Abstract

Justificativa

Novas abordagens para definir factores subjacentes à imunopatogênese de doenças pulmonares, incluindo sarcoidose e tuberculose são necessária para desenvolver novos tratamentos e biomarcadores. Comparando a resposta transcricional sangue de tuberculose a outras doenças pulmonares semelhantes irá avançar o conhecimento das vias de doenças e ajudar a distinguir as doenças com apresentações clínicas semelhantes.

Objetivos

Para determinar os factores subjacentes a imunopatogênese da granulomatosa doenças, sarcoidose e tuberculose, comparando as respostas de transcrição de sangue nessas e em outras doenças pulmonares.

Métodos

Nós comparamos sangue total genoma-largas perfis de transcrição em sarcoidose pulmonar, tuberculose pulmonar, a comunidade pneumonia e câncer de pulmão primário e controles saudáveis, antes e após o tratamento, e em populações de leucócitos purificadas adquirido.

MEDIDAS e rESULTADOS

Um Interferon-inducible sangue-driven neutrófilos assinatura da transcrição estava presente em tanto sarcoidose e tuberculose, com uma maior abundância e expressão em tuberculose. A heterogeneidade da assinatura sarcoidose correlação significativa com a atividade da doença. perfis de transcrição no câncer de pneumonia e pulmão revelou um excesso de abundância de transcritos inflamatórias. Após o sucesso do tratamento a atividade transcricional em pacientes com tuberculose e pneumonia foi significativamente reduzida. No entanto, os pacientes com sarcoidose glucocorticóides-responsivos mostraram um aumento significativo na actividade de transcrição. transcrições 144 de sangue foram capazes de distinguir tuberculosis de outras doenças pulmonares e controles.

Conclusões

A tuberculose e sarcoidose revelou perfis de transcrição de sangue semelhantes, dominadas por transcrições de interferão-inducible, enquanto pneumonia e câncer de pulmão mostrou assinaturas distintas, dominadas por genes inflamatórios. Houve também diferenças significativas entre a tuberculose e sarcoidose no grau de sua atividade transcricional, a heterogeneidade dos seus perfis e sua resposta transcricional ao tratamento

Citation:. Bloom CI, Graham CM, Berry MPR, Rozakeas F, Redford PS, Wang Y, et al. (2013) transcricional Sangue Assinaturas Distinguir Pulmonar Tuberculose Pulmonar sarcoidose, pneumonias e cancros do pulmão. PLoS ONE 8 (8): e70630. doi: 10.1371 /journal.pone.0070630

editor: Jyothi Rengarajan, Faculdade de Medicina da Universidade de Emory, Estados Unidos da América

Recebido: 23 Março, 2013; Aceito: 20 de junho de 2013; Publicação: 05 de agosto de 2013

Direitos de autor: © 2013 Bloom et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. AOG, CMG, PSR, Medical Research Council (U117565642), FR Consumíveis, Institute Merieux, SILA, CIB suportado pelo Conselho de Pesquisa Médica Clínica Research Training Fellowship; RJW KAW, MRC U1175.02.002.00014.01, Wellcome Trust 084.323 e 088.316, EDCTP (IP.07.32080.0002) e União Europeia (FP7 IRSES295214). Recrutamento de pacientes: Paris (DV, GG, MM e DB) com o apoio de uma subvenção de AP-HP (PHRC AOR-09-085); Lyon, Lyon rede (ações Incitatives Hospices Civils de Lyon). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:. Co-autor Robert Wilkinson é PLOS ONE membro do Conselho Editorial no entanto isso não altera o a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento. Caso contrário, todos os outros autores declararam que não existem interesses conflitantes.

Introdução

Cerca de nove milhões de novos casos de tuberculose (TB) ativa, e 1,4 milhões de mortes por TB, estima-se que ocorrem globalmente a cada ano [1]. Somente o diagnóstico precoce é fundamental para evitar o atraso do tratamento, portanto, a capacidade de discriminar TB de outras condições pulmonares que podem apresentar de forma semelhante a TB, como a sarcoidose, ou ter uma aguda (pneumonia adquirida na comunidade) ou (câncer de pulmão primário) apresentação crónica é importante.

TB e sarcoidose são as doenças multissistêmicas generalizados que preferencialmente envolvem o pulmão e, muitas vezes presente em uma forma clínica, radiológica e histológica similar. Que distinguem estas doenças, por conseguinte, pode exigir uma biópsia invasiva. formação de granulomas é fundamental para ambas as condições e, embora o agente patogénico

Mycobacterium tuberculosis

é reconhecida como a causa etiológica da tuberculose, sarcoidose que está subjacente é desconhecido [2]. As vias envolvidas na inflamação granulomatosa também são mal compreendidos e há pouca compreensão das diferenças de doenças específicas. TB e sarcoidose também pode exibir uma apresentação semelhante à grave doenças infecciosas pulmonares como pneumonia adquirida na comunidade e doenças pulmonares crônicas, como câncer de pulmão primário.

Dada a complexidade dessas doenças uma abordagem de biologia de sistemas pode ajudar a desvendar o principal resposta imune do hospedeiro. O sangue periférico tem a capacidade de reflectir as alterações patológicas e imunológicos em outras partes do corpo, e a identificação de alterações doença associada pode ser determinada por uma assinatura sangue transcricional [3]. Em apoio a este conceito, demonstramos recentemente um interferon (IFN) assinatura de sangue -inducible em pacientes com tuberculose pulmonar a partir de Londres e [4] África do Sul, que já foi validado em três estudos independentes em África [5], [6] e na Indonésia [7]. Sangue expressão do gene de perfil também tem sido aplicado com êxito a outras desordens inflamatórias e infecciosas, tais como o lúpus eritematoso sistémico (LES), para ajudar a compreender os mecanismos da doença e melhorar o diagnóstico e tratamento de [3]. Dois estudos recentes têm utilizado sangue de perfil transcricional de comparação de TB pulmonar e sarcoidose; ambos os estudos encontraram as doenças tiveram respostas transcrição semelhantes, que envolveram a superexpressão de genes IFN-inducible [8], [9]. No entanto, estes estudos não analisou outras doenças pulmonares semelhantes levantando a questão de saber se estas assinaturas de transcrição também refletiu outras doenças pulmonares.

O principal objetivo do nosso estudo foi o de melhorar a nossa compreensão da imunopatogênese subjacente sarcoidose e tuberculose, comparando as respostas de transcrição no sangue em pacientes com tuberculose pulmonar ao encontrado em pacientes com sarcoidose, pneumonia e câncer de pulmão pulmonar. Também compararam as respostas de transcrição de sangue antes e após o tratamento em cada doença, e examinou as respostas transcrição visto nas diferentes populações de leucócitos das doenças granulomatosas. Além disso, investigamos a associação na sarcoidose entre a atividade clínica e a heterogeneidade da transcrição de sangue observado.

Métodos

Estudo da População e critérios de inclusão

A maioria dos pacientes com TB foram recrutados do Royal Free Hospital NHS Foundation Trust, em Londres. Os pacientes com sarcoidose foram recrutados da Royal Free Hospital NHS Foundation Trust, de St Mary Hospital Imperial College NHS Trust, Barnet e Chase Farm NHS Trust, em Londres, a sarcoidose Clinic Oxford, Hospital Churchill, em Oxford, e no Hospital Avicena em Paris. Os pacientes com pneumonia foram recrutados da Royal Free Hospital, em Londres. Os pacientes com câncer de pulmão e 5 dos pacientes com TB no conjunto de teste foram recrutados pelo Lyon Rede Colaborativa, França. Todos os pacientes foram recrutados consecutivamente ao longo do tempo de tal modo que O conjunto de treino foi recrutado primeiro seguido pelo conjunto de teste, e por fim, validação Conjunto de amostras dos pacientes que foram usadas para a purificação de células. dados de expressão de genes de sangue adicional foram obtidos de pacientes com tuberculose pulmonar e latente recrutados e analisados ​​em nosso estudo anterior que foram então re-analisado neste estudo comparando as respostas antes e após o tratamento da tuberculose [10].

Os critérios de inclusão eram específicas para cada uma das doenças. pacientes com tuberculose pulmonar: cultura confirmada

Mycobacterium tuberculosis

em qualquer escarro ou lavado bronco-alveolar; sarcoidose pulmonar: diagnóstico feito por um especialista sarcoidose, granuloma de na biópsia, achados clínicos e radiológicos compatíveis (no prazo de 6 meses de recrutamento) de acordo com as diretrizes WASOG [11]; adquirida na comunidade pacientes com pneumonia: preenchidas as diretrizes British Thoracic Society para o diagnóstico [12]; pacientes com câncer de pulmão: diagnóstico por um especialista em cancro do pulmão, as características histológicas e radiológicas consistentes com câncer de pulmão primário; controles saudáveis: o seu sexo, etnia e idade foram semelhantes aos pacientes, QuantiFERON®-TB negativo ouro em-tubo (QFT) (Cellestis) de teste. Os critérios de exclusão para todos os pacientes e controles saudáveis ​​incluídas outra história médica significativa (incluindo qualquer imunossupressão, como a infecção pelo HIV), com idade inferior a 18 anos ou grávida. Os pacientes foram recrutados entre setembro de 2009 e março de 2012. Os pacientes foram recrutados antes de iniciar o tratamento, salvo indicação contrária.

Ética Declaração

Este estudo foi aprovado pelo Comitê Central London 3 de Ética em Pesquisa (09 /H0716 /41) e CPP Sud-Est IV, França, CCPPRB, Pitié-Salpêtrière, em Paris. Todos os participantes assinaram termo de consentimento.

IFNy Ensaio de Libertação de Teste

O QFT Assay (Cellestis) foi realizada de acordo com as instruções do fabricante.

Gene Expression Profiling

3 ml de sangue total foram coletadas em tubos Tempus (Applied Biosystems /Ambion) por flebotomia padrão, vigorosamente misturados imediatamente após a colheita e armazenados entre -20 e -80 ° C antes da extração de RNA. O ARN foi isolado utilizando sangue total de 1,5 ml de sangue e o ARN kit de isolamento Magmax-96 (Applied Biosystems /Ambion) de acordo com as instruções do fabricante. 250 ug de ARN total isolado foi reduzida globina utilizando o kit GLOBINclear 96 poços formato (Applied Biosystems /Ambion) de acordo com as instruções do fabricante. total integridade e reduziu-globina ARN foi avaliada usando um Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies). rendimento de ARN foi avaliada utilizando um espectrofotómetro NanoDrop8000 (NanoDrop produtos, Thermo Fisher Scientific). Biotinilado, amplificado anti-sentido de ARN complementar (ARNc) alvos foram então preparado a partir do ARN 200-250ng reduzida-globina utilizando o estojo de amplificação de ARN Ilumina CustomPrep (Applied Biosystems /Ambion). 750 ng de ARNc marcado foi hibridada durante a noite para Ilumina Humano HT-12 V4 matrizes BeadChip (Ilumina), que continha mais de 47.000 sondas. As matrizes foram lavadas, bloqueadas, coradas e digitalizados num Ilumina iScan, de acordo com as instruções do fabricante. GenomeStudio (Illumina) foi então usado para realizar o controle de qualidade e gerar valores de intensidade de sinal.

Purificação celular e Processamento de RNA para Microarray

O sangue total foi coletado em heparina sódica. As células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram separadas a partir dos granulócitos /eritrócitos utilizando um gradiente de densidade de Lymphoprep ™ (Axis-Shield). Os monócitos (CD14 +), células T CD4 + (células CD4 +) e células T CD8 + (CD8 +) foram isoladas sequencialmente a partir das CMSPs utilizando (MACS) grânulos de sangue completo juntamente com anticorpo magnéticas (Miltenyi Biotec, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. Os neutrófilos foram isolados a partir da camada de granulócitos /eritrócitos após a lise das células vermelhas do sangue, seguido por MACS CD15 + grânulos (Miltenyi Biotec, Alemanha). O ARN foi extraído a partir de sangue completo (5 ‘prime PerfectPure Kit) ou populações de células separadas (Qiagen RNeasy Mini Kit). integridade de ARN total e o rendimento foi avaliada tal como descrito acima. Biotinilado, amplificado anti-sentido de ARN complementar (ARNc) alvos foram então preparadas a partir de 50 ng de ARN total utilizando os NuGEN WT-ARN Ovation ™ amplificação e Encore Módulo BiotinIL (NuGen Technologies, Inc). ARN amplificado foi purificado utilizando o kit de purificação de PCR da Qiagen MinElute (Qiagen, Alemanha). cRNA foi então tratada como descrito acima.

processamento de dados brutos

Os dados brutos foram processados ​​usando GeneSpring GX versão 11.5 (Agilent Technologies) e a seguir foi aplicado a todas as análises. Após a subtracção de fundo cada sonda foi atribuída uma bandeira para indicar a sua detecção intensidade do sinal

p

-valor. Bandeiras foram usadas para filtrar conjuntos de sondas que não resultaram em um “presente” pôr em pelo menos 10% das amostras, onde o “presente” corte inferior off = 0,99. Os valores de sinal foram, então, definido como um limiar de 10, LOG2 transformado, e per-chip normalizados utilizando 75

th algoritmo de deslocamento percentil. Próximo normalização por-gene foi aplicado pela divisão de cada transcrito de ARN mensageiro pela intensidade mediana de todas as amostras. Todas as análises estatísticas foram realizadas após esta fase. dados de microarray bruto foi depositado com GEO (número de acesso GSE42834). Todos os dados coletados e analisados ​​nos experimentos aderir ao mínimo de informações sobre um experimento Microarray (Miame) orientações.

Análise de Dados

GeneSpring 11.5 foi usado para selecionar transcrições que apresentaram variabilidade de expressão da mediana de todos os transcritos de análise (sem vigilância). Um filtro foi definido para incluir apenas transcrições que tinham pelo menos alterações duplas da mediana e presente em ≥10% das amostras. análise sem supervisão foi utilizado para obter os 3422-transcrições. A aplicação de um filtro de estatística não-paramétrica (teste de Kruskal Wallis com um FDR (Benjamini Hochberg) = 0,01), após a análise sem supervisão, gerado as assinaturas 1446-transcrição e 1396-transcrição. As duas assinaturas diferiu apenas no qual os grupos filtro estatístico foi realizado através; 1446, cinco grupos (TB, sarcoidose, pneumonia, câncer de pulmão e controles) e 1396, seis grupos (TB, sarcoidose ativa, sarcoidose, pneumonia, câncer de pulmão não-ativa e controles).

genes diferencialmente expressos para cada doença foram obtidos comparando cada doença a um conjunto de controles pareados por etnia e gênero dentro de uma diferença de 10%. GeneSpring 11,5 foi usado para seleccionar as transcrições que foram ≥1.5 dobra diferente em expressão a partir da média dos controlos e estatisticamente significativa (desemparelhado de Mann Whitney FDR (Benjamini Hochberg) = 0,01). Comparação Engenho Pathway Analysis (IPA) (Engenho Systems, Inc., Redwood, CA) foi utilizado para determinar as vias canónicas mais significativos associados com os genes expressos diferencialmente de cada parente doença às outras doenças (FDR exacto de Fisher (Benjamini Hochberg) = 0,05). A parte inferior do eixo x e as barras de cada gráfico IPA comparação indicou o log (p-valor) e o eixo X-topo e linha indicada a percentagem de genes presentes na via.

distância molecular para a saúde (MDTH ) foi determinada como descrito anteriormente [13], e em seguida, aplicado a diferentes assinaturas de transcrição. análise modular transcricional foi aplicado como previamente descrito [14]. Os níveis de expressão de matérias de todas as transcrições significativamente detectados da hibridação de fundo foram comparados entre cada amostra e todos os controles presentes nesse conjunto de dados. A percentagem de genes expressos significativamente em cada módulo foram representados pela intensidade da cor (teste t de Student,

P

0,05), o vermelho indica a sobre-expressão e azul indica subexpressão. A percentagem média de genes significativos e a mudança de dobragem média destes genes em comparação com os controlos nos módulos especificados foram também mostrado na forma de gráfico. MDTH e análise modular foram calculados no Microsoft Excel 2010. GraphPad Prism Versão 5 para Windows foi utilizado para gerar os gráficos.

genes diferencialmente expressos entre os pacientes de TB e Formação Conjunto de pacientes com sarcoidose activas foram derivados utilizando análise da significância dos microarrays (SAM) (

q Art 0,05) e ≥1.5 dobrar mudança expressão [15]. SAM foi usada devido ao aumento da sensibilidade deste teste não-paramétrico de comparação de Mann-Whitney para permitir que transcritos mais diferencialmente expressos a ser identificada entre TB e sarcoidose activa. previsão classe foi realizada dentro GeneSpring 11,5 usando as máquinas de suporte algoritmo vetor aprendeu máquina (SVM). O modelo foi construído utilizando classificadores de amostra ‘TB’ ou ‘não TB’. O modelo SVM deve ser construída em coorte um estudo e de execução em um coorte independente para evitar o excesso de montagem da assinatura preditiva. Isso foi possível por todos os grupos do nosso estudo. Onde os grupos de estudo utilizada uma plataforma de microarray diferente do modelo SVM teve que ser re-construída nesse grupo. Para reduzir os efeitos da sobre-ajustamento dos mesmos parâmetros SVM foram sempre utilizados. O tipo de kernel utilizado foi, iterações lineares máximas 100.000, custou 100, relação de 1 e N-fold tipo de validação em que n = 3 com 10 repetições. A curva de funcionamento do receptor (ROC) e área sob a curva (AUC) foram calculados usando o Microsoft Excel 2010.

univariada e análise de regressão multivariada foram calculados usando STATA 9 (StataCorp 2005. Stata Statistical Software: Release 9. Colégio Station, TX; StataCorp LP). Na análise de regressão multivariada onde havia falta de pontos de dados (ACE soro e atividade da doença TCAR) para evitar a exclusão lista-wise manequim foi utilizado ajuste variável.

Os cálculos de energia foram realizados utilizando a Análise de Energia e Software Tamanho da Amostra (PASS) 2008.

Resultados

sangue transcricionais Profiles são semelhantes nas doenças pulmonares granulomatosa TB e sarcoidose mas distinto de pneumonia e câncer de pulmão

coortes de TB e sarcoidose , adquirida na comunidade pacientes com pneumonia e câncer de pulmão, e controles saudáveis ​​são apresentados na Tabela 1 e Figuras S1-S3, e devidamente correspondidas demograficamente e clinicamente (Tabelas S1-2). O poder do estudo foi calculado para um conjunto de treinamento (desvio padrão = 0,4, 3.000 sondas verdadeiramente diferencialmente expressos, dobre mudança de ≥1.5, dois t-test amostra com FDR de 0,05). Oito a 40 pacientes por grupo fornece uma potência superior a 0,85 para cada sonda (calculada com base PASS 2008) com benefício mínimo de aumentar o tamanho da amostra.

análise imparcial demonstrado que a TB e sarcoidose transcrição de sangue perfis agrupados, mas distintamente de pneumonia e câncer, que se agrupavam (Set Formação; 3422 transcrições, Figura S4A). filtragem estatística gerada 1446 transcritos diferencialmente expressos (conjunto de treinamento, Figura S4B). Este padrão de agrupamento foi verificada em uma coorte independente (conjunto de teste, a Figura 1), e não foi influenciada pela etnia ou sexo (dados não mostrados). Pathway Analysis (IPA) revelou que as amostras de TB e sarcoidose foram associadas a abundância excessiva de interferon (IFN) e as vias de sinalização de resposta do sistema imunológico (Figura 2). amostras de pneumonia e câncer de pulmão foram associados com excesso de abundância de vias relacionadas com a inflamação. Todas as doenças mostrou uma sub-abundância de caminhos de células T e B.

1446-transcrições foram diferencialmente expressos em todo o sangue do conjunto de treinamento controles saudáveis, pacientes com tuberculose pulmonar, pacientes com sarcoidose pulmonar, pacientes com pneumonia e câncer de pulmão pacientes. O agrupamento dos 1446-transcrições foram testados em uma coorte independente a partir do qual eles não foram obtidas a partir, o conjunto de teste. O mapa de calor mostra as transcrições e perfis ‘Test Set pacientes tão organizado pelo algoritmo imparcial de agrupamento hierárquico não supervisionado. A linha ponteada é adicionada para o mapa de calor para ajudar a visualização das principais agrupamentos gerados pelo algoritmo de agrupamento. Transcrição valores de intensidade são normalizados para a média de todas as transcrições. transcrições vermelhas são transcrições relativamente sobre-abundante e azul sub-abundante. A barra colorida na parte inferior da heatmap indica a que grupo pertence o perfil.

Cada um dos três grupos dominantes de transcrições está associada a diferentes grupos de estudo no conjunto de treinamento. O cluster transcrição superior é mais abundante nos pacientes com pneumonia e câncer e significativamente associada com vias IPA relacionados com a inflamação (exato de Fisher com Benjamini Hochberg FDR = 0,05). O cluster transcrição do meio é mais abundante nos pacientes com TB e sarcoidose e significativamente associada com a sinalização do IFN e outros percursos IPA de resposta imunológica (exato de Fisher com Benjamini Hochberg FDR = 0,05). O cluster transcrição inferior é sub-abundante em todos os pacientes e significativamente associada com as vias do IPA de células T e B (exato de Fisher Benjamini Hochberg FDR = 0,05).

A heterogeneidade dos perfis de transcrição na sarcoidose pacientes se correlaciona com clínicos Fenótipo

perfis de transcrição do pacientes com sarcoidose cluster ou com pacientes com TB ou com controles saudáveis ​​(1446 transcrições, Figura 1). Os pacientes foram então avaliados quanto à actividade da doença (marcado como activo ou não-activo), por uma árvore de decisão de pré-definida de um composto de parâmetros clínicos reflectindo um perfil instantâneo da actividade da doença em que o tempo-ponto (Figura S5; Tabela S3). 1396-transcrições foram encontrados para ser diferencialmente expressos utilizando esta classificação sarcoidose. pacientes Novamente ativos sarcoidose agruparam com os pacientes com TB, enquanto os pacientes com sarcoidose não activos agrupados com os controles (1396 transcrições, Figura 3A). Este foi validado no teste de coortes independente e Validação Define (Figura S6A B; Tabela S4A, S4B).

1396-transcrições são diferencialmente expressos em todo o sangue do conjunto de treinamento depois de aplicar a análise em seis grupos para incluir os dois fenótipos de pacientes com sarcoidose. (A) As transcrições de 1396 e perfis de conjunto de treinamento pacientes são organizados por agrupamento hierárquico não supervisionado. A linha ponteada é adicionada para o mapa de calor para esclarecer os principais agrupamentos gerados pelo algoritmo de agrupamento. Transcrição valores de intensidade são normalizados para a média de todas as transcrições. (B) distância molecular para a saúde dos transcritos de 1396 nos conjuntos de treino e de teste demonstra a quantificação da alteração da transcrição em relação aos controlos. A média, SEM e

p

valores são exibidos (ANOVA com o teste de comparação múltipla de Tukey).

Aplicação da distância Molecular para a saúde (MDTH) algoritmo [13] a todos os grupos de doenças mostrou que a pontuação sarcoidose MDTH não activo não foi quantitativamente significativamente diferente dos controles, enquanto a pontuação sarcoidose MDTH ativa foi (Figura 3B). As pontuações de tuberculose foram significativamente maiores que os escores sarcoidose ativos, e as pontuações pneumonia foram significativamente maiores que os escores de câncer de pulmão, com pneumonia e TB ter as maiores pontuações MDTH. Coletivamente, este sugere uma quantitativa, bem como diferença qualitativa nas assinaturas de transcrição de sangue.

Três Data Mining Estratégias Mostrar que a tuberculose e sarcoidose ativa são dominados por genes IFN-induzíveis, Considerando Pneumonia e câncer de pulmão são dominados por genes inflamatórios

Nós investigamos ainda mais os caminhos biológicos associados a cada grupo de doença, por meio de análise modular, [14] genes, IPA, e anotação de topo diferencialmente expressos para cada grupo de doença. Análise Modular, que leva em conta todos os genes diferencialmente expressos contra controles, verificou-se que a TB e sarcoidose ativa mostrou superexpressão significativa dos módulos IFN comparação com os outros grupos de doenças pulmonares (Figura 4A; conjunto de treinamento; Figura S7, Test Set), enquanto pneumonia e doentes com cancro mostraram sobreexpressão significativa dos módulos de inflamação (Figura 2). pacientes com tuberculose mostraram um aumento quantitativo significativo no número de genes de IFN-indutível e o seu grau de expressão, em comparação com os pacientes com sarcoidose activos (Figuras 4B, 4C). Pneumonia e cancro do pulmão mostraram um aumento significativo no número de genes presentes nos módulos de inflamação e o seu grau de expressão, em comparação com tuberculose activa e sarcoidose (Figuras 4D, 4E). pacientes com pneumonia mostraram um aumento do número de genes presentes no módulo de neutrófilos (Figura S8), correlacionando-se com contagem de neutrófilos no sangue (correlação de Spearman, r = 0,42,

p Art 0,0001).

( a) os níveis de expressão gênica de todas as transcrições que foram significativamente detectados em comparação com a hibridação de fundo (15212 transcrições,

p Art 0,01) foram comparados no conjunto de treinamento entre cada grupo de pacientes: a tuberculose, sarcoidose ativa, não-ativo sarcoidose, pneumonia, cancro do pulmão, para os controlos saudáveis. Cada módulo corresponde a um conjunto de genes co-regulados que foram atribuídas funções biológicas pelo perfil literatura imparcial. Um ponto vermelho indica significativa sobre-abundância de transcrições e um ponto azul indica significativa sub-abundância (p 0,05). A intensidade da cor está correlacionada com a percentagem de genes em que o módulo que são significativamente expressas diferencialmente. A análise modular também pode ser representado graficamente como mostrado em (B) – (E), incluindo amostras tanto o treinamento e conjunto de teste. A média, SEM e

p

valores são exibidos (ANOVA com o teste de comparação múltipla de Tukey). (B) A percentagem de genes sobre-expressos de forma significativa nos 3 IFN módulos de cada doença. (C) A mudança de dobragem da expressão dos genes presentes nos módulos de IFN, em comparação com os controlos. (D) A percentagem de genes sobre-expressos de forma significativa nos 5 módulos de inflamação para cada doença. (E) A mudança de dobragem da expressão dos genes presentes nos módulos de inflamação em comparação com os controlos.

Comparação IPA utilizando genes que foram diferencialmente expressos entre cada grupo de doença e um conjunto combinado de controlos , revelou os caminhos mais significativos quando comparados através das doenças (≥1.5 mudança vezes a partir dos controles, Mann Whitney Benjamini Hochberg

p Art 0,01; TB = 2524, sarcoidose ativa = 1391, pneumonia = 2,801 e câncer de pulmão = 1626 transcrições). Os quatro principais vias significativas estavam relacionados com a síntese de proteínas (eIF2 sinalização), a resposta imunitária, a sinalização de IFN, receptores de reconhecimento de padrão de reconhecimento de bactérias e vírus, e a apresentação de antigénios (Figura 5A e Tabela S11). Sub-abundância da via de sinalização eIF2 foi impulsionado pelos pacientes com pneumonia. Outros genes relacionados à síntese de proteínas (proteínas ribossomais e outros fatores de iniciação eucarióticos) ea resposta proteína desdobrado (a resposta ao estresse para a síntese de proteínas em excesso), também foram significativamente sub-abundante nos pacientes com pneumonia, por exemplo, Perk, CHOP, ABCE1 (dados não mostrados). A significância estatística (inferior eixo x, gráfico de barras, a Figura 5A) e a percentagem de genes (início x-eixo, o gráfico de linha, Figura 5A) das três vias de resposta imunes foram conduzidos predominantemente pelos pacientes com TB e sarcoidose activa, demonstrando novamente a semelhança das vias biológicas subjacentes a estas doenças. No entanto a via de sinalização de IFN foi mais significativa (Figura 5A) e continha um número maior de genes do que na TB activa sarcoidose (Figura 5B).

genes diferencialmente expressos foram derivados a partir do conjunto de treino por comparação de cada doença para controles saudáveis ​​pareados por etnia e gênero: TB = 2524, sarcoidose ativa = 1391, o câncer pneumonia = 2,801 e pulmão = 1626 transcrições (≥1.5 mudança vezes a partir da média dos controles, Mann Whitney com Benjamini Hochberg FDR = 0,01). (A) IPA vias canónicos foi usada para determinar as vias mais significativos (I-IV) associados a cada doença em relação a outras doenças (exacto de Fisher com Benjamini Hochberg FDR = 0,05). O eixo x e barras de cada gráfico inferior indica o log (valor-p) e o eixo x-top e linha indica a percentagem de genes presentes na via. Os genes na via de sinalização de eIF2 são predominantemente sob abundante genes no entanto, os genes nos outros três vias são predominantemente sobre-abundante em relação aos controlos. Vias acima a linha a tracejado são azul significativa (p 0,05). (B) A via de sinalização de IFN do IPA é colocado sobre cada grupo de doenças. genes coloridos são diferencialmente expressos nesse grupo doença em comparação com os seus controles pareados (exata FDR de Fisher = 0,05). genes vermelhas representam excesso de abundância e verde sub-abundância. A via para a TB é mostrada ampliada de modo que o detalhe dos genes pode ser visto, ele também é mostrada novamente em muito menor escala, além das outras doenças de modo que uma comparação visual pode ser mais facilmente feitas.

os 50 melhores transcrições superabundante diferencialmente expressos para cada doença correlacionada com os resultados da análise modular e IPA onde a tuberculose e sarcoidose ativa foram dominados pela genes IFN-induzíveis por exemplo, IFITM3, IFIT3, GBP1, GBP6, CXCL10, OAS1, STAT1, IFI44L, FCGR1B (Tabela S5). Mais uma vez estes eram em maior número no TB de sarcoidose. O top 50 sobre-abundância transcrições de pneumonia foram dominados pela genes relacionados com neutrófilos antimicrobianos por exemplo Elane, DEFA1B, MMP8, CAMP, DEFA3, DEFA4, MPO, LTF. Os genes FCGR1A, B e C foram mais abundantes no top 50 transcrições de todas as quatro doenças pulmonares. Um diagrama de Venn 4-conjunto de genes diferencialmente expressos demonstrado genes exclusivos para cada grupo de doença (Figura S9 e Tabela S6), com mais de três vezes o número de genes TB original do que genes sarcoidose ativos únicos. Os genes únicos TB composta genes respostas imunológicas significativamente associada com a via de sinalização de IFN e apresentação de antígenos. Os genes pneumonia únicas foram associados com uma sub-abundância de vias relacionadas com a síntese de proteínas. Os genes exclusivos do cancro do pulmão foram associados com excesso de abundância de percursos de inflamação relacionadas e sub-abundância de caminhos de células T. Sobreposição de genes comuns a todos os quatro grupos de doenças foram significativamente associados com sub-abundância de caminhos de células T e B.

TB e pneumonia pacientes após o tratamento mostraram uma diminuição de Perfis de transcrição Considerando Sarcoidosis pacientes que respondem ao glicocorticóides mostraram um aumento significativo na transcrição Atividade

a seguir, examinou a resposta transcricional ao tratamento. pacientes com pneumonia, acompanhados pelo menos 6 semanas após a sua alta hospitalar, mostrou uma boa resposta clínica ao tratamento padrão com antibióticos (Tabela S7A) e uma diminuição em seus perfis de transcrição ao nível dos controlos por análise modular (todas as transcrições detectáveis) e MDTH (1446-transcrições) (Figura 6a 6B). O MDTH dos 1446-transcritos derivados no presente estudo de diferentes doenças pulmonares, também foi diminuída no sangue de pacientes com TB Sul-Africano após a conclusão do tratamento, revertendo para a assinatura de controles de tuberculose latente (Figura 6C) e apoiar o nosso relatório anterior [10].

(A) análise Modular.