outras experiências (Fig 4C por exemplo, e a Figura B, Painel H em Ficheiro S2). (C) NKX2-1 knockdown colabora com erlotinib inibidor EGFR para inibir o crescimento de células H1819 ***,

P

-valor ≤ 0,001 (teste t de Student de duas caudas).

os resultados acima sugerem que NKX2-1 knockdown pode colaborar com pequena inibição molécula de EGFR quinase. Para testar isto, as células H1819 desafiados com NKX2-1 knockdown (ou de controlo não-direccionamento) para uma concentração de inibição de crescimento ~ 50% (1,0 pM; Figura F, Painel B em Ficheiro S2) do inibidor de EGFR erlotinib. Notavelmente, NKX2-1 knockdown aumentou significativamente o efeito inibidor do crescimento de erlotinib (Fig 5C) no

NKX2-1

células NSCLC amplificados.

Discussão

NKX2-1 é um fator de transcrição, de modo que seus efeitos oncogénicos quando amplificado se presume serem mediadas através de regulação da transcrição de alvos a jusante chave. Para identificar esses alvos, aqui foi realizado um combinado transcriptoma (knockdown NKX2-1 seguido de RNA-Seq) e cistrome (genes NKX2-1 vinculado por ChIPseq) a análise em quatro linhagens de células NSCLC exibindo

NKX2-1

amplificação e crescimento -dependência. Os resultados foram ainda mais integrado com o genoma e transcriptoma dados TCGA de casos NSCLC primária, das quais identificadas e mais estudados EGFR como um alvo a jusante.

Um resultado inesperado das knockdown experimentos /RNA-Seq foi a relativamente pequena sobreposição de substancialmente up /genes através das linhas de células reprimidos. Isso provavelmente reflete a heterogeneidade entre os tumores diferentes do paciente, onde tipos de células distintas de origem, padrões de diferenciação, e /ou alterações genéticas do tumor (epi) podem influenciar a paisagem de genes regulados por NKX2-1. Apesar disso, três das linhas celulares de 4 partilhada padrões de expressão genética significativas, exibiu enriquecimento para alguns processos (por exemplo, proliferação celular), e genes específicos nomeados (EGFR).

A análise combinada de locais de ligação mais NKX2-1 identificou o subconjunto de NKX2-1 alvos de transcrição diretos prováveis ​​(embora notamos que os alvos de transcrição indiretos também podem ter importantes funções biológicas).