Abstract

O câncer cervical é um dos cancros mais comuns em mulheres em todo o mundo, sendo o grupo de alto risco do HPV infectado, o fator etiológico líder. A proteína inibidora da quinase raf (RKIP) foi associada com a progressão de tumores e metástases em várias neoplasias humanas, no entanto o seu papel no cancro do colo do útero está claro. No presente estudo, 259 tecidos no colo do útero, incluindo cervicite, lesões intra-epiteliais cervicais e carcinomas, foram analisadas quanto à expressão RKIP por imuno-histoquímica. Descobrimos que a expressão RKIP diminuiu significativamente durante a progressão maligna, sendo altamente expresso em tecidos não-neoplásicas (54% das amostras; 73/135), e expressos em níveis baixos em carcinomas invasivos do colo do útero (~ 15% (19/124 ). a seguir

in vitro

downregulation de RKIP, observou-se uma viabilidade e vantagem proliferativa das células inibidas-RKIP ao longo do tempo, o que foi associado com uma distribuição do ciclo celular alterada e maior número de colónias num ensaio de formação de colónia. um

in vitro

ferida ensaio de cura mostrou que RKIP revogação está associada com maior capacidade migratória. downregulation RKIP também foi associada a um aumento da vascularização dos tumores

in vivo

usando um ensaio CAM. Além disso, RKIP inibição induzida células cancerosas cervicais resistência apoptótica para o tratamento com cisplatina. em conclusão, nós descrito que a proteína RKIP é significativamente empobrecido durante a progressão maligna dos tumores cervicais. Apesar da falta de associação com a evolução clínica do paciente, demonstramos,

in vitro

e

in vivo

, que a perda de expressão RKIP pode ser um dos fatores que estão por trás da agressividade, progressão maligna e resistência à quimioterapia de câncer cervical

Citation:. Martinho o, Pinto F , Granja S, Miranda-Gonçalves V, Moreira MAR, Ribeiro LFJ, et al. (2013) RKIP Inibição em Câncer do colo do útero está associado a maior comportamento agressivo do tumor e resistência à terapia com cisplatina. PLoS ONE 8 (3): e59104. doi: 10.1371 /journal.pone.0059104

editor: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesú, Itália |

Recebido: 23 de novembro de 2012; Aceito: 11 de fevereiro de 2013; Publicação: 19 de março de 2013

Direitos de autor: © 2013 Martinho et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi parcialmente financiado pela Fundação para Português a Ciência ea Tecnologia (conceder PTDC /SAU-TOX /114549/2009). Olga Martinho e Sara Granja eram beneficiários de bolsas de doutoramento (SFRH /BD /36463/2007 e SFRH /BD /51062/2010, respectivamente), e Filipe Pinto e Vera Miranda-Gonçalves eram beneficiários de bolsas de investigação (UMINHO /BI /016 /2011 e SFRH /BI /33503/2008, respectivamente), ambos da FCT, Portugal. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Sem financiamento externo adicional recebida para este estudo

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O câncer cervical é o terceiro câncer mais comumente diagnosticado. e a quarta principal causa de morte por câncer em mulheres em todo o mundo, respondendo por 9% (529,800) do total de novos casos de câncer e 8% (275,100) das mortes totais de câncer entre as mulheres em 2008 [1]. A infecção persistente com tipos de alto risco do vírus do papiloma humano (HPV) é um

sine-qua-non condição Compra de desenvolvimento do câncer cervical. Os HPVs infectam células epiteliais e causar uma variedade de lesões que vão desde as verrugas comuns e a neoplasia cervical, cancro [2] – [4]. Os tumores do colo do útero são divididos em três diferentes subtipos histológicos: uterinos carcinomas de células escamosas (SCC) é a mais frequente, seguido pelo adenocarcinoma (AC) e carcinoma adeno (ASC), que é um subtipo raro [5]. infecção pelo HPV por si só não é suficiente para desencadear câncer cervical e oncogênese mediada por HPV também exige a acumulação de alterações genéticas adicionais que ocorrem ao longo do tempo após a infecção inicial [6]. Pode levar vários anos para que um

in situ

neoplasia de progredir para um carcinoma invasivo. O mecanismo de evolução clonal, que envolve a selecção de células com potencial invasivo ou metastático, também permanece sem solução

proteína inibidora de quinase

Raf (RKIP; também conhecido como PEBP1, para protein1 de ligação a fosfatidiletanolamina)., Como indicado pela o nome, foi identificado pela primeira vez como o inibidor endógeno da via RAF /MEK /ERK, inibir a activação de Raf-1 [7] – [9]. Na verdade, RKIP tem sido implicada em diversas vias de sinalização intracelulares que controlam o crescimento celular [10], [11], motilidade [12], [13], epitelial para mesenquimal (EMT) [14] e diferenciação [15]. RKIP é largamente expressa em tecidos humanos normais, com destaque para o seu papel em vários processos fisiológicos [16], mas é considerado como um supressor de metástase do cancro [17], sendo a sua perda ou expressão reduzida associada com doença maligna e o prognóstico em muitos tipos de metastático e cancros agressivos [10], [11], [18] – [34]

um estudo anterior, realizado em uma pequena fracção dos pacientes, determinada por análise de microarray expressão que RKIP é um dos genes que. é diferencialmente expressos entre amostras tumorais de pacientes com câncer cervical com ou sem metástase ganglionar [35]. Mais recentemente, verificou-se em uma grande série de pacientes que a proteína RKIP é significativamente regulada negativamente no cancro do colo do útero e metástase ganglionar [36]. Além disso, outro estudo com células de câncer cervical HeLa mostrou que RKIP, através da regulação da via ERK, tem um papel importante na regulação do checkpoint mitótico [37]. Assim, as descobertas anteriores, levou-nos a elucidar a função biológica de RKIP no cancro do colo do útero e progressão maligna de resposta à quimioterapia. Portanto, primeiro avaliou os níveis de expressão de proteína RKIP em ambas as amostras cervicais não-malignas e tumorais, e avaliou o seu papel na evolução clínica de pacientes com câncer cervical. Em segundo lugar, avaliamos

in vitro

e

in vivo

a função biológica do downregulation RKIP na malignidade do câncer do colo do útero e de resposta à quimioterapia.

Materiais e Métodos

as amostras de tecido

Para o presente trabalho, 259 tecidos cervicais foram analisadas, que incluiu 45 cervicite, 47 lesões intra-epiteliais escamosas de baixo grau (LSIL), 43 lesões intra-epiteliais de alto grau (HSIL), 70 carcinomas de células escamosas (SCC), 41 adenocarcinomas (AC) e 13 carcinoma adenoescamoso (ASC) (Tabela 1). As amostras de parafina contendo as lesões não-malignas do colo do útero foram recuperadas dos arquivos da Divisão de Patologia do Instituto Adolfo Lutz de São Paulo, Brasil, e as amostras de tumores cervicais invasivos foram recuperados de Araújo Jorge Hospital e da Escola de Medicina da Universidade Federal de Goiás (Goiânia, Estado de Goiás, Brasil). Todos os diagnósticos histopatológicos foram revistos pelos autores e classificados de acordo com a classificação da OMS. Todos os pacientes com câncer cervical eram do sexo feminino de origem brasileira, com idade média de 49 anos (intervalo 23-74 anos). dados de acompanhamento estava disponível para 72 pacientes e coletados através de entrevista direta com os pacientes ou seus parentes, e pela revisão de prontuários hospitalares. O tempo médio de follow-up (sobrevida global) foi de 35,5 ± 42,0 meses (variação, 2-144 meses).

Todas as amostras inscritas no presente estudo foram desvinculados e não identificada de seus doadores. Devido a natureza retrospectiva do estudo, foi obtida sem consentimento informado por escrito dos pacientes. Os Comitês locais de revisão ética das instituições envolvidas (Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos do Instituto Adolfo Lutz de São Paulo e de Araújo Hospital Jorge da Escola de Medicina da Universidade Federal de Goiás, Brasil) aprovou o trabalho e dispensou a necessidade de consentimento informado por escrito .

linhas celulares

Para o presente estudo foram utilizadas três linhagens celulares de carcinoma do colo do útero: linha de células HeLa, gentilmente cedidas pelo Dr.

a Logarinho Elsa (IBMC, Portugal) [38] , linhas de células SiHa e C-33A, que foram gentilmente cedidas pelo Dr.

a Villa Luisa (INCT-HPV, Brasil) [39]. Todas as linhas de células foram cultivadas e mantidas a 37 ° C e 5% de CO

2 em de Dulbecco modificado por Eagle Médium (DMEM 1 ×, Alto Teor de Glucose; Gibco, Invitrogen) suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS; Gibco, Invitrogen ) e 1% de penicilina /estreptomicina solução (Gibco, Invitrogen) (DMEM-10).

Drugs

A cisplatina (cis-Diammineplatinum (II) dicloreto) foi obtido a partir de Sigma-Aldrich e diluído em NaCl a 0,9% para uma solução stock de 10 mM. A droga foi subsequentemente preparadas diluições como intermediárias para se obter uma quantidade igual de veículo do fármaco (1% de concentração final) em todas as condições estudadas. Em todas as condições experimentais as drogas foram diluídas em 0,5% de meio de cultura FBS (DMEM-0.5).

A imuno-histoquímica e Análise imunocitoquímica de RKIP

lâminas histológicas com 4 secções de tecido mm de espessura foram submetidos a a análise imuno-histoquímica de acordo com o sistema de complexo de estreptavidina-peroxidase de biotina (UltraVision Grande Volume sistema de Detecção de anti-polivalente, HRP; LabVision Corporation), utilizando o anticorpo primário produzido contra RKIP (Millipore, referência 07-137) diluído 1:600, 1H incubação a RT, como previamente descrito [18], [25], [40], [41]

Os cortes foram marcados duplo-cego para a expressão citoplasmática seguindo um critério semi-quantitativa:. (

–

), 0% das células imunorreactivas; (+),

5% das células imunorreactivas; (++), 5-50% das células imunorreactivas; e (+++),

50% das células imunorreactivas. As amostras com pontos (

–

) e (+) foram considerados negativos, e aqueles com pontuações (++) e (+++) foram considerados positivos

Para RKIP análise imunocitoquímica da cervical. linhas celulares de carcinoma, as células foram plaqueadas em lamelas de vidro colocadas em placas de 12 poços, e deixadas a aderir durante a noite. O procedimento imunocitoquímica foi realizada como previamente descrito [41].

Geração de shRKIP expressando estavelmente Linhas Celulares

Para a geração de linhas celulares que expressam estavelmente shRKIP, utilizou-se o vector PQY15, contendo um 19 pb shRNA para RKIP, como descrito anteriormente [37], [41], [42]. A transfecção foi realizada utilizando o reagente de Fugene HD (Roche) como recomendado pelo fabricante, com 2 ug do plasmídeo a uma razão de 6:02 (Reagente: O plasmídeo). As células (2 x 10

5) foram plaqueadas numa placa de 12 poços até 80% de confluência e transf ectadas em meio DMEM, sem FBS ou antibióticos adição, durante 24 horas [41]. Depois disso, os transfectantes estáveis ​​foram seleccionados com 0,5 ug /ml (HeLa) ou 2 ng /ml (C-33a e SiHa) de puromicina em DMEM-10. O vector vazio também foi transfectada como um controlo.

Análise Western Blot

As células foram placa numa placa de 6 poços a uma densidade de 8 x 10

5 células por cavidade e permitiu a aderir pelo menos 24 horas. As células foram privadas de soro durante 6 horas, antes do isolamento de proteínas. Quando necessário, as células foram também estimuladas com 10 ng /mL de EGF por 10 minutos antes do final das 6 horas de inanição. Além disso, para as experiências de cisplatina, as células foram expostas a várias concentrações de cisplatina por um período adicional de 24 horas em DMEM-0,5. As células foram raspadas em PBS frio e lisadas em tampão contendo Tris 50 mM, pH 7,6-8, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, Na3VO4 1 mM, NaF 10 mM, NaPyrophosphate 10 mM, 1% de NP-40 e 1/7 de inibidores de protease cocktail (Roche). Western blot foi efectuada utilizando gel de padrão de 12% de SDS-PAGE, o carregamento de 20 ug de proteína por faixa, com detecção por quimioluminescência aumentada (SuperSignal Oeste Femto máximo de sensibilidade do substrato, Pierce). RKIP expressão foi medido usando um anticorpo específico contra RKIP (diluição 1:2000, Upstate Biotechnology). Activada ERK e EGFR foram avaliados utilizando o anticorpo fosfo-p44 /42 MAPK (Thr202 /Tyr204) e fosfo-EGFR (Y1068) (diluição 1:1000, Cell Signaling Technology). O formulário total de ERK e EGFR também foram avaliadas com os anticorpos p44 /42 MAPK (ERK1 /2) (137F5 clone, diluição 1:1000, Cell Signaling Technology) e EGFR (diluição 1:500, 31G7 clone, Zymed Laboratories). Para a avaliação da apoptose foram utilizados anticorpos contra PARP clivada (clonar Asp214, a diluição 1:1000, Cell Signaling Technology), caspase-9 (clonar Asp330, a diluição 1:1000, Cell Signaling Technology) e PARP (diluição 1:1000, Cell Signaling Technology). Para o controle de carregamento foi utilizado β-tubulina (AA2 clone, diluição 1:5000, Upstate Millipore). Todos os anticorpos primários foram incubados durante uma hora à TA.

Blots detecção foi realizada por quimioluminescência (ECL Western Blotting Detection Reagents, RPN2109, GE Healthcare) em ImageQuant ™ LAS 4000 Mini (GE Healthcare) ou utilizando Hyperfilm X100 ECL (Amersham, GE Healthcare).

a viabilidade celular e a proliferação Ensaios

As células foram plaqueadas em placas de 96 poços em triplicado a uma densidade de 3 × 10

3 células por poço e deixou-se aderir durante a noite em DMEM-10. Após 6 horas de inanição de soro, as células viáveis ​​ou proliferativas foram quantificados usando o ensaio celular Titer96 aquoso a proliferação celular (Promega) ou com a proliferação celular ELISA, BrdU (colorimétrica, Roche Applied Science) e utilizado para o valor do tempo 0. Em seguida, as células foram incubadas em meio DMEM sem soro durante 24, 48 e 72 horas e a viabilidade celular e a proliferação foi novamente avaliada por celular Titer96 aquosa ensaio de proliferação celular e a proliferação celular ELISA, BrdU (colorimétrica), respectivamente. Os resultados foram calibrados para o valor inicial (tempo 0 h, considerada como 100% de viabilidade /proliferação) e expressos como a média ± DP. O ensaio foi feito em triplicado, pelo menos, três vezes.

Para determinar a concentração à qual 50% do crescimento das células é inibido pelo tratamento com cisplatina (IC

50 concentração), as células foram plaqueadas em 96- bem placas a uma densidade de 3 x 10

3-5 × 10

3 células por cavidade e deixadas a aderir durante a noite em DMEM-10. Subsequentemente, as células foram tratadas com concentrações crescentes da droga diluída em DMEM-0,5. Após 48 horas, a viabilidade celular foi quantificada usando ensaio celular Titer96 aquoso a proliferação celular (MTS) (Promega). Os resultados foram expressos como média ± DP de células viáveis ​​relativamente ao veículo do fármaco sozinho (considerado como 100% de viabilidade). A IC

50 concentração foi calculada por análise de regressão não linear, utilizando o software GraphPad Prism.

Cicatrização de Feridas A migração Ensaio

As células foram semeadas em placas de 6 poços e cultivadas a pelo menos 95% de confluência. As células de monocamada foram lavadas com PBS e raspadas com uma ponta de pipeta de 200 uL de plástico e, em seguida, incubadas com meio DMEM fresco sem soro. As zonas «feridos» foram fotografadas por microscopia de contraste de fase em pontos de tempo 12, 24 ou 48 horas. A distância de migração relativa foi calculada pela seguinte fórmula: Percentagem de fecho de feridas (%) = 100 (A-B) /A, onde A é a largura das feridas de células antes da incubação, e B é a largura das feridas de células após incubação [ ,,,0],41]. Os resultados são expressos como a média ± DP. O ensaio foi feito em triplicado, pelo menos, três vezes.

Análise do Ciclo Celular

As células foram plaqueadas numa placa de 6 poços a uma densidade de 2 × 10

5 células por poço e deixou-se aderir durante a noite. Após 6 horas de inanição de soro, as células foram incubadas com meio DMEM fresco sem soro durante 24 horas. As células foram tripsinized e fixadas em etanol a 70%, pelo menos 30 minutos e, em seguida, coradas durante 1 hora a 50 ° C, com um iodeto de propídio solução (PI) (20 ug /ml de PI e 250 ug /mL de RNAse numa solução de 0,1 % de Triton X-100 em PBS). análise do ciclo celular das células coradas PI foi realizada por citometria de fluxo (LSRII, BD Biosciences). A percentagem de células em cada fase do ciclo celular foi determinada com o software FlowJo versão 7.6.3. Os resultados foram expressos como a média ± desvio padrão da percentagem de células em fase G1 ou G2 /M mais fase S [41]. O ensaio foi feito em triplicado, pelo menos, três vezes.

Formação agar mole Colony Ensaio

O ensaio de formação de colónias em ágar mole foi realizado utilizando métodos convencionais, como anteriormente descrito por nós [43]. Em resumo, 1 mL (subcamadas camadas base de ágar) consistindo em meio de agar 0,6% foram preparadas em placas de 6 poços por combinação de volumes iguais de 1,2% de agar Noble, quer com 2 × meio DMEM com FBS a 20%. As células foram tripsinizadas, centrifugadas, e ressuspendido em meio de 0,35% de agar (camada superior de ágar; volumes iguais de 0,7% de agar Noble e 2 × DMEM com FBS a 20%); 2 × 10

3, em seguida, as células foram plaqueadas sobre as camadas base de ágar previamente preparadas. As células foram incubadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 ambiente durante 15 dias e as colónias formadas coradas com 0,05% de violeta de cristal durante 15 minutos. colónias coradas foram fotografadas usando um microscópio estereoscópico (Olympus S2 × 16) e uma câmera digital (Olympus DP71) e contou com imagem J Software. Apenas as colónias com um tamanho maior do que 775 uM

2 (cerca de 31,4 | iM de diâmetro) foram contadas [43]. Os resultados são expressos como a média ± DP. O ensaio foi feito em triplicado, pelo menos, três vezes.

Chick Corioalantóide membrana (CAM) Ensaio

Para avaliar

in vivo

proliferação do tumor e angiogênese foi utilizado o ensaio CAM como descrito anteriormente [41], [43]. ovos de galinha fertilizados foram incubadas a 37 ° C e 70% de humidade, e no dia 3 de desenvolvimento, uma janela foi feito dentro do invólucro, que foi selada com fita adesiva, e os ovos foram devolvidos para a incubadora. No dia 9 do desenvolvimento, anéis de plástico pequenas foram colocadas na CAM e no dia 10 de desenvolvimento 3 × 10

6 células, ressuspenderam-se em 20 ul de meio DMEM, foram injectados nos anéis sobre a CAM. No dia 17 de desenvolvimento, o tumor se formou foi fotografado

in ovo

usando um estereomicroscópio (Olympus S2 × 16), e o perímetro do tumor foi medida utilizando software de células B (Olympus). Os resultados são expressos como a média ± DP.

Finalmente, os ovos de galinha foram sacrificados a -80 ° C durante 10 minutos, e CAM e os tumores foram fixadas com paraformaldeído a 4% e fotografado

ex ovo

para os vasos sanguíneos contagem. Os tumores foram embebidos em parafina e processadas para análise histológica.

Análise Estatística

As correlações entre a expressão RKIP e dados clínicos de doentes foram realizadas utilizando o teste do qui-quadrado (χ2-teste). probabilidades de sobrevivência cumulativos foram calculadas pelo método de Kaplan-Meier. As diferenças entre as taxas de sobrevivência foram testadas com o teste de log-rank. A análise estatística foi realizada utilizando o software SPSS para Windows, versão 17.0. Para

in vitro

e

in vivo

ensaios, comparações simples entre os diferentes condições estudadas foram feitas usando o teste t de Student, e as diferenças entre os grupos foram testadas por meio de análise de duas vias de variância (ANOVA) . A análise estatística foi feita usando Graph Pad Prism versão 5. O nível de significância em toda a análise estatística foi estabelecido em p . 0,05

Resultados

RKIP Expressão em cervical tecidos

uma abordagem imuno-histoquímica foi feito para detectar a expressão da proteína RKIP e distribuição em lesões cervicais (Fig. 1).

a) a expressão positiva em uma cervicite. B) Alto grau de lesão intraepitelial escamosa com expressão negativa. C) que descreve o tecido Adenocarcinoma expressão positiva. D) adenocarcinoma Negative (*) com as células normais adjacentes (seta) que descrevem coloração positiva. Todas as fotos foram tiradas com a 200 × ampliação.

Foi observada expressão positiva citoplasmática de RKIP em 64,5% (29/45) das amostras cervicite, em 44,7% (21/47) de LSIL e 53,5% (23/43) de HSIL (Tabela 1) (Fig. 1A e B). Não foram observadas diferenças significativas nos níveis de expressão de RKIP entre LSIL e HSIL (

p

= 0,404), e também entre cervicite e lesões intraepiteliais escamosas (SIL) em geral (

p

= 0,087 ), Tabela 1). No que diz respeito lesões malignas, RKIP estava presente em níveis baixos, com apenas 19,5% (8/41) dos AC, 12,9% (9/70) dos SCC e 15,4% (2/13) dos ASC descreve coloração positiva (Tabela 1) ( A Fig. 1C e D). Não foram observadas diferenças significativas entre a expressão RKIP nas diferentes lesões malignas estudadas (

p

= 0,643, Tabela 1). No entanto, ao agrupar as lesões benignas (cervicite e SIL) e as lesões malignas (AC, SCC e ASC), foi observada uma diminuição estatisticamente significativa de expressão RKIP em amostras de câncer cervical (

p Art 0,001), quando em comparação com as lesões benignas (Tabela 1)

Não foram encontradas correlações entre a expressão RKIP e características clínicas dos pacientes, tais como idade, presença de metástase e dados de acompanhamento, independentemente do tipo histológico (p 0,05, Tabela 2).

Expression RKIP e Modulação da ERK Pathway em linhas celulares de cancro do colo do útero

para estudar o papel da RKIP no cancro do colo do útero, primeiro rastreados para a expressão RKIP em linhas celulares de cancro cervical humano (HeLa, SiHa e C-33-A) por imunocitoquímica e western blot (Fig. 2). Descobrimos que RKIP é expressa em níveis elevados em todas as linhas celulares, e está presente em ambos citoplasma e núcleo das células (Fig. 2A), como já foi descrito anteriormente [37]. Todas as linhas celulares foram usadas para a expressão de knockdown RKIP por transfecção estável com o vector contendo PQY15 um curto-gancho de cabelo de ARN para RKIP (shRKIP). O vector vazio também foi transfectada como controlo. Os níveis de proteína RKIP nestas células transfectadas estáveis ​​foram determinados por análise de Western blot. Como mostrado na Fig. Os níveis de proteína 2B, RKIP foi inibida eficientemente nas células transfectadas shRKIP quando em comparação com as células transf ectadas de vector vazio.

Uma análise) Imunocitoquímica para RKIP em HeLa, SiHa e células C-33A mostram expressão tanto nuclear e citoplasmática. B) Para a inibição RKIP, as linhas de células foram estavelmente transfectadas com um shRNA para RKIP e com o respectivo vector vazio de controlo. Os níveis de expressão RKIP foram avaliadas por transferência de western. Além disso, as células foram estimuladas com 10 ng /mL de EGF por 10 minutos, e do EGFR e a activação de ERK (fosforilação) foi avaliada por Western blot para fosfo-ERK1 /2 e a expressão de fosfo-EGFR, mas não foram observadas diferenças significativas. E: vazio vector; SH:. ShRKIP

Para explorar o papel do RKIP na modulação da sinalização ERK EGF estimulada no cancro do colo do útero, as células transfectadas foram estimuladas com EGF, e níveis de fosforilação do EGFR e ERK foram avaliadas por western blot . Como pode ser observado na Fig. 2B, a estimulação EGF não resultou em efeitos importantes na activação de sinalização de ERK nestas células, independentemente do estado RKIP.

Papel de RKIP Expressão em linhas celulares de cancro do colo do útero comportamento biológico

Para avaliar se a modulação da expressão RKIP influenciou as propriedades tumorigénicas das células, nós escolhemos a linha de células com mais alto nível de inibição RKIP por shRKIP, HeLa e medidos

in vitro

suas capacidades de viabilidade, proliferação, crescimento independente de ancoragem e migração (Fig. 3). Observou-se que as células transfectadas shRKIP tem uma vantagem significativa da viabilidade ao longo do tempo (Fig. 3A), quando comparado com as células transfectadas com vector vazio (p 0,05). Esta diferença pode ser um reflexo de um número de células aumentada ou pode refletir aumento do metabolismo celular. Para verificar se esta vantagem viabilidade era devido à taxa de proliferação, que estudaram o efeito de RKIP na incorporação de BrdU, a distribuição do ciclo celular e o crescimento independente de ancoragem. O ensaio de BrdU, confirmaram que shRKIP transfectadas células têm uma vantagem proliferativa significativa ao longo do tempo (Fig. 3B). O ensaio de formação de colónia em agar mole demonstraram um aumento significativo (p 0,05) aumento do número de colónias formadas nas células transfectadas shRKIP quando em comparação com as células de controlo (Fig 3C.). Por análise do ciclo de células, observou-se que as células transfectadas shRKIP tinha uma fase G0 /G1 diminuiu com um concomitante e significativa (p 0,05) aumento na fase G2 /M + S (Figura 3D.). Estes resultados foram ainda validado nas outras duas linhas celulares transfectadas, SiHa e C-33A (Fig. S1A-D).

A) a viabilidade celular e B) A proliferação foi medida a 24, 48 e 72 horas por ensaios MTS e BrdU, respectivamente. células inibidas RKIP tinha uma viabilidade estatisticamente significativa e uma vantagem proliferativa ao longo do tempo, quando comparado com células de controlo. C) As células foram ensaiadas quanto à sua capacidade de proliferar em meio de crescimento contendo 0,35% de agar e a formação de colónias multicelulares fotografados com uma ampliação x16 após 14 dias. inibição RKIP induz um crescimento independente de ancoragem estatisticamente significativa de células HeLa em agar mole. D) regulação negativa do RKIP em células HeLa induzida uma mudança na distribuição do ciclo celular com uma maior percentagem estatisticamente significativa de células no G2M + fase S em comparação com células de controlo. análise do ciclo celular foi realizada no ponto de tempo de 24 horas por análise de citometria de fluxo de células coradas iodeto propridium. E) Um zero padronizado (ferida) foi aplicado a monocamadas e imagens digitais foram tomadas em vários pontos de tempo (0, 12, 24 e 48 horas). Observou-se que as células transfectadas shRKIP tinha uma vantagem estatisticamente significativa migração ao longo do tempo, quando comparado com células de controlo (painel direito). Imagens representativas em 0 e 48 horas são apresentados no painel da esquerda. Todas as experiências foram realizadas em triplicado, pelo menos, três vezes. Os dados são representados como a média ± SD e as diferenças com um

p

. 0,05 em ANOVA de duas vias ou teste t de Student foram considerados estatisticamente significativos (*)

Finalmente , para tratar o efeito de RKIP em células HeLa migração, foi realizada a cicatrização de feridas ensaio de migração e observou que as células shRKIP transfectadas teve uma vantagem de migração ao longo do tempo, com um aumento significativo (p 0,05) mais elevada taxa de fecho da ferida, quando comparados com as células de controlo (Fig. 3E). O mesmo foi observado nas outras duas linhas de células transfectadas, SiHa e C-33A (Fig. S1E-F).

In vivo

Papel da RKIP Expressão no crescimento do cancro do colo e Angiogenesis

Para examinar o efeito do crescimento do tumor mediada por angiogénese RKIP e

in vivo

, foi realizado o ensaio de CAM (Fig. 4). As células transfectadas foram implantados na CAM de embrião de galinha (células de vector vazio, n = 10; células shRKIP, n = 10), e sete dias após o implante celular, os embriões de galinha foram sacrificados para avaliar o crescimento de tumores e da angiogénese, tal como descrito na secção de materiais e métodos. A média do perímetro dos tumores formados por o controlo e as células transfectadas foi shRKIP 4335 ± 823 pM e 4,913 ± 1,568 mm, respectivamente. Como mostrado na Fig. 4B, o tamanho dos tumores formados por células shRKIP não foi significativamente maior quando comparado com os tumores formados por células vector vazio.

Imagens representativas (ampliação de 16 x) de ensaio CAM após 7 dias de tumor

A) crescimento

in ovo

e

ex ovo

. B) O crescimento do tumor foi medido

In vivo

pelo ensaio CAM, como descrito na secção de materiais e métodos. Observou-se um perímetro maior (uM) dos tumores (

in ovo

) formados por células shRKIP, no entanto, a diferença entre as células de controlo não foi significativa. C) A coloração por Hematoxilina-eosina dos tumores embebidos em parafina que mostram a maior vascularização induzida por inibição RKIP. imagens representativas com 10 × e 20 × ampliação são representados no painel da esquerda. D) A contagem dos vasos sanguíneos

ex ovo

, observou-se um aumento estatisticamente significativo no número de vasos recrutados nos tumores formados por células shRKIP quando comparado com o controlo. No total, foram analisados ​​20 ovos (10 foram injectados com vector vazio e 10 com células shRKIP). Os dados são representados como a média ± SD e as diferenças com um

p Art 0,05 em teste t de Student foram considerados estatisticamente significativos (*)

Para avaliar o impacto da. RKIP na modulação da angiogênese, temos

ex ovo

o número de navios em torno dos tumores. Nós contadas uma média de 54 ± 16 e 83 ± 10 vasos nos tumores formados por o vector vazio e as células transfectadas shRKIP, respectivamente. células inibidas RKIP revelou um aumento estatisticamente significativo (

P

0,05) aumento no recrutamento de vasos sanguíneos quando em comparação com as células de controlo (Fig. 4D). Como mostrado na Fig. 4C, a coloração hematoxilina-eosina dos embebidos em parafina tumores e CAM confirmou a rica vascularização dos tumores com capilares ao redor do tumor e capilares brotando do CAM para os tumores. Taxas mais elevadas de vascularização foram observadas nos tumores formados por células shRKIP transfectadas (Fig. 4C).

Papel de RKIP em células de cancro do colo do útero resposta à quimioterapia

Para determinar se podem estar envolvidos proteína RKIP na modulação da resposta do paciente com cancro do colo do útero para a quimioterapia convencional, determinou-se a sensibilidade de linhas de células do cancro do colo do útero transfectadas com shRKIP para o tratamento com cisplatina. Como pode ser observado nos ensaios citotóxicos (Fig. 5A), todo o shRKIP transfectadas linhas celulares eram menos sensíveis ao tratamento com cisplatina, quando em comparação com as linhas celulares de controlo transfectadas com o vector vazio, sendo esta diferença mais evidente para C-33A linha celular. Como mostrado na Fig. 5B, as células HeLa transfectadas com o shRKIP exibido um IC média

50 de 18,55 ± 2,06 mM contra os 5,91 ± 0,30 mM alcançados pelas células vetor vazias. Para a linha celular C-33A os valores foram mais semelhantes entre as duas linhas de células transfectadas, 10,37 ± 2,69 uM e 13,25 ± 1,98 ^ M para o vector vazio e as células transfectadas shRKIP, respectivamente (Fig. 5B). A linha de células SiHa foi o menos sensível a cisplatina com o vector vazio células transfectadas atingindo 25,99 ± 0,51 | iM de média IC

50, enquanto que as células shRKIP transfectadas atingiu 40,69 ± 2,37 | iM de média IC

50 para a cisplatina (Fig . 5B).

a) imagens representativas da análise de regressão não-linear de linhas celulares de cancro cervical tratados com cisplatina para determinação da meia concentrações inibitórias máximas (IC

50). B) A representação gráfica da média de IC valores

50 por cisplatina em linhas celulares de cancro do colo do útero. As células transfectadas com shRKIP eram menos sensíveis ao tratamento com cisplatina nas três linhas de células diferentes. C) HeLa transfectadas linhas celulares foram expostas a concentrações crescentes de cisplatina por 24 horas. o tratamento com cisplatina induz a activação de ERK (P-ERK1 /2) e a apoptose das células como avaliadas por PARP (total e cleaded anticorpos específicos) e caspase-9 clivagem, principalmente nas células transf ectadas com vector vazio. Todas as experiências foram realizadas em triplicado, pelo menos, três vezes.