Abstract

PTEN, um fosfatidilinositol-3-fosfatase, serve duplo papel como supressor de tumor e regulador do metabolismo catabólico /anabolizantes celular. A adaptação de um tiol de cisteinilo sensível ao redox em PTEN para a transdução de sinal por peróxido de hidrogénio pode ter sobreposta uma vulnerabilidade de outros mediadores de inflamação e estresse oxidativo, especialmente as espécies de carbonilo reactivas, que são de ocorrência comum subprodutos da peroxidação de ácido araquidónico. Usando células MCF7 e HEK-293, que relatam que vários aldeídos e cetonas, por exemplo reactivos α electrof ílico, p-enals (acroleína, 4-hidroxi-2-nonenal) e α, p-enonas (prostaglandina

2, Δ12-prostaglandina J

2 e 15-desoxi-12,14–Δ prostaglandina J

2) covalentemente modificar e inactivar PTEN celular, com a resultante activação da PKB /Akt quinase; a fosforilação de substratos de Akt; aumento da proliferação de células; e aumento da sinalização β-catenina nuclear. Alquilação de PTEN por α, β-enals /enonas e interferência com os respectivos apoios de PKB celulares /sinalização Akt pode acentuar hiperplásico e distúrbios neoplásicos associados com inflamação crônica, estresse oxidativo, ou envelhecimento

Citation:. Covey TM, Edes K, Coombs GS, Virshup DM, Fitzpatrick FA (2010) Alquilação do supressor de tumor PTEN Ativa Akt e β-catenina de sinalização: um mecanismo de ligação inflamação e estresse oxidativo com Câncer. PLoS ONE 5 (10): e13545. doi: 10.1371 /journal.pone.0013545

editor: Marcelo G. Bonini, da Universidade de Illinois em Chicago, Estados Unidos da América

Recebido: 08 de julho de 2010; Aceito: 30 de agosto de 2010; Publicação: 21 de outubro de 2010

Direitos de autor: © 2010 Covey et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health Research Projeto Grant R01 AI 26730 (Frank A. Fitzpatrick), Projetos de Pesquisa do Programa PO1 Projeto CA73992 4 (David M. Virshup) e Projeto 5 (Frank A. Fitzpatrick) e Small Grant Programa R03 MH082387 -01 (Gary S. Coombs, David M. Virshup e Frank A. Fitzpatrick). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a inflamação e câncer estão intrinsecamente ligados [1], [2]. inflamação ‘Smoldering’ [3], também chamado para-inflamação [4], ocorre em muitos tipos de tumores pré-malignos e malignos, e.g. adenoma colorrectal e adenocarcinoma, onde o teor de leucócitos inflamatórios e a enzima inflamatória ciclooxigenase-2 (COX-2) a progressão influência, prognóstico e sobrevivência [5], [6]. Não-esteróides anti-inflamatórios não esteróides (AINE) que inibem a COX-2 pode impedir certa, mas não todos, os tipos de cancro [7]; e alguns AINEs, como sulindac sulfona, agir independentemente de COX e prostaglandina E

2 (PGE

2) inibição [8]. Outros AINEs, por exemplo, celecoxib, pode, paradoxalmente, aumentar a progressão do tumor em APC

Min /+ camundongos, que modelo de tumorigênese intestinal [9]. Enquanto COX-2 e do seu metabolito PGE

2 são, sem dúvida, importante, para-inflamação pode aumentar a tumorigênese por mecanismos que não são completamente compreendidos. mecanismos da imunidade inata são os principais candidatos para investigação.

Geralmente, a inflamação imune inato é composto por uma fase de “ferimento” aniquilar agentes patogénicos, e uma fase de “cura” para reparar e regenerar o tecido danificado de acolhimento [10]. A transição entre as fases depende esgotamento progressivo dos mediadores inflamatórios e de conversão de certos mediadores pró-inflamatórios, por exemplo PGD ​​

2, em metabolitos anti-inflamatórios, Δ12-PGJ

2 [11], [12], [13]. Elementos do próprio sítio inflamado, e.g. espécies reativas de oxigênio (ROS), albumina, fibroblastos e neutrófilos, orquestrar essa conversão [14], [15], [16], [17]. Por exemplo, espécies reactivas de oxigénio (ROS) causar a peroxidação não-enzimática dos ácidos gordos essenciais, como o ácido araquidónico (AA) [18]. hidroperóxidos AA transformar facilmente em produtos reactivos contendo um α, β-insaturado carbonil [19], [20] que incluem acroleína (2-propenal) [21], [22], 4-hidroxi-2-nonenal (4-HNE) [23], e prostaglandinas ciclopentenônicas (cyPGs), PGA

2 e Δ12-PGJ

2 [24]. modificação covalente de NFkB e IKKα proteínas /beta por estes a, metabólitos carbonila SS-insaturado (isto é proteína de alquilação) parece ser um “interruptor” para terminar a inflamação [25]. Seguindo esse precedente, a hipótese de que alquilação pode também actuar como um “interruptor” para iniciar a reparação e regeneração do tecido danificado por inflamação.

PTEN (angiotensina homólogo fosfatase no cromossoma 10) é um fosfatidilinositol-3-fosfatase com duas funções fisiológicas: supressores de tumor e regulador da sinalização celular anabolizante /catabólico. O

gene PTEN

é frequentemente mutado ou inativado em cancros avançados [26]. Usando MCF7 e as células HEK-293, informamos que α reativa, carbonilos ß-insaturadas (acroleína, 4-HNE, e Δ12-PGJ

2) inativar a proteína PTEN – não o gene – por alquilação. Inactivação de PTEN por a, carbonilos ß-insaturados leva ao aumento da sinalização de Akt, a sinalização β-catenina nuclear aprimorada e proliferação celular aumentada. Redox sinalização por PTEN podem ter evoluído para permitir que as células (tecidos) para estratificar a sua resposta ao estresse oxidativo. Por exemplo, a inibição transiente de PTEN por oxigénio reactivo ou espécies de carbonilo, e a correspondente através de sinalização de Akt /GSK3β /β-catenina /TCF4 /LEF1 pode beneficiar do hospedeiro através do aumento da proliferação e regeneração do tecido danificado por uma inflamação aguda ou stress oxidativo. Errante e persistente inativação PTEN pelo mesmo mecanismo molecular pode favorecer a progressão do tumor e fornecer uma ligação etiológica entre a inflamação “latente” e certos tipos de câncer, especialmente câncer colorretal, onde tanto o PTEN e do APC supressores de tumor restringir sinalização β-catenina nuclear [27] .

resultados

O α, carbonilos ß-insaturados acroleína, 4-HNE e Δ12-PGJ

2 covalentemente modificar celular PTEN

Nós expuseram células MCF-7 para α representante, carbonilo SS-insaturado (Figura 1C) ou H

2O

2, em seguida, marcaram selectivamente quaisquer proteínas que tinha oxidado ou tióis carboniladas usando NEM-biotina (Figura 1A). Em seguida, as proteínas sequestradas com um epitopo biotina para neutravidina grânulos (NA) e identificado carbonilado PTEN por SDS-PAGE e imunotransferência. Células MCF-7 tratadas com 10? M Δ12-PGJ

2, 4-HNE, ou acroleína continha carbonilado PTEN em quantidades comparáveis ​​às células tratadas com 100 uM H

2O

2 (Figura 1A, NA pulldown) . Este método não faz distinção entre tióis oxidados e carboniladas sobre PTEN. No entanto, a electroforese em condições não redutoras, seguido de transferência de Western mostrou que PTEN migrou como uma isoforma discreto devido a um dissulfureto oxidado [28], [29], que ocorreu apenas em células tratadas com 100 uM H

2O

2, mas não em células tratadas com α, carbonilo SS-insaturado (Δ12-PGJ

2, 4-HNE, a acroleína) ou 15-HPETE, um hidroperóxido de lípidos (Figura 1B).

(a) Diagrama do processo para identificar PTEN com um tiol oxidado ou alquilado em células expostas a ROS ou α, carbonilos SS-insaturado. A imunotransferência anti-PTEN mostra oxidado ou carbonilado PTEN (NA pulldown) em relação ao total de PTEN (lisado celular) isolado a partir de células MCF-7 tratadas 30 min com veículo (DMSO), 10 uM Δ12-PGJ

2 ou 4-HNE versus 10 min com 100 M H

2O

2; uma imunotransferência de uma experiência separada mostra oxidado, e carbonilado total de PTEN em células tratadas durante 30 min com um veículo ou 20 uM acroleína versus 10 min com 100 ^ M H

2O

2. (B) anti-PTEN imunotransferência de lisados ​​de células MCF-7 fraccionadas por SDS-PAGE sob condições não redutoras. PTEN oxidado a um Cys

124-Cys

71 dissulfeto aparece como uma espécie mais rápido que migram (PTEN dissulfeto oxidada) só em células tratadas com H

2O

2. Esta espécie não foi detectada em MCF-7cells tratados 30 min com o veículo DMSO ou 20? M cada Δ12-PGJ

2, 4-HNE, acroleína ou 15-PETE. estruturas (C) químicos de α típica, carbonilos ß-insaturados. A acroleína e 4-HNE são a, p enals; Δ12PGJ

2 é um α, β enona. carbonos beta eletrofílicos são indicados com δ

+. Borrões são representativos dos resultados obtidos em pelo menos três experiências independentes.

análogos Cyclopenteneone PG-biotina são alfa modelo, beta-enonas que alquilar PTEN

O tiolato cisteinil no PTEN ativa local (-HC (X

5) RT) é propenso à oxidação porque é um nucleófilo forte, pKa ~ 5. Esta característica deve também facilitar a alquilação de PTEN por α, ß-insaturados carbonilos. Utilizou-se análogos CyPG-biotina, que tem uma β-carbono electrofílico capaz de adição nucleofílica (reacção de Michael), como modelos químicos a testar esta hipótese [30]. A alquilação de quaisquer proteínas celulares por estes análogos seria introduzir um epitopo biotina

de novo (Figura 2A). PGA

1-biotina e Δ12 PGJ

2-biotina foram ambos tomados em células MCF-7 e formados adutos covalentes com proteínas -20 (Figura 2B). Δ12 PGJ

2-biotina (a dienona bi-funcional) foi mais reativo do que PGA

1-biotina (enona mono-funcionais), concordando com os outros que relataram ~20-30 alvos proteína modificada por cyPG-biotina em células 3T3 ou mitocôndrias [31], [32]. O sequestro de

de novo

proteínas celulares biotinilados em pérolas de NA, seguido de imunotransf erência com anticorpos anti-PTEN, mostrou que PTEN formado um aducto covalente ~ 10 vezes mais prontamente com Δ12-PGJ

2-biotina de com PGA

1biotin (Figura 2C, faixa 4 vs pista 3).

(a) Michael reacção de adição entre PTEN e uma Δ12-PGJ analógico

2-biotina. Após o tratamento das células com cyPG-biotina, proteínas com um

de novo

biotina epitopo foram sequestradas em grânulos neutravidina (NA), suspenso em seguida fraccionadas por SDS-PAGE por imunotransferência. imunotransferência (B) anti-biotina de proteínas a partir de lisados ​​de MCF 7-células tratadas com DMSO (pista 1), 10 uM de PGA

1-biotina (pista 2), e 10 uM Δ12PGJ

2-biotina (pista 3). Δ12-PGJ

2 biotina formou um aduto covalente com as proteínas mais facilmente do PGA

1-biotina (setas). (C) de imunotransferência anti-PTEN de PTEN celular que se formou um aducto covalente com cyPG-biotina (NA pulldown) em relação ao total de PTEN (lisado celular) a partir de MCF 7-células tratadas com DMSO (pista 1), 1 ou 10 uM de PGA

1-biotina (pistas 2, 3), e 1 ou 10 uM PGJ

2-biotina (pistas 4, 5). Borrões são representativos dos resultados obtidos em pelo menos três experiências independentes.

O α, ß-enona, Δ12-PGJ

2, interfere com a supressão PTEN da Akt quinase

os factores de crescimento, a insulina, e outros estímulos linha de PI3-K para fazer PIP

3, que recruta PKB /Akt quinase para a membrana celular onde PDK1 /2 fosforila Akt Thr

308 e Akt Ser

473 resíduos, respectivamente [33], [34], [35]. PTEN down-regula PKB /ativação da Akt, metabolizando PIP

3 a PIP

2 [36]. α, carbonilos ß-insaturados que alquilar PTEN celular pode interferir com a sua supressão da Akt quinase. Um representante α, SS-enona, Δ12-PGJ

2, provocou um aumento dependente da concentração e do tempo na fosfo- (T

308) Akt em células MCF-7. Tão pouco como ~ 2 uM Δ12-PGJ

2 causou uma resposta semi-máxima (Figura 3A). Aumentos na fosfo- celular (T

308) Akt foram detectáveis ​​em 10 min, máxima em 30 min, e durável para 120 min (Figura 3B). Δ12-PGJ

2 aumento da formação de fosfo- (T

308) Akt sem alterar a formação de fosfo- (S

241) PDK1 (a quinase que fosforila T

308 de Akt), e sem alterando a expressão da proteína de PTEN (Figura 3C). Estes dados sugerem que Δ12-PGJ

2 interferiu com a capacidade do PTEN para conter a activação de Akt quinase. Consistente com esta interpretação, o co-tratamento de células com mais de 50 uM cyPGs LY294002, reduziu os níveis de fosfo- (T

308) Akt por inibição de PI3-K, no vértice da PI3-K /→ PDK1 /2 → Akt quinase de cascata (Figura 3C, pistas 3 vs 2, 6 e vs. 5). Além disso, uma variedade de iM PGA e PGJ isómeros, e outra α, SS-enonas directamente inibida isolado enzima PTEN [Tabela 1]. O carbono β eletrofílica de cyPGs é essencial para a inibição, uma vez que um cyPG estruturalmente semelhantes, mas não eletrofílica, PGB

1, estava inativo.

(A) imuno de fosfo- (T

308 ) Akt em relação ao Akt total em lisados ​​a partir de células MCF-7 tratadas com 30 min 0-20 uM Δ12-PGJ

2. O gráfico de barras mostra o aumento em fosfo- (T

308) Akt /Akt total (média ± S.E.M) a partir de experiências separadas n≥3. (B) de imunotransferência da fosfo- (T

308) em relação ao Akt Akt total em lisados ​​a partir de células MCF-7 tratadas com 20? M Δ12-PGJ

2 para 0-120 min. O gráfico de barras mostra o aumento em fosfo (T

308) Akt /Akt total (média ± S.E.M) a partir de n = 4 experiências separadas. (C) As imunotransferências de Akt total, fosfo (T

308) Akt, PTEN, fosfo- (S

241) PDK1 a partir de lisados ​​de células MCF-7 tratadas 30 min com 20 uM Δ12-PGJ

2 (pista 2, 3) e 20 uM de PGA

1 (pista 5, 6) na presença do inibidor de PI3-K 50 ^ M LY294002 (pista 3, 6) ou veículo DMSO (pista 2, 5). (D) Immunoblot de fosfo- (T

308) Akt em relação ao total de Akt em lisados ​​de MCF 7-células tratadas 4 horas com o veículo, os ciclopentenonas – PGJ

2, Δ12-PGJ

2, e 15-desoxi-Δ12-PGJ

2, ou o seu precursor de PGD

2. Para (C) e (D), borrões são representativos dos resultados obtidos em três experiências independentes.

experimentos de estrutura-actividade mostrou que vários cyPGs da série J, incluindo PGJ

2 , Δ12 PGJ

2 e Δ12 15-desoxi, 14-PGJ

2, o aumento da fosfo- (T

308) Akt em células MCF-7, em comparação com veículo ou o seu precursor de PGD

2 (Figura 3D). PGA

1 teve um efeito modesto sobre a fosforilação celular de Akt (Figura 3C, pista 5), ​​que corresponde com a sua fraco de modificação covalente de PTEN celular (Figura 2C, faixa 3).

fosfo- Activado (t

308 /S

473) Akt quinase pode fosforilar diferentes substratos de proteínas que regulam a proliferação celular e destino [35]. A fosforilação de substratos Akt com um epitopo RxRxx-fosfo-S /T, coincidiu com o aumento da fosfo- (T

308) Akt em células MCF-7 de células tratadas com 10 pM Δ12-PGJ

2 (Figura 4A). activação da cinase Akt também coincidiu com a proliferação dependente de Akt em células MCF-7 tratadas com 1-10 uM Δ12-PGJ

2 (Figura 4B). Este resultado é consistente com relatados ações bi-fásicas de cyPGs, em que eles aumentam a proliferação de células cultivadas em ~ 1? M [37], [38], enquanto eles diminuem a proliferação ou causar apoptose, modificando outras proteínas alvo em -50? M [39 ].

(A) imuno de fosfo- (T

308) Akt, Akt total, e várias fosfoproteínas com (K /R) -x- (K /R) -xx- (S /T), um motivo reconhecido e fosforilada por fosfo- activa (T

308) Akt, em lisados ​​de células MCF-7 tratadas 0 e 10 uM Δ12-PGJ

2. (B) a proliferação relativa das células MCF-7 (média ± SEM, n = 4) tratados com 0, 1, e 10 uM Δ12-PGJ

2 sozinho (▪), ou na presença de 10 uM de inibidor IV (▪), um inibidor da Akt quinase. (C) imuno de fosfo- (S

473) Akt, Akt total; fosfo (S

9) GSK3β, o total GSK3β; e β-catenina e a tubulina em lisados ​​a partir de células HEK 293 para 0,1 após o tratamento, 3, 6 e 16 horas com 6 uM Δ12PGJ

2, 6 uM 4-HNE ou 20 uM de acroleína. Para (A) e (C), manchas são representativos dos resultados obtidos em três experiências independentes.

α, carbonilos ß-insaturados causar uma acumulação dependente do tempo de fosfo- celular (S

473) quinase Akt (ativo) → fosfo- (S

9) GSK3β (inativo) → β-catenina e um aumento da β-catenina nuclear sinalização

GSK3β converte β-catenina para fosfo- (S

33/37 /T

41) β-catenina, que é rapidamente eliminado pelo proteassoma 26S [40]. GSK3β actua em conjunto com o supressor de tumor APC. Em células com mutante de APC, ou quando ligandos WNT estimular as células com o tipo selvagem da APC, GSK3β falha para fosforilar β-catenina, o que lhe permite acumular-se, associado com outros factores de transcrição nuclear e expressar os seus genes-alvo (por exemplo,

c-myc

,

ciclina D1

) [41]. PTEN pode bloquear acumulação β-catenina /sinalização ao favorecer a retenção de GSK3β activa e inactiva PKB /Akt quinase em alguns [42], [43], mas nem todos os sistemas experimentais [44], [45]. Assim, PTEN inativado deve aumentar a sinalização de β-catenina, favorecendo a retenção de fosfo- inativo (S

9) GSK3β e fosfo- ativa (S

473) Akt quinase. Nós, portanto, a hipótese de que esses mediadores eletrofílicos pode afetar ß-catenina sinalização através deste mecanismo. Para aprofundar o assunto, usamos células HEK 293 que têm uma via de sinalização beta-catenina intacto. Descobrimos que os alfa diferentes, carbonilos ß-insaturados que alquilada PTEN (6 mM Δ12 PGJ

2, 6 mM 4-HNE e 20 mM acroleína) tudo causou um aumento dependente do tempo em fosfo- (S

473 ) Akt (isto é, Akt quinase activa), com um aumento correspondente na fosfo- (S

9) GSK3β (isto é, inactivo GSK3β) e β-catenina (Figura 4C). Para determinar se a, p-insaturados carbonilos reforçada sinalização β-catenina nuclear, utilizou-se células HEK 293 modificadas para expressar estavelmente Wnt3a e o gene repórter SuperTopFlash (STF) [46]. Estas células, chamadas de células STF3A, assim Wnt3a secreto, um estimulo autócrino /parácrino para receptores FZD que retarda a degradação dependente de APC-de β-catenina (Figura 5A). Nuclear β-catenina de sinalização em células STF3A é proporcional à sua expressão de luciferase (actividade), e eles são sensíveis para DKK1, um antagonista de WNT, que inibiu a sinalização β-catenina em células STF3A de um modo dependente da concentração (Figura 5B).

células STF3A (a) abrigam um transgene integrado de forma estável que expressa Wnt3a (). Quando segregada, Wnt3a provoca estimulação autócrina /paracrina dos receptores FZL () que inibe a rotatividade de APC-dependente de β-catenina (). Se β-catenina não é fosforilada por GSK3β, ele pode acumular-se como uma β-catenina: LEF dímero () e se ligam a promotores em β-catenina integrado de forma estável: gene repórter de luciferase (SUPERTOP Flash) (). A actividade de luciferase em lisados ​​celulares é proporcional à sinalização β-catenina nuclear. (B) Nuclear β-catenina sinalização (luminescência da luciferase) em células STF3A (2 × 10

4 células /poço) cultivadas durante 24 horas em meio contendo 0, 10, ou 30 ng /ml de DKK1 (média + SD, n = 3). DKK1, um antagonista de Wnt, sinalização β-catenina inibida (C) de sinalização β-catenina nuclear em células STF3A (2 × 10

4 células /poço) cultivadas durante 24 horas em meio contendo 20 uM de cyPGs; α, β-enals ou PGs principais. Vários electrófilos reactivos reforçada sinalização β-catenina por ~2-4 dobra. Histograma representa a média + SEM, n = 4.

vários metabolitos carbonilo reativa, cada um com um electrof α, β enona ou substituinte enal, expressão aumentada do β-catenina: gene repórter da luciferase em STF3A células (Figura 5C). actividade repórter da luciferase aumentou ~ 4 vezes ao longo da linha de base (p 0,01) nas células incubadas com STF3A Δ12 PGJ

2 ou 4-HNE; por ~ 3-vezes (p 0,01) em células com outros análogos PGJ, acroleína ou 4-ona; e por -1,5-vezes (p 0,05) em células com PGA

2. Consistente com nossa hipótese mecanicista, nem PGB

2, nem MDA teve um efeito detectável. PGB

2 é um cyPG, mas tautomerismo impede a carga de-localização necessário para criar um carbono electrofílico β, que é necessária para a alquilação de proteínas. MDA (β-hidroxi-acroleína) penetra as membranas celulares mal porque é 99% ionizado em ~7.4 pH fisiológico usada nas nossas experiências. Nem PGE

2, nem outros metabolitos PG primárias da COX-1 ou -2 teve qualquer efeito sobre a sinalização β-catenina nuclear em células STF3A. Chamamos a atenção para o fato de que ectópica sobre-expressão de receptores de PE em células HEK 293 foi necessária para provocar qualquer PGE

2 mediada sinalização β-catenina [47]. A resposta fraca a PGE

2 e outro PG na Figura 5C pode refletir os níveis constitutivos da EP, FP, DP ou receptores IP em células STF3A ou rápido metabolismo de PGs, ou ambos.

β- reforçada catenina em células de sinalização STF3A era dependente entre 2-20 | iM para a acroleína, 4-HNE e Δ12 PGJ

2 (Figura 6A) concentração. Esgotamento de GSH celular para ~ 10% da linha de base por tratamento com 100 M de sinalização BSO potenciado β-catenina, por exemplo, STF3A em células tratadas com 2 e 6 uM Δ12 PGJ

2 (Figura 6B). Isto é consistente com o papel da glutationa reduzida na conjugação de metabolitos reactivos, e protecção de proteínas sensíveis redox de alquilação [20].

(A) β-catenina nuclear de sinalização (luminescência da luciferase) em células STF3A ( 2 × 10

4 células /poço) cultivadas durante 24 horas em meio contendo 0, 2, 6 e 20 uM cada de acroleína (□), Δ12 PGJ

2 (▪) e 4-HNE (▪). (B) de sinalização Nuclear β-catenina em células STF3A (2 × 10

4 células /poço) cultivadas durante 24 horas em meio contendo 0, 2 ou 6 uM de Δ12 PGJ

2 sozinho (▪) ou Δ12 PGJ

2 mais 100 BSO M. níveis de GSH diminuíram 79% e 88% em 6 e 24 horas após o tratamento de células com BSO; 92-95% das células ainda foram viáveis ​​a 24 horas. As barras representam a média ± SEM de experiências separadas n≥3.

Discussão

O

PTEN

gene supressor de tumor é frequentemente mutado ou inativado em cancros avançados [26 ], [48]. PTEN é um fosfoinositide-3-fosfatase que metaboliza PIP

3 a PIP

2 [36], desse modo contra-regulação da PKB /Akt, uma serina /treonina-quinase proto-oncogene que controla o crescimento anabólico e especificação de destino celular [33], [34], [35]. PTEN, em si, é regulada pós-translacionalmente por fosforilação [49], acetilação [50], e a oxidação reversível da sua cisteína catalítica

124 resíduo [28], [29]. A oxidação de PTEN celular pode envolver H

2O

2 derivado da NADPH-oxidase [51], superóxido dismutase [52], ou a peroxidação enzimática do ácido araquidónico (AA) por COX-1, COX-2 ou 5-LOX [53]. Todas estas enzimas são geralmente sobre-expressa e activada por inflamação ou transformação neoplásica. oxidação PTEN, e qualquer fisiopatologia assistente, varia com o grau de exposição celular a espécies de oxigénio reactivas (ROS). Nestes estudos, foi demonstrado que a química que facilita a oxidação de PTEN também pode facilitar a sua alquilação por α electrofílico, SS-enals e α, p-enonas [19], [20].

PTEN simboliza a adaptação de tióis redox-sensível para sinalização celular, bem como a sua vulnerabilidade potencial de subprodutos de stress oxidativo e inflamação. PTEN é inactivado por dois processos distintos mediada por redox: 1) formação intra- ou inter-moleculares dissulfureto por ROS e 2) carbonilação tiolato (adição de Michael) por α electrofílico, carbonilos SS-insaturado (Figura 1-3). O peróxido de hidrogénio (H

2O

2), uma ROS prototípico, inibe PTEN celular por oxidação directa sua catalítica Cys

124 a um de sulfenilo intermediário, o qual forma uma forma inactiva, Cys intra-molecular

124-71 dissulfeto [28], [29]. Os nossos dados mostram que vários representativa, espécies de carbonilo electrofílicos (α, SS-enals e α, SS-enonas), que pode ocorrer de forma endógena como subprodutos de peroxidação lipídica durante a inflamação ou de stress oxidativo, alquilato e inactivam PTEN. A inactivação de PTEN por processos mediados por redox causa um aumento na actividade da Akt proto-oncogene. Hiperativação do Akt aumenta a proliferação e sobrevivência de muitos cancros diferentes.

Sinalização por H

2O

2 abrange um amplo contínuo fisiopatológico [54] e um papel comparável para eletrófilos reativas parece plausível. espécies carbonilo reactivos, tais como a acroleína, o 4-HNE e Δ12PGJ

2 representam um sub-conjunto de eletrófilos comumente produzidos durante o estresse oxidativo e inflamação. Estas descobertas podem extrapolar a agentes eletrofílicos falta um carbonilo, mas contendo outros grupos de remoção de electrões, e nos referimos a eles geralmente como “eletrófilos reativas”. Em primeiro lugar, como H

2O

2, eletrófilos reativas ocorrer

in vivo

durante a inflamação e estresse oxidativo [16], [18], [19], [22]. Em segundo lugar, os electrófilos reactivos covalentemente modular outras proteínas que regulam os processos de sinalização importantes; isto é, LKB1 /STK11 [55], NFkB [56], e IKKβ. Em terceiro lugar, H

2O

2 e electrófilos reactivos se originam a partir de uma combinação de processos enzimáticos e espontâneas, as quais coincidem frequentemente nos tecidos inflamados [57]. H

2O

2 deriva de ânion superóxido, O

2

-, o metabolito principal da oxidases NADPH. dismutação espontânea e enzimática converte O

2

– em H

2O

2. Da mesma forma, a peroxidação lipídica espontânea e enzimática gera acroleína e 4-HNE [18], [57]. cyPGs originam do endoperóxido lípido PGH

2, o metabolito principal da COX-1 e -2. Enzimática e cisão espontânea de títulos Endoperóxido converte PGH

2 na PGE

2 e PGD

2; albumina /soro, em seguida, faz com que a sua desidratação em PGA

2, PGJ

2, e os seus isómeros [14], [16], [24].

Enquanto especulativa, parece que ROS e reativa eletrófilos (H

2O

2, acroleína, 4-HNE, Δ12 PGJ

2) pode ter os dois evoluíram para desempenhar papéis diferentes na imunidade inata: patógenos 1) aniquilando e 2) inflamação resolver. Análoga à inactivação de NFkB e IKKαβ, inativação temporária do tumor proteína supressora de PTEN pela sua alquilação, e ativação atendente de PKB /Akt quinase proto-oncogenes, pode ajudar a normalizar a morfologia e histologia de tecidos inflamação aguda, liberando sua restrição à proliferação celular, crescimento anabolizantes e especificação destino [34], [35]. De reparação e resolução de situações ordinárias deve ajudar a encerrar a inflamação imune inato (Figura 7,). No entanto, este mecanismo também pode conferir riscos inevitáveis ​​se PTEN foram inativadas errantly ou persistentemente. Além disso, os electrófilos reactivos também inactivar outros supressores tumorais notáveis, incluindo p53 [30] e LKB1 /STK11 [55]. Esta inactivação combinados e sustentada de supressores tumorais poderia contribuir significativamente para a tumorigénese associada à inflamação e subsequentemente prolonga o ciclo de associado a tumor para-inflamação (Figura 7,). No geral, nossos dados e modelo de alinhar-se com a observação de que tumores são feridas que não cicatrizam [58]. Nesta situação, a progressão do tumor pode derivar em parte de mal-adaptação de um mecanismo molecular que evoluiu para terminar e resolver a inflamação imune inato.

A inflamação é um componente crítico de progressão tumoral. Muitos cancros surgem de locais de infecção, irritação e inflamação crônica. O microambiente do tumor, o qual é constituído em grande parte de células inflamatórias, desempenha um papel importante no processo neoplásico, promovendo a proliferação, sobrevivência, migração e. Mostramos aqui que as espécies de carbonilo reactivas, que são normalmente produzidos durante a inflamação e modificar covalentemente inactivar supressor de tumor PTEN. Mais importante, o mecanismo que descrevem também pode extrapolar para: 1) outras espécies electrofílicas gerados por inflamação, oxidativa ou stress xenobióticos (ou seja, outras α, aldeídos e cetonas insaturadas ß; epóxidos alílicos ou vinílicos; quinonas, chlorhydrins, cloraminas, vinilsulfonas; e 2) outros membros da superfamília PTP que são redox sensível. Estes estudos estender nossa compreensão dos mecanismos pelos quais a inflamação contribui para a iniciação e progressão do câncer.

Materiais e Métodos

Materiais

Foi utilizado meio essencial mínimo (MEM) , suplementos, insulina bovina, gentamicina, células de rim embrionário humano HEK-293, e células HEK-293 contendo o vírus de Epstein-Barr antigénio nuclear 1 do gene (HEK-EBNA 1) (Invitrogen; Carlsbad, CA); Células MCF-7 (HTB-22, American Type Culture Collection; Manassas, VA); PGs, análogos cyPG com biotina, e kits de ensaio proliferação WST (# 10.008.883) (Cayman Chemical; Ann Arbor, MI); mistura de inibidor de protease ™ completo (Roche Molecular Biochemicals; Indianapolis, IN); tampão de lise 0,6% de Igepal CA-630 em PBS (Promega; Madison, WI); Neutravidina esferas conjugadas, NEM-biotina e anticorpos de cabra anti-biotina policlonais (# 31852) (Pierce Chemical, Rockford, IL); um inibidor de PI3-K, LY294002 (# 9901), anticorpos policlonais contra PTEN (# 9552), Akt (# 9271), fosfo- (Thr

308) Akt (# 9375), fosfo- (S

473 ) Akt (# 9271), fosfo- (S

9) GSK3β (# 9336), a GSK-3β (# 9332), fosfo- (Ser

33/37 /Tre

41) β catenina ( # 9561S) K /RXK /RxxS /T (PO

4) epítopos (# 9614) e fosfo- (S

241) PDK1 (# 3061) (Cell Signaling Technologies; Danvers, MA); β-catenina (# C19220) (BD Transduction Laboratories; Franklin Lakes, NJ); HRP (peroxidase de rábano) anticorpos secundários conjugados (de Santa Cruz Biotechnology; Santa Cruz, CA); de difluoreto de polivinilideno (PVDF) membranas e reagentes de quimiluminescência Ocidental relâmpago ™ (Perkin-Elmer; Waltham, MA); PTEN kits de ensaio de enzima (# 17-351) (Upstate Biotechnology, Lake Placid, Nova Iorque); inibidor da Akt IV (# 124011) (Calbiochem, San Diego, CA); acroleína (# 01680), crotonaldeído (# 262668), L-butionina-sulfoximina (BSO) (B2515), H

2O

solução de 2 a 30% (H-1009), o malondialdeído (Cat Fluka. # 63287) (Sigma-Aldrich; St Louis, MO); DKK-1 (# 1096-DK-010) (R D Systems; Minneapolis, MN) (. Cat # 10101-2). E Luciferin (Biotium Inc., Hayward, CA):

cultura celular

células MCF-7 de cancro da mama (ATCC) foram cultivadas em MEM com 10% v /v de FBS, 2 mM de L-glutamina, 1,5 g /l de NaHCO

3, 0,1 mM de aminoácidos não essenciais , piruvato de sódio 1 mM, 0,01 mg /ml de insulina bovina, e 0,01 mg /ml de gentamicina. Células HEK-293 (ATCC) foram cultivadas em MEM com 10% de soro fetal de vitelo, 100 unidades de penicilina /estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, e piruvato 1 mM.

Identificação de PTEN modificados por marcação com biotina -conjugated maleimida

células MCF-7 (MEM a 1% v /v de FBS) foram tratadas durante 30 min com um veículo, ou electrófilos reactivos (10 uM Δ12-PGJ

2, 4-HNE, a acroleína) , ou 100 M H

2O

2. O meio foi removido; As células foram congeladas a -80 ° C durante 15 min; transferido para aspirar e incubadas 1 h, 25 ° C com 1 ml de o

2-livre tampão de extracção (NaHPO 50 mM

4, pH 7,0, EDTA a 1 mM, NEM 10 mM [N-etil-maleimida], 10 IAA mM [ácido iodoacético], 1% de Triton X-100, NaF 5 mM, 50 ug /ml de leupeptina e 50 ug /ml de aprotinina). Este tratamento alquila selectivamente todos os tióis reduzidos em PTEN, mas não oxidado tióis tióis ou modificados por adição de Michael com electrófilos reactivos. As amostras foram lavadas em 1 ml de O

2-livre tampão de extracção, em seguida, transferida para um tubo cónico de 15 ml. Após a adição de SDS para uma concentração final de 1% v /v, a mistura foi mantida 2 horas a 25 ° C no escuro, e as proteínas foram precipitadas com TCA [ácido tricloroacético], 10% v /v, durante 1 h.