Abstract

A hipoxia é conhecida por desempenhar crítica papéis na sobrevivência celular, angiogénese, invasão tumoral e metástases. A hipoxia mediada por sobre-expressão do factor indutível por hipoxia (HIF) foi mostrado estar associado com resistência a terapêuticas, e contribui para o mau prognóstico de doentes com cancro. Evidências sugerem que a hipóxia e HIF vias contribui para a aquisição de epitelial-a-mesenquimal de transição (EMT), manutenção das funções de células-tronco do câncer (CSC), e também mantém o ciclo vicioso de inflamação, todos que levam a resistência terapêutica. No entanto, o mecanismo molecular exacto (s) que por hipóxia /HIF conduz estes acontecimentos não são completamente compreendidos. Aqui, demonstramos pela primeira vez, que a hipoxia leva ao aumento da expressão do VEGF, IL-6, e os genes de assinatura CSC Nanog, Oct4 e EZH2 consistente com o aumento da migração de células /invasão e angiogénese, e a formação de pancreatospheres, concomitante com aumento da expressão de miR-21 e miR-210 em células humanas do cancro do pâncreas (PC). O tratamento de células PC com CDF, um novo composto sintético inibiu a produção de VEGF e de IL-6, e regulados negativamente a expressão de Nanog, Oct4, EZH2 ARNm, assim como o miR-21 e miR-210 em condições de hipoxia. CDF também levou à diminuição da migração de células /invasão, angiogênese e formação de pancreatospheres sob hipóxia. Além disso, o CDF diminuição da expressão do gene de miR-21, o miR-210, IL-6, HIF-1α, VEGF, e as assinaturas CSC

in vivo

num modelo ortotópico de rato PC humana. Colectivamente, estes resultados sugerem que a actividade anti-tumoral de CDF é em parte mediada através da desregulamentação do tumor vias de hipóxia, e, assim, CDF poderia tornar-se um romance, e agente anti-tumoral eficaz para a terapia PC

Citation.: Bao B, Ali S, Ahmad A, Azmi AS, Li Y, Banerjee, S, et al. (2012) A hipoxia induzida Agressividade de células de cancro do pâncreas é devido ao aumento da expressão do VEGF, IL-6 e miR-21, que podem ser atenuadas por tratamento CDF. PLoS ONE 7 (12): e50165. doi: 10.1371 /journal.pone.0050165

editor: Daotai Nie, Faculdade de Medicina da Universidade de Southern Illinois, Estados Unidos da América

Recebido: 26 de agosto de 2012; Aceito: 22 de outubro de 2012; Publicação: 13 de dezembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Bao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo National Cancer Institute, National Institutes of Health concede R01CA131151, R01CA132794 e R01CA154321 atribuído a FHS, eo Departamento de Defesa Exploração-Hipótese de Desenvolvimento Award PC101482 atribuído a Bin Bao. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Co-autor Dr. Sarkar é membro do Conselho Editorial PLOS ONE. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O câncer de pâncreas (PC) é uma das doenças malignas mais mortais com a clínica mais pobres resultado no mundo. Em 2012, estima-se que 43, 920 indivíduos serão recém-diagnosticados com PC, e serão responsáveis ​​por 37, 390 morte relacionada ao câncer nos Estados Unidos [1]. Devido à ausência de sintomas específicos, a falta de técnicas de detecção precoce e fenótipos altamente agressivos, PC é geralmente diagnosticado numa fase avançada-incuráveis ​​e metastáticos [2], [3]. Assim, a sobrevivência média geral é de aproximadamente seis meses após terapias cirúrgicas e quimio-radiação para estágios localmente avançados e metastáticos de PC. Consequentemente, a taxa de sobrevivência global em cinco anos é inferior a cinco por cento. Essa taxa de sobrevivência mais curto é principalmente devido ao diagnóstico tardio e resistência à terapêutica, contribuindo para a recorrência de tumores e metástases.

A hipoxia é um dos fenômenos biológicos fundamentais que estão fortemente associados com o desenvolvimento e agressividade de uma ampla variedade de tumores sólidos, incluindo PC. factores hypoxia-inducible (HIF) é um factor de transcrição central que medeia genes responsivos a hipóxia e têm sido amplamente aceites para desempenhar papéis críticos na invasão tumoral, metástase, e resistência ao tratamento, devido ao seu aumento da proliferação de células, a sobrevivência, a angiogénese e a migração de células e invasão [4], [5]. Portanto, hipoxia tumor com a expressão alterada do HIF e o seu resultado efeito biológico no pior resultado clínico de pacientes diagnosticados com tumores sólidos, resultando em mortalidade mais elevada, o que sugere que a compreensão da relação molecular de hipoxia com outras características moleculares e celulares da a agressividade do tumor, seria inestimável para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para o tratamento de desenvolvimento de tumor sólido e progressão. Tem sido largamente aceite que as células estaminais do cancro (CSCs) e epitelial-a-mesenquimal transição (EMT) células fenotípicas são altamente associado com resistência terapêutica e contribui para o crescimento agressivo do tumor, invasão e metástase, e são vulgarmente consideradas como um dos as principais causas de recorrência do tumor e recaída [6]. Os dados do aumento do número de estudos indicam que a hipóxia e HIF sinalização via levem ao enriquecimento de CSCs e células EMT como revisto recentemente [7], contribuindo para fenótipos agressivas do tumor, que também poderia ser devido à desregulamentação dos microRNAs (miRNAs).

Os miARNs são bem conhecidos para desempenhar papéis essenciais em uma grande variedade de processos biológicos, tais como a diferenciação celular, proliferação, morte, sobrevivência, homeostase e o metabolismo da energia [8], [9]. Acumulando as evidências sugerem que miARN pode ter um papel crítico no desenvolvimento e progressão de disaeses malignas. As alternâncias de expressão miRNA têm sido alegadamente associado a evolução clínica de pacientes com tumor, resistência ao tratamento, recorrência do tumor e /ou recaída. Um grande número de miARNs têm sido relatados para ser sensível à hipoxia HIF e via de sinalização em uma ampla variedade de células e tecidos, incluindo células cancerosas [10] – [13]. Verificou-se que a hipoxia diminuiu a expressão de miR-101, uma molécula anti-oncogénica potencial, e aumento da expressão de miR-21 e miR-210, as moléculas pro-oncogénicos em vários cancros, incluindo PC [14], [15]. Assim, a regulação mediada por hipoxia da miARNs podem desempenhar papéis importantes em fenótipos agressivas do tumor mediadas por meio da modulação de vias de sinalização celulares, incluindo HIF via de sinalização dentro de um microambiente do tumor. Portanto, estes miARNs direccionamento mediado por hipoxia pode proporcionar uma nova estratégia terapêutica e eficaz para a prevenção e /ou tratamento de tumores sólidos, incluindo PC.

Neste estudo, examinou-se o efeito da hipóxia sobre a migração celular, invasão e angiogénese, e a expressão do VEGF, IL-6, os genes de assinatura CSC, o miR-21 e miR-210 em células PC sob condições hipóxicas. Investigou-se também o papel de miR-21 na regulação de VEGF, IL-6, a formação de pancreatospheres, e os genes de assinatura CSC em células PC. Além disso, examinou-se o efeito de um novo derivado sintético da curcumina (CDF) sobre a sobrevivência de células, migração, invasão, angiogénese, formação de pancreatospheres, e a expressão de HIF-1α, VEGF, IL-6, genes de assinatura CSC, e miARNs em células PC em condições de hipóxia. Finalmente, analisou o efeito da CDF em miR-21, miR-210, HIF-1a, VEGF e CSC marcadores de assinatura

in vivo

.

Materiais e Métodos

Reagentes e anticorpos

Um romance CDF analógico derivados de curcumina foi sintetizado como descrito na nossa publicação anterior [16]. Os anticorpos contra CD44, EpCAM, e HIF-1α foram obtidos a partir de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Os anticorpos contra Ki-67 e VEGF foram adquiridos a partir de Santa Cruz (Santa Cruz, CA). Anticorpo contra EZH2 foi obtido a partir de BD Biosciences (San José, Califórnia). Alexa Fluor 488 cabra-anti-rato IgG para CD44 e coloração EpCAM foram obtidos a partir de Invitrogen. O miARN transcrição reversa (RT), iniciadores de PCR, sondas e anti-miR-21 inibidor foram obtidos de Applied Biosystems (Carlsbad, CA). O violeta de cristal e solução de Matrigel foram obtidos de Sigma Chemicals (St. Louis, MO).

cultura celular

de cancro pancreático humano (PC) linhas celulares AsPC-1 e MiaPaCa-2 foram mantidas em células a cultura padrão ou condições de normóxia (21% de O2 e 5% de CO2, 37 ° C), como descrito anteriormente [17]. Hipóxico (1% O

2) e 5% de CO

2 condições foram gerados através do controlo dos caudais de entrada de azoto e dióxido de carbono, respectivamente. Todas as linhas celulares foram mantidas em meio DMEM com FBS a 10% a uma condição de cultura de células padrão. Todas as linhas celulares foram autenticados pela Genomics Centro de Tecnologia Aplicada da Wayne State University, em 13 de março de 2009 e estas células autenticados foram congelados para uso posterior. O método utilizado para o teste foi de curta repetição em tandem de perfis utilizando o Sistema PowerPlex 16 da Promega. A gemcitabina

A sobrevivência celular ensaio

ensaio de MTT foi realizado para investigar o efeito de CDF sobre a sobrevivência celular em células PC humanas (células AsPC-1 e MiaPaCa-2) sob condições hipóxicas. 3000 células foram semeadas cada poço das placas de 96 poços e incubou-se a condições de cultura padrão (21% de O

2 e 5% de CO

2) durante a noite. As células foram então tratadas com diferentes concentrações de CDF (0-0,5 mM) e incubou-se durante 8 horas sob condições hipóxicas (1% O

2) seguido por 16 h de condições de normóxia (21% O

2) cada dia. Após 3 dias de tratamento, as células foram colhidas para o ensaio de MTT padrão, como descrito nas nossas publicações anteriores [18], [19].

clonogénicas ensaio

ensaio clonogénico foi conduzido para examinar o efeito de CDF no crescimento celular e a proliferação de células PC em condições hipóxicas, como descrito anteriormente [18]. 5 × 10

4 células foram plaqueadas numa placa de 6 poços. Depois de 3 dias de exposição a 0,5 uM de CDF (8 h de condições hipóxicas e 16 h de condições de normóxia cada dia), as células foram tripsinizadas, e 1.000 células viáveis ​​individuais foram semeadas em placas de 100 mm de placas de Petri. As células foram então incubadas durante 10 a 12 dias a 37 ° C em 5% de CO

2/5% de ó

2/90% N

2 incubadora. Colónias foram coradas com 2% de violeta de cristal, lavado com água, e contadas.

Invasion ensaio

O

in vitro

ensaio de invasão de células PC foi conduzido sob condições de hipóxia por usando Costar Transwell de 24 poços placas com membrana de policarbonato (Corning Incorporated, Corning, NY), como descrito anteriormente [19]. Resumidamente, 4 × 10

4 de células PC humanos (AsPC-1 e MiaPaCa-2) expostas a 3 dias de incubação sob normóxia ou hipóxia condições, respectivamente, foram semeadas em cada poço das placas Transwell pré-revestidas de Matrigel em FBS-free meios de cultura. Os poços de fundo do sistema foram cheios com 10% de FBS meio completo. Após 20 h de incubação, quer na ausência ou na presença de CDF (0,5 uM), as células cancerosas invadiram foram coradas com 4 ug /ml de calceina-AM (Invitrogen) em solução de PBS a 37 ° C durante 1 h, seguindo o fabricante de manual. As fotografias foram tiradas com um microscópio de fluorescência (Nikon Eclipse TE2000-L) ligado a um computador.

cicatrização de feridas ensaio

Para examinar o efeito de CDF sobre a migração celular de células PC sob condições hipóxicas , realizamos ferida ensaio de cura, como descrito anteriormente [17]. Resumidamente, quando as células AsPC-1 atingiu 90-95% confluentes, a ferida foi gerado por arranhando a superfície das placas com uma 10-200 uL de ponta de pipeta. As células foram em seguida incubadas na ausência e na presença de CDF (0,5? M) e foram incubados sob condições hipóxicas durante 4 h, seguido de 16 h de condições de normóxia e depois fotografadas utilizando um microscópio Nikon Eclipse TS100.

formando tubo de ensaio

Para examinar o efeito de CDF na angiogénese

in vitro

usando células endoteliais vasculares em condições hipóxicas, realizamos ensaio de formao de tubo, como descrito anteriormente [20]. Resumidamente, 3 × 10

4 coelho células endoteliais vasculares foram semeadas em cada poço da placa de 96 poços de Matrigel-pré-revestido em 100 uL de meio com FBS-DMEM a 10%, e exposto a condições de normóxia ou hipóxia durante 4 h de incubação a 37 ° C, seguido de 16 h de condições de normóxia. A fotografia foi tirada a 4 h e 20 h, respectivamente.

citocinas VEGF e IL-6 ensaio

ensaio

ELISA foi realizado para avaliar o efeito de CDF em produções de citocinas induzida por hipoxia de VEGF e IL-6 por células PC humanos. O meio de cultura das células sob hipóxia ou de normóxia condições, respectivamente, durante 16 h foram colhidas para a medição de VEGF e de IL-6 pelo uso de kits de ELISA (R D Systems)., Seguindo o manual do fabricante

esfera ensaio de formação de

o ensaio de formação de esfera foi realizado para avaliar o efeito de CDF na capacidade de auto-renovação de células PC CSC sob condições hipóxicas, como descrito anteriormente [19]. Resumidamente, 1000 células /poço de suspensões de células individuais foram semeadas em poços de ultra baixa aderentes das placas de 6 poços (Corning, Lowell, MA) em meio de formação de esfera (01:01 de DMEM /F-12 suplementado com B-27 e N-2; Invitrogen), e exposto a condições de hipóxia todos os outros dias. Após 7 dias, as esferas com o diâmetro maior que 50 μmeters denominado como “pancreatospheres” foram recolhidos por centrifugação (300 x g durante 5 min), e contadas.

A imunocoloração e ensaio de microscopia confocal

10000 de suspensões de células únicas de células PC por poço foram semeadas e incubadas durante 24 h, usando poços ultra-baixa aderentes da placa de 6 poços (Corning, Lowell, MA) em meio de formação de esfera, seguido por cultura sob condições hipóxicas em dias alternados, tal como descrito acima. Após 7 dias de tratamento CDF, os pancreatospheres foram recolhidos por centrifugação (300 x g durante 5 minutos), lava-se com 1 x PBS, e fixado com 3,7% parformaldehyde durante 10 min à temperatura ambiente. anticorpos monoclonais CD44 e EpCAM foram utilizado para a imunocoloração de ensaio, seguindo o protocolo do fabricante, conforme descrito anteriormente [17], [21]. Os CD44 ou rotulados-EpCAM pancreatospheres foram fotografados usando um microscópio de imagem confocal (Leica TCS SP5) com 200 × ampliação na instalação MIRL Core, Escola Wayne State University of Medicine.

A transfecção de anti-miR-21 siRNA

2 × 10

5 células /cavidade (as células MiaPaCa-2 parentais) ou 10.000 células (células MiaPaCa-2 esfera) por poço foram semeadas em placas de seis cavidades e foram transfectadas com anti miR-21-siRNA ou ARNsi de controlo negativo (Ambion, Austin, TX), numa concentração final de 20 nM, utilizando o reagente de transfecção DharmaFECT (Dharmacon), seguindo o protocolo do fabricante, como previamente descrito [17].

reversa em tempo real transcriptase- reacção em cadeia da polimerase (RT-PCR) de ARNm e miARNs

para determinar os níveis de ARNm relativos, dois microgramas de ARN totais extraídos a partir de cada amostra foram utilizadas para a reacção de RT em 20 uL de volume de reacção usando um sistema de transcrição inversa (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. kit de SYBR Green PCR Ensaio (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) foi utilizado para a reacção de PCR em tempo real, utilizando AB StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems), seguindo o protocolo do fabricante. As sequências de iniciadores de PCR foram descritos anteriormente [19]. Os dados foram analisados ​​usando C

método T e foram normalizadas para expressão de GAPDH em cada amostra. Para determinar a expressão de miARN nas células, o kit TaqMan MicroRNA Ensaio (Applied Biosystems) foi utilizado seguindo o protocolo do fabricante. Cinco ng de RNA total foi transcrito de forma inversa tal como descrito anteriormente [19]. As reacções de PCR em tempo real foram, em seguida, levada a cabo num volume total de mistura reaccional de 10 ul utilizando uma solução de TaqMan PCR como descrito anteriormente [17]. Os dados foram analisados ​​utilizando C

método de t, normalizado pela expressão RNU48 em cada amostra.

Experiências com animais

O protocolo de experimentação animal foi aprovado pelo Comitê de Investigação Animal, Wayne State University, Detroit, MI. Feminino (SCID) imuno-deficiente CB17 severa combinada com a idade de 4 semanas de idade foram adquiridos a Taconic Farms (Germantown, NY) e foram alimentados com dieta de laboratório 5021 (Purina Mills, Inc., Richmond, IN). 10 × 10

6 células MiaPaCa-2 foram implantados ortotopicamente para os pâncreas dos ratos, tal como descrito na nossa publicação anterior [17], e, assim, os dados de actividade anti-tumor não é aqui apresentado. Uma vez que os ratinhos desenvolveram tumores palpáveis, os animais foram divididos aleatoriamente em dois grupos: (1) controlo não tratado; (2) CDF (5 mg /rato /dia), intragástrica uma vez por dia durante 12 dias. As medições do tumor e as variações do peso foram realizadas. O tecido de tumor a partir de todos os grupos de animais foram removidos, rapidamente congelada em azoto líquido, e armazenado a -80 ° C para utilização posterior para o estudo de ARN e histologia como apresentado neste trabalho.

O estabelecimento do tumor MiaPaC-2 células esfera

a fim de examinar o efeito do CDF ou anti-miR-21 em VEGF, IL-6, assinaturas CSC no CSC-subpopulação de células tumorais, como, desenvolvemos MiaPaCa-2 esfera células de tumor em rato modelo de xenoenxerto, como descrito anteriormente [22]. Resumidamente, cerca de 5000 de células pancreatospheres MiaPaCa-2 foram implantados no modelo de murganho de xenoenxerto (4 semanas de idade) para enriquecer a população de células estaminais do cancro (CSC). O tumor foi removido e as células foram cultivadas no meio de formação de esfera, como descrito acima, para desenvolver as pancreatospheres secundárias, que é referido como “células de tumor esfera MiaPaCa-2”. -2 MiaPaCa células esfera tumor também foram caracterizados em nossas publicações anteriores [17], [22].

Imunohistoquímica

e cortes de tecidos tumorais embebidos em parafina foram avaliados por imuno-histoquímica no fixo com formalina facilidade de núcleo do Departamento de Patologia, Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI, como descrito anteriormente [17]. Resumidamente, 5-15 ^ m de espessura secções de tecido foram cortadas e montadas em lâminas revestidas com gelatina histológicos. Deparaffinizations das lâminas realizadas usando solução de xileno, seguido de lavagem com diferentes concentrações de álcool e de água desionizada. coloração imuno-histoquímica foi realizada utilizando o Ki-67 (1:400), HIF-1α (1:100), VEGF (1:100), EpCAM (01:50), e EZH2 (1:50) com anticorpos primários e diluições apropriadas utilizando soro de hospedeiro normais para controlos negativos seguido de coloração com anticorpos secundários apropriados com peroxidase de rábano conjugado, seguindo as instruções dos fabricantes. As lâminas foram desenvolvidas em uma solução de diaminobenzidina e contrastadas com uma solução fraca de hematoxilina utilizando kit ABC Reagente (Vector Labs), seguido de coloração nuclear usando o kit de coloração de AEC (Vector Labs). As lâminas coradas foram desidratados e montados em solução Permount e examinado por um patologista licenciado. As fotografias foram tiradas com uma Nikon ESLIPSE E800 com 20 × ampliação. A coloração imuno-histoquímica recebeu uma pontuação global com base na intensidade de coloração (sem coloração como zero; fraca como 1+; moderada como 2+; forte como 3+) adicionado em conjunto com as células positivas por cento (sem coloração como zero; 25% como 1+;. 25-50% como 2+ e superior a 50%, como 3+)

A análise estatística

A média eo desvio padrão (SD) de dados deste estudo foram preparados utilizando software GraPad Prism (versão 4.03). As comparações de resultado do tratamento foram testados para a diferença significativa pela análise ANOVA emparelhado

t

teste ou. A significância estatística foi assumida em um

valor p

inferior a 0,05.

Resultados

CDF aumento da sobrevivência celular e clonogenicidade de células PC em condições de hipóxia

a fim de investigar o efeito da CDF sobre a sobrevivência celular em células PC humanas, em condições hipóxicas, ensaio de MTT foi realizado utilizando células humanas (células PC AsPC-1 e MiaPaCa-2). Os resultados indicam que a sobrevivência das células CDF significativamente inibida de células AsPC-1 e MiaPaCa-2 em uma maneira dependente da dose (Figura 1A). ensaio clonogénico foi realizado para examinar o efeito de CDF (0,5 umol /L) sobre o crescimento de células e proliferação de células de PC sob condições hipóxicas. Os resultados mostraram que o tratamento CDF diminuiu clonogenicidade de AsPC-1 e células MiaPaCa-2, sob condições hipóxicas (Figura 1B). Estes achados sugerem que CDF inibe a sobrevivência das células e crescimento clonogénico de células PC sob condições hipóxicas.

A painéis A, B, C, e D representam o crescimento celular, clonogenicidade, VEGF, e IL-6, respectivamente. Os meios condicionados foram recolhidos a partir de células cultivadas em condições de normóxia e de hipóxia, como descrito na secção de métodos. As medições de VEGF e IL-6 foram realizados por ELISA. As barras nos gráficos indicam o desvio padrão (SD) de pelo menos n = 3. * indica p . 0,05

Efeito da CDF nas produções de VEGF e IL-6 citocinas em células PC sob condições de hipóxia

Nós também analisou o efeito da CDF em VEGF induzida por hipóxia e IL-6 produções de células PC usando ensaio ELISA. Os resultados mostram que as células AsPC-1 e MiaPaCa-2 foram incubadas em condições de hipoxia aumentaram as produções de VEGF e de IL-6, em comparação com as células incubadas em condições de normóxia (Figura 1C). CDF tratamento diminuiu notavelmente a produção de VEGF induzida por hipoxia e IL-6 em células PC (Figura 1C), sugerindo um papel inibidor das CDF nas produções de VEGF induzida por hipoxia e IL-6 em células de cancro pancreático humano.

efeito da CDF sobre a angiogênese

in vitro

em células endoteliais vasculares em condições de hipóxia

a fim de examinar o efeito do CDF sobre a angiogênese

in vitro

em condições de hipóxia , foi realizado ensaio de formao de tubo, utilizando células endoteliais vasculares. Os resultados mostram que as condições de hipóxia aumentou significativamente a formação de tubos de células endoteliais vasculares em 4 h e 20 h de incubação, respectivamente, em comparação com condições de normóxia (p = 0,0016 e p = 0,016, respectivamente; n = 3). CDF tratamento inibiu significativamente a formação do tubo induzida por hipoxia de células endoteliais vasculares (p = 0,004; n = 3) (Figura 2A). Para avaliar se as moléculas de CDF-mediadas ou si CDF contribui para a inibição da formação do tubo, que recolhido não CDF-tratados (controlo) e CDF-tratada meio condicionado a partir de células cancerosas e realizado o ensaio de formao de tubo, sob condições de normóxia. Tal como mostrado na Figura 2B, as células endoteliais vasculares incubadas com meio condição de controlo tinham aumentado a formação do tubo em 4 h e 20 h, em comparação com as células incubadas com meio condicionado de CDF-pré-tratado (p = 0,029 e p = 0,011; n = 3). A adição de CDF para o controle de meios condicionados inibiu significativamente a formação do tubo, em comparação com as células incubadas em ambos os meios de controlo de ar e pré-CDF-tratada meios condicionados (p = 0,0001; n = 3) (Figura 2B). Estes dados sugerem que se CDF contribui para a inibição da formação do tubo de células endoteliais vasculares

A painéis A . B, C D, e E representam a angiogénese, a migração celular e invasão, respectivamente. Tal como descrito na secção de Métodos, angiogénese

in vitro

foi avaliada pelo ensaio de formação de tubo usando células endoteliais; migração celular foi avaliada por ensaio de cicatrização de feridas; invasão foi avaliada por ensaio de invasão de câmara.

Efeito da CDF sobre a migração e invasão celular in vitro em células de PC em condições de hipóxia

A ferida ensaio de cura foi realizado para examinar o efeito de CDF sobre a migração celular de células PC em condições de hipóxia. Tal como mostrado na Figura 2C, as células expostas AsPC-1-hipoxia tinha aumentado a capacidade de cicatrização da ferida, em comparação com as células cultivadas sob normoxia (p = 0,0001; n = 3) (Figura 2C). CDF tratamento inibiu a capacidade de cicatrização de feridas, em que as células cancerosas em condições de hipóxia (p 0,05; n = 3) (Figura 2C e D). Para examinar o efeito do CDF na invasão de células PC em condições de hipóxia, realizamos

in vitro

ensaio de invasão. Tal como mostrado na Figura 2E, tanto AsPC-1 e células MiaPaCa-2 expostas a condições de hipóxia tinha aumentado a capacidade de invasão, em comparação com as células expostas a condições de normóxia. CDF tratamento inibiu a capacidade de invasão induzida por hipoxia de células PC. Estes dados sugerem que a CDF pode inibir a migração celular induzida por hipoxia e invasão de células PC humanos.

Efeito do CDF sobre a expressão de genes de marcadores de CSC em células PC sob condições hipóxicas

O tempo real ensaio de RT-PCR foi conduzida para examinar o efeito de CDF nos genes de assinatura de células estaminais do cancro (CSC) em AsPC-1 e células MiaPaCa-2, sob condições hipóxicas. Como mostrado na Figura 3, a hipoxia induzida os níveis de ARNm relativos de Nanog, Oct4, e EZH2 em AsPC-1 e MiaPaCa-2 células, enquanto que CDF diminuiu os níveis de Nanog, Oct4, e EZH2 ARNm em células PC sob condições hipóxicas.

em tempo real de RT-PCR foi utilizado tal como descrito na secção Métodos. As barras nos gráficos indicam SD de n = 3. * indica p . 0,05

Efeito da CDF sobre a expressão microRNA (miRNA) de miR-21 e miR-210 em células PC sob hipóxica condições

a fim de examinar o efeito de expressão em CDF miARN em células PC sob condições hipóxicas, foram medidos os níveis relativos de miR-21 e miR-210 em condições de hipóxia por em tempo real de RT-PCR. Como mostrado na Figura 3, a hipoxia induzida os níveis relativos de miARN de miR-21 e miR-210 em AsPC-1 e MiaPaCa-2 células, enquanto que CDF diminuiu os níveis de miR-21 e miR-210 em células PC sob condições hipóxicas, sugerindo CDF que é um potente agente de atenuar a expressão induzida por hipoxia de miR-21 e miR-210 em células PC humanos.

Efeito do CDF ou anti-miR-21 sobre a capacidade de auto-renovação CSC no PC humana células sob condições hipóxicas

de modo a avaliar o efeito de CDF ou anti-miR-21 sobre a capacidade de auto-renovação de células PC CSC humanos sob condições hipóxicas, foi realizado o ensaio de formação de esfera usando AsPC-1 e células MiaPaCa-2. Os resultados mostram que o anti-miR-21 diminuiu a formação de pancreatospheres em células MiaPaCa-2 (Figura 4A). Estes dados sugerem que o miR-21 pode desempenhar um papel importante na regulação da capacidade de auto-renovação de células PC CSC-like. Da mesma forma, o tratamento CDF diminuiu a formação de pancreatospheres em AsPC-1 e células MiaPaCa-2, sob condições hipóxicas (Figura 4A).

A painéis A, B, e C representam a formação de pancreatospheres, a expressão de CD44 e EpCAM, e a produção de VEGF e de IL-6, respectivamente. O ensaio de formação de esfera foi realizado para examinar a capacidade de auto-renovação das CSCs em células PC, conforme descrito na secção Métodos. microscopia de imagem confocal (200 x de ampliação) foi realizada para medir a CSC marcadores de superfície celular CD44 e EpCAM nas células do tumor esfera MiaPaCa-2, conforme descrito na secção Métodos. As barras nos gráficos indicam SD de n = 3. * indica p . 0,05

Efeito da CDF ou anti-miR-21 na expressão de proteínas marcadoras de superfície celular CD44 CSC e EpCAM no PC células derivadas de células esfera sob condições hipóxicas

Para examinar se ou não CDF ou anti-miR-21 inibe a expressão de CSC marcadores de superfície celular CD44 e EpCAM em células CSC-como derivados a partir de células PC, foram realizadas confocal microscopia de imagem para avaliar a expressão de CD44 e de EpCAM nas células MiaPaCa-2 iniciadas esfera células derivadas de tumor. Os resultados mostram que o anti-miR-21 diminuiu a expressão de CD44 e de EpCAM em MiaPaCa-2 esfera células de tumor, sob condições de hipoxia, consistente com os resultados do tratamento de CDF (Figura 4B). Estes dados sugerem que CDF sub-regula a formação de células esfera MiaPaCa-2 tumor consistentes com a infra-regulação da expressão de CD44 e de EpCAM, que é em parte mediada por diminuição da expressão de miR-21.

Efeito do CDF ou anti-miR-21 em VEGF e IL-6 produção nas células de MiaPaCa-2 esfera tumorais sob condições hipóxicas

Tal como mostrado na Figura 4C, MiaPaCa-2 esfera células do tumor produzidos relativamente maior quantidade de VEGF sob hipóxica condições, em comparação com as suas células parentais MiaPaCa-2 (2.174 pg /mL /10

4 MiaPaCa-2 células esfera tumor vs 3248 /ml

6 MiaPaCa-2 células pg /10; Figura 1C e 4C), sugerindo que as esferas MiaPaCa-2 tumorais possam promover a angiogénese por cima-regulação da produção de VEGF. Também descobriram que o tratamento CDF diminuição da produção de VEGF induzida por hipoxia em MiaPaCa-2 células esfera tumor. Do mesmo modo, as células MiaPaCa-2 esfera produzida relativamente maior quantidade de induzida por hipoxia de IL-6, em comparação com as suas células progenitoras (18 pg /ml /10

4 MiaPaCa-2 células esfera vs 164 pg /mL /10

6 células MiaPaCa-2 parentais; Figura 1D e 4C). CDF tratamento ou deficiência de miR-21 por anticorpos anti miR-21-transfeco diminuiu a produção de hipoxia induzida por IL-6 nas células-esfera CSC como (Figura 4C).

Efeito do CDF ou miR-21 a deficiência na expressão dos genes de HIF-1α, VEGF, IL-6, CD44, EpCAM, e EMT marcadores fenótipo em células esfera MiaPaCa-2 tumorais sob condições hipóxicas

Tal como mostrado na Figura 5A, o tratamento reduziu a CDF Os níveis de ARNm relativos de HIF-1α, VEGF, IL-6, CD44, e EpCAM em MiaPaCa-2 esfera células de tumor, sob condições hipóxicas. Do mesmo modo, a sub-regulação de miR-21 por anticorpos anti-miR-21 diminuiu a transfecção de expressão destes genes em células de MiaPaCa-2 esfera de tumor, sob condições hipóxicas. Nós também examinou se ou não CDF ou deficiência miR-21 regula a expressão gênica de marcadores EMT em MiaPaCa-2 células esfera tumor em condições de hipóxia. Descobrimos que a inactivação de miR-21 expressão resultou num decréscimo significativo nos níveis de ARNm relativos de EMT marcadores mesenquimais ZEB1 e vimentina, e aumentou o nível de ARNm relativa de epitelial marcador de E-caderina nas células esfera de tumor, sob condições hipóxicas (Figura 5A ). Da mesma forma, CDF diminuiu os níveis de mRNA de ZEB1, vimentina, e torcer nas células esfera tumor sob condições de hipóxia (Figura 5A).

Os painéis A e B representam os mRNAs e miRNAs, respectivamente. As células foram transfectadas com esfera anit-miR-21 utilizando o reagente de transfecção, seguindo o manual do fabricante. em tempo real de RT-PCR foi utilizado tal como descrito na secção Métodos. As barras nos gráficos indicam SD de n = 3. * indica p . 0,05

Efeito da CDF sobre a expressão miRNA em MiaPaCa-2 células tumorais esfera em condições de hipóxia

a evidência experimental recente mostrou que a hipoxia poderia regular a expressão de um número de miARN, incluindo o anti-oncogénica (let-7 e miR-101), e pro-oncogénicas miARNs (mIR-21 e miR-210) [10], [ ,,,0],12], [13], [15], [23], [24].