Abstract

O gene de fusão TMPRSS2 /ERG (T /E) está presente na maioria de todos os cancros da próstata (PCA). Temos demonstrado anteriormente que a sinalização NF-kB é altamente ativada nestes fusão T /E células através de fosforilação de NF-kB p65 Ser536 (P536) expressando. Nós, portanto, a hipótese de que a segmentação de sinalização NF-kB pode ser uma abordagem eficaz para o subgrupo de PCAs que carregam fusões T /E. Celastrol é um inibidor de NF-kB bem conhecida, e, assim, podem inibir T /E de fusão expressando o crescimento celular CaP. Por isso, avaliou os efeitos da Celastrol

in vitro

e

in vivo

em células VCaP, que expressam o gene de fusão T /E. VCaP células foram tratadas com diferentes concentrações de Celastrol e inibição do crescimento e expressão de destino foram avaliados. Para testar a sua capacidade para inibir o crescimento

In vivo

, 0,5 mg /kg Celastrol foi utilizado para tratar ratinhos portadores de xenoenxertos subcutâneos tumores VCaP. Nossos resultados mostram Celastrol pode inibir significativamente o crescimento de T /E de fusão expressando células CaP tanto

in vitro

e

in vivo

orientando três vias de sinalização críticas: AR, ERG e NF-kB na estas células. Quando os ratinhos receberam 0,5 mg /kg Celastrol por 4 vezes /semana, a inibição do crescimento significativa foi observada com nenhuma toxicidade óbvia ou perda de peso significativa. Portanto, Celastrol é uma droga candidato promissor para T /E de fusão expressar CaP. Nossos resultados fornecem uma nova estratégia para a terapia-alvo que pode beneficiar a mais de metade dos pacientes com CaP que têm de fusão /E T expressando PCAS

Citation:. Shao L, Zhou Z, Cai Y, Castro P, Dakhov S, Shi P, et al. (2013) Celastrol Suprime Tumor crescimento celular por meio da segmentação um AR-ERG-NF-kB Caminho no TMPRSS2 /ERG Fusão gene que expressa o cancro da próstata. PLoS ONE 8 (3): e58391. doi: 10.1371 /journal.pone.0058391

editor: Irina U. Agoulnik, Universidade Internacional da Flórida, Estados Unidos da América

Recebido: 05 de dezembro de 2012; Aceito: 04 de fevereiro de 2013; Publicação: 06 de março de 2013

Direitos de autor: © 2013 Shao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Departamento de Cancer Research Program Defesa próstata (DOD W81XWH-08-1-0055; JW) e do NCI para o tecido Dan L. Duncan Cancer Center Humana e Patologia do núcleo (NCI: P30CA125123). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O câncer de próstata (PCA) é uma doença heterogênea que ainda é pouco compreendida. As vias alteradas em alta frequência em tipos específicos de tumores de pacientes precisam ser melhor definidos antes de projetar terapia-alvo individualmente. Encorajadoramente, ao longo dos últimos poucos anos progresso importante foi feita em a subclassificação de APC, em particular, a descoberta de que o TMPRSS2 /ERG (T /E) gene de fusão está presente na maioria dos APCs e assim é a lesão genética mais comum CaP descoberto em [1], [2], [3]. Muitos estudos mostraram consistentemente que o gene de fusão de T /E pode promover CaP invasão e a proliferação, em menor medida e diminuir diferenciação [4], [5]. A elevada frequência desta alteração e seu importante papel na biologia do tumor CaP o torna um alvo terapêutico excepcional em CaP. Nós mostramos que a expressão shRNA estável, que visa especificamente transcrições de fusão T /E diminui significativamente o crescimento do tumor

in vivo

, mas não eliminá-lo completamente [6], indicando a necessidade de a terapia de combinação que pode superar a resistência e /ou fraca resposta ao tratamento único alvo. Os nossos estudos mostram que o NF-kB de sinalização, especialmente fosforilação de p65 de NF-kB Ser536 (P536) é altamente activada nestas células que expressam t /E através de fusão do ERG [7]. sinalização de NF-kB foi mostrado anteriormente para desempenhar um papel importante no crescimento CaP, angiogénese, tumorigénese e na progressão metastática [8], [9], [10], [11], [12]. Devido aos efeitos pleiotrópicos de NF-kB na progressão tumoral, se a hipótese de que a segmentação de sinalização de NF-kB pode ser uma abordagem eficaz para o subgrupo de APC que carregam fusões de T /E.

Nos últimos anos, existe uma crescente interesse na identificação de moléculas potentes e bioativos a partir de fontes naturais, incluindo a medicina tradicional chinesa [13], [14]. Algumas destas moléculas podem oferecer aos pacientes opções terapêuticas mais seguras a longo prazo [15]. Celastrol, um composto farmacologicamente activo a partir do extrato do chinês Trovão Vine que tem sido usado na China há centenas de anos, tem atraído grande atenção recentemente devido a suas atividades anti-inflamatórias e anti-câncer significativos [16], [17] . Muitos estudos têm demonstrado que Celastrol pode modular múltiplas vias de sinalização envolvidos em doenças e portanto apresentam valor terapêutico potencial contra várias doenças e cancros crónicas [16], [17]. Celastrol foi mostrado para inibir o crescimento de muitos tipos de células cancerosas e de tumor suprimir iniciação, progressão e metástase em vários modelos animais in

in vivo

, incluindo cancro da mama [18], o cancro do pulmão [19], do cancro do pâncreas [20], glioma [21], e melanoma [19], bem como CaP [22], [23], [24], e até agora não há efeitos adversos significativos têm sido relatados. Muitos alvos moleculares importantes de Celastrol foram identificadas, incluindo NF-kB, Hsp90, o proteassoma, VEGFR, AKT /mTOR, c-Jun e outros [16], [18], [22], [25], [26] , [27], mas a inibição de NF-kB via parece responsáveis ​​por grande parte de seus efeitos terapêuticos.

Apesar da alta frequência de T /E de fusão detectado em pacientes APC, apenas uma linha de células CaP comumente usado ( VCaP) expressa endogenamente fusão T /E. É uma linha celular dependente de androgénio e expressa a nível elevado de AR, o que pode conduzir a expressão de ERG sob o controlo do promotor TMPRSS2 dependente AR. Também mostra elevado nível de P536 em comparação com a expressão quase indetectável em outras linhas de células de CaP vulgarmente utilizados, incluindo LNCaP, PC3 e DU145 [7]. Por isso, utilizadas VCaP nos nossos estudos. Aqui, mostramos que Celastrol é um inibidor P536 potente que pode inibir significativamente o crescimento de células VCaP ambos

in vitro

e

in vivo

. Além disso, nossos dados revelaram um romance cascata de AR-ERG-P536 alvo de Celastrol sinalização. A segmentação de AR-ERG-NF-kB por Celastrol é novo e é visto mesmo quando a fusão T /E que expressam as células de CaP são expostos a concentrações muito baixas de Celastrol. Sob tais condições, o outro relatado principais vias permanecem inalterados. Com base em todas as provas e seus potentes efeitos biológicos, Celastrol pode ter uso clínico potencial para pacientes portadores de fusão T /E nos seus tumores APC.

Materiais e Métodos

Cultura de Células

VCaP células foram mantidas em DMEM (alto teor de glucose) com soro fetal bovino a 10% (FBS). células VCaP-Luc que expressam a luciferase utilizada para imagiologia animal vivo foram mantidos no mesmo meio de DMEM, mas com 2? g /ml de puromicina [6]. LNCaP, PC3 e DU145 foram cultivadas em RPMI com 10% de FBS.

Western Blotting

ERG anticorpo anti-coelho (1:2000) foi obtido a partir de Epitomics, Inc. (Burlingame, CA, EUA , cat # 2805-1). -AR V7 anticorpo (AR3) foi adquirido a partir de um L precisão Anticorpo ™ (Columbia, MD, EUA, Cat # AG10008) e usado como diluição 1:1000. Anti-p65, fosfo-p65 Ser536, AR, IKBα, HSP90, o total por AKT e fosfo-AKT Ser473 foram todos obtidos a partir de Cell Signaling Technology, Inc (Danvers, MA, EUA) e foram usadas em 1:1000 diluição para Western blotting utilizando os procedimentos descritos anteriormente [28]. controlo anti-β-actina foi realizada como descrito anteriormente [28]. Blot sinais foram visualizados usando quimioluminescência aumentada (Thermo Fisher Scientific, Inc) e exposta e desenvolvida com películas ou sistema de imagem Bio-Rad e quantificada por um densitómetro utilizando Quantity One (Versão 4.5.2, Bio-Rad Laboratories, Inc, Hercules, CA ).

quantitativa PCR em tempo real

T /e de fusão e iniciadores β-actina foram como descrito anteriormente [3]. 5 uL do ADNc molde (diluição de 1:20) foram utilizados num volume de reacção final de 15 ul. A mistura principal de PCR em tempo real continha 2 mM de MgCl2, 0,4 uM de cada e iniciadores para a frente e 7,5 ul de DNA mestre SYBR Green (2 ×; Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, EUA) inverter. PCR em tempo real foi realizado utilizando o instrumento ABI a partir seguido por um protocolo de PCR de 3 etapas com diferentes temperaturas de recozimento mostrado abaixo. Os primers para a AR, AR3, p65 e CCL2 foram: AR RTF: 5′-CTACTCCGGACCTTACGGGGACATGCG-3 ‘; AR RTR: 5’-GGGCTGACATTCATAGCCTTCAATGTGTGAC-3 ‘; AR3 RTF: 5’-CTACTCCGGACCTTACGGGGACATGCG-3 ‘; AR3 RTR: 5’-TGCCAACCCGGAATTTTTCTCCC-3 ‘; P65 RTF: 5’-CTGCAGTTTGATGATGAAGA-3 ‘; P65 RTR: 5’-TAGGCGAGTTATAGCCTCAG-3 ‘; RTF CCL2: 5’TCTCAGTGCAGAGGCTCG -3 ‘; CCL2 RTR: 5’-GTTTGGGTTTGCTTGTCCAG -3 ‘. A expressão relativa de ΔCt entre os diferentes grupos experimentais foi recolhido e normalizadas para expressão de p-actina.

Ensaio de Proliferação

1 × 10

5 as células foram semeadas em placas de 24 poços em triplicado e células fixadas foram contadas utilizando um contador de células como descrito previamente [29]. Celastrol foi adquirido de Sigma-Aldrich Co. LLC. (Cat # C0869) e dissolveu-se em DMSO como recomendado. Para as células VCaP tratamento Celastrol foi iniciada 48 horas após a semeadura. LNCaP, as células PC3 e DU145 foram tratados com Celastrol 24 h após a sementeira inicial. Diferentes doses de Celastrol foram aplicadas para cada grupo experimental. O experimento foi repetido três vezes.

VCaP-Luc subcutânea Mice Modelo

Doze semanas foram utilizados ratos nus idade. 4 × 10

6 células que expressam VCaP luciferase (Luc VCaP- células) foram misturados com 100 ul de matrigel (BD Bioscience, San Jose, CA, EUA) num volume total de 200 ul e injectado por via subcutânea. O crescimento do tumor foi monitorizado semanalmente após a injecção inicial utilizando o sistema de imagiologia IVIS (Xenogen, Alameda, CA, EUA) [6]. Dezasseis ratos mostraram uma semana 1 × 10 lendo

5 luminância após a injecção e foram incluídos para as experiências de tratamento. Os animais foram divididos em 2 grupos experimentais de 8 murganhos em cada grupo. Os ratinhos no grupo de tratamento foram injectados intraperitonealmente (i.p.) com 200 ul de 0,5 mg /kg Celastrol dissolvido em DMSO a 3% e PBS, enquanto que os animais de controlo receberam 200 ul de veículo (DMSO a 3% e PBS). O tratamento foi realizado 4 vezes por semana, durante 3 semanas. pesos de camundongos foram monitorados duas vezes por semana. Os ratinhos foram sacrificados 24 horas após a última injecção e os tumores primários foram excisados, pesados, e uma porção do tumor foi congelado em azoto líquido para análise molecular e outra parte fixa e embebidos em parafina. A necropsia foi realizada também em ratinhos para excluir efeitos colaterais do tratamento. As diferenças na dimensão média do tumor são analisados ​​pelo teste t. Os extractos de proteína e ARN foram preparadas para análise posterior. A tissue microarray (TMA) foi preparado para análise IHC. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Baylor College of Medicine institucional Uso de Animais e do Comité Care (IACUC número de protocolo # AN-4542).

Imunohistoquímica

e Análise de apoptose

A imuno-histoquímica (IHC) de tumores subcutâneos VCaP foi realizada utilizando anticorpos anti-fosfo-p65-Ser536 e ERG como descrito anteriormente [7], [29]. Um rato monoclonal anti-AR a partir Biocare médica, Concord, CA, EUA (Cat # CM109) foi utilizado para a IHQ para avaliar a expressão de AR, em secções tumorais usando diluição 1:50. As lâminas foram fotografadas utilizando um microscópio Nikon Eclipse E400 conectados com Nuance Multispectral Imaging System em 40 × ou 200 × ampliações com resolução de 3.3 megapixel. Para Ki-67 e CD31 IHC e TUNEL, as imagens foram salvas como arquivos JPEG com 4-6 imagens foram tiradas para cada slide, cobrindo a área do tumor inteiro. O valor numérico para cento manchado (PS) é determinado usando o software Image J. (https://rsb.info.nih.gov/ij/) e comparados usando t-testes.

Resultados

Celastrol P536 é um inibidor potente

Dada a descoberta de que a sinalização de NF-kB é activado em fusão altamente T /E células que expressam, procurou-se testar a hipótese de que a segmentação de sinalização de NF-kB pode ser um agente terapêutico viável abordagem para a fusão T /E expressando CaP. Portanto, avaliou-se vários candidatos inibidores do NF-kB, incluindo dois inibidores da activação de NF-kB (481,407 e compostos Celastrol) e MG132, um inibidor de NF-kB que funcionam ao nível de inibição de proteassoma [9], [30]. Como mostrado na Fig. 1A, Celastrol pode suprimir significativamente P536 em células VCaP quando utilizada na concentração de 2