Sumário

do receptor de androgénio é um factor de transcrição primária envolvida na proliferação de células cancerosas da próstata. Assim, a terapia hormonal com anti-androgénios, tais como bicalutamida, é um tratamento de primeira linha para a doença. Embora a terapia hormonal reduz inicialmente a carga tumoral, muitos pacientes eventualmente recaída, desenvolver tumores com resistência endócrina adquirido. Elucidação dos mecanismos moleculares subjacentes à resistência endócrina é, portanto, uma questão fundamental para a compreensão e desenvolvimento de terapias alternativas para o câncer de próstata avançado. No presente estudo, foi realizada ARN gancho de cabelo curto (shRNA) mediada por rastreio funcional para identificar genes envolvidos em efeitos mediados por bicalutamida sobre células de cancro da próstata LNCaP. Entre tais genes candidatos seleccionados por rastreio utilizando a análise de trama vulcão, proteína ribossómica L31 (RPL31) verificou-se ser essencial para a proliferação celular e na progressão do ciclo celular em células de bicalutamida resistente LNCaP (BICR), com base em pequena ARN interferente (siRNA) – mediadas experimentos knockdown. De nota,

RPL31

mRNA é mais abundantemente expressa em células BICR do que em células LNCaP parentais e os dados clínicos de Oncomine e The Cancer Genome Altas mostrou que RPL31 é sobre-expresso em carcinomas da próstata em comparação com os tecidos benignas da próstata. Curiosamente, os níveis de proteína do supressor tumoral p53 e os seus alvos, p21 e MDM2, foram aumentados em células LNCaP e BICR tratados com

RPL31

siRNA. Observamos diminuição da degradação da proteína p53 após a

RPL31

knockdown. Além disso, a supressão do crescimento e do ciclo celular em cima

RPL31

knockdown foi parcialmente recuperada com

p53

tratamento siRNA. Estes resultados sugerem que RPL31 está envolvido no crescimento bicalutamida-resistentes de células cancerosas da próstata. A tela funcional shRNA mediada neste estudo fornece uma nova visão sobre os mecanismos moleculares e alvos terapêuticos de cancro da próstata avançado

Citation:. Maruyama Y, Miyazaki T, Ikeda K, Okumura T, Sato W, Horie-Inoue K, et al. (2014) Screening Funcional Identificado L31 proteína ribossômica Curto Hairpin RNA biblioteca baseada que modula o cancro da próstata crescimento celular pela via p53. PLoS ONE 9 (10): e108743. doi: 10.1371 /journal.pone.0108743

editor: Chih-Pin Chuu, Institutos Nacionais de Pesquisa em Saúde, Taiwan

Recebido: 04 de junho de 2014; Aceito: 25 de agosto de 2014; Publicação: 06 de outubro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Maruyama et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. O número de acesso GEO para os dados microarray é GSE60382

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo Programa Inovação celular, Grants-in-Aid, e Projeto de Apoio da Strategic Research Center em Universidades Particulares do Ministério da Educação, cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia, Japão; por doações da Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência, Japão; por Grants-in-Aid do Ministério da Saúde, Trabalho e Bem-Estar, Japão; pela Advanced Research para produtos médicos Programa Mineração do Instituto Nacional de Biomedical Inovação, Japão. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata é a quarta causa mais comum de mortes relacionadas ao câncer, e a incidência de câncer de próstata no Japão está aumentando, com 11.000 mortes por ano a partir da doença. Enquanto a maioria em estágio inicial, a doença localizada pode ser tratada com sucesso por terapia de radiação e /ou cirurgia, como muitos como 50% dos pacientes tratados para a doença localizada terão recorrência local ou metástases à distância [1], [2]. Os atuais tratamentos de primeira linha para a recorrente ou câncer de próstata metastático são terapias hormonais, incluindo aqueles que visam receptor de andrógeno (AR) de sinalização, como bicalutamida e drogas como a gonadotrofina-agonistas do hormônio liberador que impedem a produção de andrógenos nos testículos e glândulas supra-renais. Embora terapias hormonais, inicialmente, reduzir a carga tumoral, muitos pacientes tornam-se resistentes a estas terapias e desenvolver uma forma terminal da doença, denominado cancro da próstata resistente à castração (CRPC) [3]. Os pacientes com CPRC têm um mau prognóstico e conta para a maioria das mortes devido à doença.

Em CRPC, reativação de sinalização AR é reconhecida como um evento fundamental que resulta no crescimento do tumor renovado em condições de privação de andrógeno. Estudos recentes revelaram que CRPC é comumente associada com o aumento de sinalização de AR devido à amplificação AR, AR mutação, activação co-factor de transcrição, fosforilação independente do ligando de AR, e outros processos [4] -. [7]

De facto , estudos imunohistoquímicos mostram que a sobre-expressão da proteína AR é encontrado na maioria dos casos de CRPC [6] – [8]. Estas descobertas sugerem que a AR desempenha um papel central no desenvolvimento /aumento, tanto do cancro da próstata dependentes de androgénios e CRPC [9] – [12]. AR reactivação é clinicamente importante porque a própria AR e sua via de sinalização a jusante poderiam ser alvos terapêuticos em CRPC. Os mecanismos moleculares subjacentes precisos reactivação AR em CRPC, no entanto, não são claros, devido à interacção da via de transdução de sinal de AR com outras vias de sinalização.

No presente estudo, foi realizada de ARN gancho de cabelo curto (shRNA) rastreio para identificar novos genes que modulam a resposta para a bicalutamida antiandrogénio em células de cancro da próstata. Num estudo comparativo de células de cancro da próstata tratados com veículo tratados com bicalutamida e, por análise de dispersão vulcão [13], [14] foi utilizada para pesquisar genes que estão envolvidos na resposta de bicalutamida. Um ensaio de viabilidade celular usando pequenos RNAs de interferência (siRNAs) específicos para os genes candidatos shRNA-segmentação revelou que a proteína ribossômica L31 (

RPL31

), o cluster de histonas 1 H2bd (

HIST1H2BD

) e ADAM metalopeptidase com o tipo de trombospondina 1 motif 1 (

ADAMTS1

) estiveram envolvidos na proliferação de células cancerosas da próstata bicalutamida-resistente. Em particular, RPL31, uma proteína que é parte dos 60S grande subunidade ribossomal [15] – [18], foi mostrado para modular a expressão do gene supressor tumoral p53 [19] – [21] e do regulador do ciclo celular p21 [20] . Este estudo revela novas vias que modulam a resposta bicalutamida e alvos terapêuticos no câncer de próstata.

Materiais e Métodos

cultura de células e antiandrogénios

LNCaP, VCaP e 22Rv-1 próstata as células cancerosas foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA). As células LNCaP foram cultivadas em RPMI suplementado com 10% de soro fetal de bovino, penicilina (100 U /ml) e estreptomicina (100 mg /mL) a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO

2. células VCaP e 22Rv-1 foram cultivadas em DMEM com 10% de soro fetal de bovino, penicilina (100 U /ml) e estreptomicina (100 mg /mL) a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO

2. células de cancro da próstata Bicalutamida-resistente (BICR) foram descritos anteriormente [22] – [24], e estas células foram cultivadas em meio RPMI suplementado com 1 fiM bicalutamida, 10% de soro fetal bovino, penicilina (100 U /ml) e estreptomicina (100 mg /mL) a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO

2. Para a transfecção estável, as células LNCaP foram transfectadas com o plasmídeo RPL31 com etiquetas Flag no terminal C ou vector vazio (pcDNA3; Invitrogen) e seleccionadas em meio de cultura contendo 0,1 mg /ml de G418 (Nacalai Tesque, Quioto, Japão). Os transformantes estáveis ​​de células LNCaP expressando RPL31-Flag (LNCaP-RPL31 # 39 e # 63) e vector vazio (LNCaP-vec # 19 e # 22) foram clonados. Bicalutamida e docetaxel foram adquiridos da Sigma-Aldrich Japão (Tóquio, Japão).

Rastreio de genes-bicalutamida-resposta relacionada utilizando um lentivírus shRNA biblioteca

Thermo Scientific Abrir Biosystems Descodificar ARNi viral biblioteca Triagem (RHS5339) foi adquirido a partir de Thermo Scientific (Huntsville, AL, EUA). A tela shRNA foi realizada como descrito noutro local [1], [13], [14], [25]. Resumidamente, transduções foram realizados em placas de 100 mm de modo a que cada um shRNA foi representada com uma média de 100 cópias de modo a que a multiplicidade da infecção (M.O.I.) era igual a 0,3 para a integração única cópia mediana de cada shRNA. A infecção de células alvo em M.O.I. ≤0.3 foi confirmada por microscopia de fluorescência e de células activadas por fluorescência (FACS) 48 h após a infecção. As células LNCaP foram cultivadas em meio de crescimento contendo 1 uM bicalutamida ou veículo (0,1% de etanol) por 1 mês

Microarrays

O ADN genómico foi isolado a partir de células transduzidas utilizando o kit de purificação DNeasy (QIAGEN.; Tóquio, Japão) de acordo com o protocolo do fabricante. Os shRNAs integrados preparados a partir de DNAs genómicos LNCaP foram amplificados utilizando iniciadores (decodificar RNAi-GIPZ, genes anotados rastreio kit de selecção biblioteca-negativa a partir de Thermo Scientific) específica para os códigos de barras para o DNA de plasmídeo da biblioteca [13], [14], [25] . Os produtos de PCR foram purificados em gel utilizando o kit de purificação PCR QIAquick (Qiagen). Os fragmentos de ADN purificado (1,5 ug) de células LNCaP tratadas com veículo ou bicalutamida foram marcadas com cianina-3 (Cy3) ou cianina-5 corante (Cy5), respectivamente, utilizando o genoma de ADN enzimático Labeling Kit (Agilent; Santa Clara, CA, EUA) e purificado através da remoção de corantes de cianina não ligados com um filtro Microcon dispositivo centrífugo Ultracell YM-30 (Millipore Japão; Tóquio, Japão). hibridação microarray foi realizada utilizando o Kit de hibridação /chip-on-chip Oligo cDGH (Agilent). Agilent software Extractor recurso foi utilizado para digitalizar imagens de microarray. O número de acesso GEO para os dados microarray é GSE60382. A trama vulcão foi gerado pelo Agrupamento baseado em sondas. Empobrecido (dobre mudança 0,5;

P

0,01) os sinais nas células LNCaP tratadas com bicalutamida em comparação com as células tratadas com o veículo foram seleccionados como genes relacionados à resposta bicalutamida [23], [25], [26].

siRNA transfecção e análise western blot

Silencer selecionar siRNAs pré-concebidos visando os genes candidatos foram obtidos de Applied Biosystems (Foster City, CA, EUA) (Tabela 1). siRNA alvejando p53 (sip53: SC-29435) foi adquirido da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA). Um siARN controlo direccionamento do gene da luciferase (siLuc) e um controlo não segmentação de siRNA (siControl), sem homologia com os genes alvos conhecidos em células de mamífero foram obtidos a partir de ARNi (Tóquio, Japão). células LNCaP e BICR foram plaqueadas em placas de 6 poços a uma densidade de 100.000 células por poço e cultivadas durante a noite. As células foram transfectadas com ARNsi a uma concentração final de 10 nM utilizando Lipofectamina RNAiMAX (Invitrogen; Carlsbad, CA, EUA). eficiência knockdown de ARNip foi determinada por qRT-PCR utilizando ARN preparado a partir das células 48 h após a transfecção e normalizada com a da siControl. Para a análise de Western Blot, bicalutamida (1 uM) ou veículo foi adicionado ao meio de 12 h após a transfecção. Após 48 h, as células foram colhidas e lisadas em tampão de amostra a 100 ° C durante 15 min para electroforese em dodecil sulfato de sódio em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Os lisados ​​celulares foram resolvidas num gel de SDS-PAGE a 10% ou 15% e, em seguida, transferidos para membranas de difluoreto de polivinilideno (Millipore Japão). As membranas foram sondadas com um dos seguintes anticorpos primários: anticorpo anti-RPL31 (Abcam, Tóquio, Japão), anti-p53 (DO-7; LeicaBiosystems; Newcastle, UK), anti-MDM2 (SMP14; Santa Cruz Biotechnology), anti- p21 (C-19; Santa Cruz Biotechnology), e anti-Flag (M2, Sigma-Aldrich). As membranas foram então incubadas com peroxidase de rábano conjugado com anti-IgG de coelho (GE Healthcare; Buckinghamshire, Reino Unido) ou IgG anti-ratinho, e visualizada usando quimioluminescência aumentada (GE Healthcare). As membranas foram despojado e sondado com um rato-anti-β actina anticorpo. (AC-74; Sigma-Aldrich) como um controlo de carga [27]

A análise quantitativa PCR

LNCaP e células BICR foram transfectadas com ARNsi (10 nM) durante 48 h. O ARN total foi extraído das células utilizando o reagente Isogen (Nippon Gene; Tóquio, Japão). O ADNc da primeira cadeia foi sintetizado a partir de 2 ug de ARN total utilizando a transcriptase reversa SuperScript III (Invitrogen) com oligo (dT) 20 primers. qRT-PCR foi realizada num instrumento StepOnePlus (Life Technologies) usando o Fast verde SYBR Mistura Mestre (Life Technologies) e 150 nM de cada iniciador directo e específico para o gene reversa (Tabela S1). As condições dos ciclos foram 95 ° C durante 2 min, seguido de 40 ciclos a 95 ° C durante 2 segundos e a 60 ° C durante 30 s. As diferenças nas quantidades de produtos de PCR foram determinados pelo método de limiar de ciclo comparativo, utilizando-se desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato (

GAPDH) como um controlo interno [27], [28]. As experiências foram realizadas em triplicado. O Student

t

-test foi utilizado para a análise estatística, e um valor de probabilidade de

P

. 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

A proliferação celular ensaio

a proliferação celular foi avaliada utilizando um kit contendo o WST-8 ((2- (2-metoxi-4-nitrofenil) -3- (4-nitrofenil) -5- (2,4-dissulfofenil) -2H- tetrazólio, monossódico sal; Nacalai Tesque;. Kyoto, Japão) BICR, LNCaP, VCaP, e células 22Rv-1 foram semeadas em placas de 96 poços a densidades de 2,000, 4,000, 16,000, e 4000 células por poço, respectivamente, em meio de cultura, e transfectadas com ARNsi de segmentação quer um gene candidato ou luciferase (siLuc) (10 nM de cada) utilizando Lipofectamina RNAiMAX no dia 0. aos 12 h pós-transfecção, as células foram transferidas para meio de cultura contendo 1 uM bicalutamida ou veículo. nos pontos de tempo indicados após a transfecção, 10 mL de uma solução de reagente contendo o WST-8 foi adicionado a cada poço, e as células foram incubadas durante 2 h a 37 ° C. os valores de absorvância para cada poço foi medido a 450 nm num leitor Multiskan ELISA de Fc ( Thermo Scientific; Ulm, Alemanha) [23], [28]. Os resultados representativos de 3 experiências independentes são apresentados como média ± S.D. de poços triplicados. Estudante de

t

-Testes foram utilizados para análise estatística, e

P

. 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

A análise do ciclo celular

LNCaP e células BICR foram transfectadas com ARNsi (10 nM) durante 12 h. media as células “foram transformados em meios contendo bicalutamida (1 M) ou do veículo, e as células foram cultivadas durante um adicional de 36 h. As células foram lavadas uma vez com PBS e fixadas em 70% de etanol. Eles foram então lavadas duas vezes com PBS e tratados com 0,2 mg /mL de RNase A durante 30 min. Finalmente, elas foram coradas com iodeto de propídio /ml 5 ug (Sigma-Aldrich). As amostras foram quantificadas usando um FACScalibur (Becton Dickinson, Cockeysville, MD, EUA) com base no conteúdo de ADN, e os resultados foram analisados ​​com o software CellQuest (Becton Dickinson) para determinar as percentagens de células em G0 /G1, S e G2 /M fases [28], [29].

Bioinformatics

O banco de dados Oncomine é um banco de dados microarray câncer e plataforma de mineração de dados on-line que visa facilitar a descoberta da expressão de todo o genoma análise [30]. O banco de dados Oncomine (https://www.oncomine.org/resource/login.html) foi procurado genes candidatos que são regulados positivamente no cancro da próstata contra o tecido da próstata normal, pelo menos 2 vezes (

P 0,01). dados RNA sequenciamento do Programa do Genoma do Câncer Altas (TCGA) [31], [32] foram recuperados, e transcrito por milhão (TPM) valores para RPL31 foram utilizados como níveis do gene de expressão.

Assessments para a estabilização de proteína

BICR células foram transfectadas com siRPL31 ou siLuc (5 nM de cada) durante 12 h, cultivadas durante um adicional de 36 h em meio isento de ARNsi, e, em seguida, tratados com 50 ug /ml de cicloheximida. As células tratadas com cicloheximida para os pontos de tempo indicados foram sujeitos a análise de Western blot utilizando um anticorpo p53 [33], [34]. As membranas foram retirados e sondado com um anticorpo anti-actina β como um controlo de carga. Os níveis de proteína p53 foram quantificadas por densitometria e normalizadas para os níveis do correspondente β-actina.

Resultados

tela shRNA para identificar moduladores da resposta bicalutamida

Para identificar candidato genes envolvidos na resposta bicalutamida no cancro da próstata, foi realizada uma triagem funcional através da infecção de células de LNCaP com uma biblioteca de shRNA lentiviral que composta ~10,000 shRNAs com códigos de barras único, seguido de um mês de cultura de células na presença de 1 uM bicalutamida ou veículo ( Figura 1A). Nas telas de proliferação de células reunidas em tratamento bicalutamida, células infectadas com shRNAs contra genes envolvidos na resistência bicalutamida seria removido a partir da população de células ao longo do tempo. Cromossomicamente integrados shRNA foram amplificadas por reacção em cadeia da polimerase (PCR) utilizando ADN genómico preparadas a partir de células bicalutamide- e tratados com veículo, e quantificada utilizando um microarray feito por medida [25], [26]. Considerando shRNAs que estavam presentes várias vezes ou direccionados para os genes hipotéticos, tratamento bicalutamida reduzida a expressão de 25 shRNAs que pode ter como alvo genes convencionais ( 0,5 vezes a um limiar de

P

0,01) em comparação com tratamento com veículo, como mostrado na análise de dispersão de vulcão (Figura 1B e Tabela 1). Esta análise de despistagem shRNA foi útil para extrair genes que foram supostamente envolvidos na resistência bicalutamida.

(A) Representação esquemática da triagem shRNA. As células LNCaP foram infectadas com uma biblioteca de shRNA lentiviral e ainda cultivadas com ou sem bicalutamida durante 1 mês. Quantidades individuais integradas shRNA foram quantificados por microarranjo. (B) enredo Vulcão de dados de microarranjos, como gerado por Clustering baseado em sondas que foram enriquecidos ou empobrecido (dobre mudança 0,5;

P Art 0,01) em células tratadas com bicalutamida em comparação com células tratadas com o veículo .

Validação de genes candidatos

para avaliar os efeitos dos genes individuais selecionados por triagem shRNA sobre a biologia de células de câncer de próstata, a eficácia knockdown da disponíveis siRNAs alvejado a 19 dos 25 genes candidatos foi avaliada por-PCR quantitativa de transcrição reversa (qRT). Treze dos 19 siRNAs reduziu a expressão dos seus genes-alvo correspondentes, por 37-94% (Tabela 1). Em seguida, o efeito destes ARNic sobre a proliferação celular em células resistentes a bicalutamida LNCaP (BICR) foi avaliada utilizando o ensaio de proliferação celular WST-8 (Figura 2). Os resultados indicaram que o silenciamento de

RPL31, HIST1H2BD

, e

ADAMTS1

significativamente reprimido a proliferação celular em células BICR por . 50% em relação ao controle siRNA inibição

O crescimento de células BICR por siRNA segmentação

RPL31

(siRPL31),

HIST1H2BD

(siHIST1H2BD), e

ADAMTS1

(siADAMTS1) foi mostrado. As células foram transfectadas com 10 nM de ARNsi no meio de cultura. Doze horas após a transfecção, as células foram, então, cultivados em meio contendo 1 uM bicalutamida. WST-8 ensaios de proliferação celular foram realizadas nos pontos de tempo indicados após a transfecção. A absorvância dos poços nas placas foi medida utilizando um leitor de microplacas a 450 nm. Os dados são apresentados como a média ± S.D. (N = 3; *,

P Art 0,05; **,

P Art 0,01).

expressão regulada de

RPL31, HIST1H2BD

, e

ADAMTS1

em células BICR

em seguida, avaliamos os níveis de

RPL31, HIST1H2BD

, e

ADAMTS1

mRNA expressão em LNCaP e BICR células por qRT-PCR. Estes três genes foram sobre-expressos em células substancialmente BICR em comparação com células LNCaP parentais (Figura 3A). Para explorar se

RPL31, HIST1H2BD

, e

ADAMTS1

níveis de expressão foram alteradas em amostras de câncer de próstata clínicos, avaliou o status expressão destes genes com base no conjunto de dados microarray Oncomine [30]. Em uma comparação de amostras de carcinoma da próstata e amostras de próstata normais, com um limite de pelo menos uma alteração de 2 vezes (

P

0,01) (Figura 3B),

RPL31

regulação positiva foi observada em o estudo realizado por Tomlins e colegas [35]. Em um estudo de RNA-sequenciamento integrado no The Cancer Genome Atlas [31], [32],

RPL31

expressão foi também elevada em cancros da próstata em comparação com os tecidos da próstata normais (Figura 3C). Para

HIST1H2BD

, regulação positiva foi mostrada em um conjunto de dados, enquanto que a regulação negativa foi mostrado na outra (dados não mostrados). Além disso,

ADAMTS1

expressão foi reduzido no cancro da próstata em alguns conjuntos de dados (dados não mostrados). Estes resultados sugerem que

RPL31

desempenha um papel na progressão do câncer de próstata, incluindo a resistência bicalutamida. Para estudar os efeitos inibidores do crescimento de células de siRPL31 em várias células de cancro da próstata, VCaP, células 22Rv-1, e LNCaP foram analisadas usando um ensaio de WST-8. siRPL31 reprimida proliferação destas células (Figura S1).

(A) Os níveis de expressão de

RPL31

,

HIST1H2BD

, e

ADAMTS1

mRNA avaliadas por quantitativa de transcrição reversa-análise de PCR (qRT-PCR) com iniciadores específicos para o gene. Os dados são normalizados para

GAPDH Comprar e apresentados como média ± DP (N = 3; **,

P Art 0,01). (B)

RPL31

mRNA é expresso abundantemente em tecidos de carcinoma da próstata clínicos em comparação com os tecidos normais da próstata (em 2 vezes)., Como recuperado a partir de conjuntos de dados por Tomlin

et ai na

banco de dados Oncomine [30]. Normal: o tecido da próstata normal, PCA: cancro da próstata, PIN: neoplasia intraepitelial prostática. (C)

RPL31

expressão do mRNA é elevada em amostras de câncer de próstata clínicos

contra

amostras normais em um estudo de RNA-seqüenciamento na análise do Genoma do Câncer [31], [32].

RPL31

regula-ciclo celular progressão

Entre os siRNAs examinada, si

RPL31

foi o mais eficaz em reprimir a proliferação celular BICR. Por isso, investigamos ainda mais o papel fisiopatológico da

RPL31

em células de câncer de próstata. análise do ciclo celular de células BICR revelaram que

RPL31

knockdown aumentou a proporção de células na fase G0 /G1, enquanto diminui a proporção em fase S, em comparação com o controlo siLuc tratamento (Figura 4A e 4B) significativamente.

RPL31

knockdown também induzidos ciclo celular em seu perfil alterações semelhantes em células LNCaP (Figura 4C e 4D). Estes resultados indicam que

RPL31

knockdown progressão do ciclo celular de células substancialmente suprimida BICR, bem como células LNCaP.

(A) Queda de

RPL31

em células BICR aumentou a proporção de células em G0 /G1 e diminuiu a proporção de aqueles em fase S. As células foram transfectadas com siRPL31 siLuc ou em meio de cultura durante 48 h. As células foram então lavadas com PBS, coradas com iodeto de propídio, e sujeitas a análise de FACS. (B) As percentagens de células BICR em S, G0 /G1, G2 e fase /M foram determinados utilizando o software CellQuest e são apresentados como média ± S.D. (N = 3; *,

P Art 0,05; **,

P Art 0,01). (C) Queda de

RPL31

diminuiu a proliferação de células LNCaP. As células foram tratadas do mesmo, tal como descrito em (A). (D) As percentagens de células de LNCaP em S, G0 /G1 e G2 /M fases foram determinadas utilizando o software CellQuest e são apresentados como média ± S.D. (N = 3; **,

P Art 0,01).

RPL31 modula a expressão de p53 e MDM2, bem como p53 degradação de proteínas

Para elucidar os mecanismos subjacentes do papel de RPL31 na progressão do ciclo celular de células de cancro da próstata, examinámos o efeito de

RPL31

knockdown sobre a expressão de reguladores do ciclo celular, incluindo p53, MDM2, e p21. Curiosamente, os níveis de proteína do gene supressor tumoral p53 [19], [29], [36] – [40] e os seus-ciclo celular a jusante de p21 regulador negativo [20] foram reforçadas por

RPL31

knockdown em células BICR e células LNCaP (Figura 5A). A expressão da proteína MDM2, uma E3 ubiquitina ligase segmentação p53 conhecido [21], [36], [37], foi também reforçada em cima

RPL31

knockdown.

(A) Knockdown de RPL31 aumenta p53, MDM2, e a expressão da proteína p21. células LNCaP e BICR foram transfectadas com siRPL31 ou siLuc durante 48 h. Os extractos celulares foram sujeitos a SDS-PAGE e análise Western blot utilizando os anticorpos indicados. (B) RPL31 regulada a degradação da proteína p53. BICR células foram transfectadas com siRPL31 ou siLuc durante 60 h e tratou-se com 50 ug /ml de ciclo-heximida (CHX) durante o tempo indicado. Os extractos celulares foram analisados ​​por transferência de Western. (C) os níveis de proteína p53 foram quantificadas por densitometria e normalizadas para os níveis da proteína correspondente β-actina e apresentados como média ± S.D. (N = 3; *,

P Art 0,05).

Em seguida, avaliou se

RPL31

silenciamento influenciado a degradação da p53 em células de câncer de próstata. Os níveis de proteína de p53 foram quantificadas por análise de Western blot em células tratadas com BICR

RPL31

siRNA e ciclo-heximida, um inibidor da síntese de proteínas (Figura 5B). Os níveis de proteína p53 foram normalizadas para os níveis do correspondente β-actina, utilizando densitometria (Figura 5C). p53 foi estabilizada mais em

RPL31

-silenced células BICR do que em células tratadas com siLuc.

p53 medeia parcialmente os efeitos celulares de RPL31

A seguir, examinou os efeitos de

RPL31

knockdown no

p53

e

MDM2

níveis de expressão de mRNA em BICR e células LNCaP parentais.

p53

níveis de mRNA não foram aumentados em células BICR e LNCaP depois

RPL31

knockdown (Figura 6A, figura S2). Esta descoberta sugere que

RPL31

silenciar a expressão da p53 regulada no nível de proteína. Em contraste,

MDM2

e

p21

níveis de mRNA foram aumentadas em cima

RPL31

knockdown em células BICR e LNCaP (Figura 6A, figura S2), de acordo com a regulação positiva destes proteínas em ambas as linhas celulares (Figura 5A).

(A) os efeitos de knockdown RPL31 p53 e MDM2 e sobre ARNm de p21. BICR células foram transfectadas com siRPL31, sip53, siRPL31 mais sip53, ou siLuc. qRT-PCR para RPL31, p53, MDM2, e mRNAwas p21 realizada. As experiências foram realizadas em triplicado; a expressão de ARNm é normalizado para GAPDH e apresentados como média ± S.D. (N = 3; **,

P Art 0,01). (B) sip53 parcialmente cancelada a repressão do crescimento celular induzida por siRPL31. BICR células foram transfectadas com 10 nM de cada siRPL31, sip53, siRPL31 mais sip53 ou siLuc, e cultivadas com o meio contendo 1 uM bicalutamida. ensaio de proliferação celular WST-8 foi realizada nos pontos de tempo indicados. As absorvâncias dos poços das placas foram medidas utilizando um leitor de microplacas a 450 nm, um. Os dados são apresentados como a média ± S.D. (N = 4; **,

P Art 0,01).

Nós ainda verificado se p53 contribuiu substancialmente para a inibição do crescimento mediada pela

RPL31

silenciamento . É notável que RPL31 regulação positiva de knockdown mediado pelo

MDM2

e

p21

mRNA em células BICR foi significativamente reduzida em knockdown p53 em combinação com RPL31 knockdown (Figura 6A). Os efeitos destes ARNic sobre a proliferação celular BICR foram avaliados utilizando o ensaio de WST-8 (Figura 6B). Os resultados indicaram que

p53

e

RPL31

knockdown parcialmente o aumento da proliferação celular em comparação com

RPL31

knockdown sozinho na presença de bicalutamida. Em células LNCaP, combinação de sip53 e siRPL31 também reverteu parcialmente os efeitos da siRPL31 no

MDM2

e

p21

níveis de expressão de mRNA, assim como o crescimento celular (Figura S2). Em seguida, examinaram o efeito da utilização de siRPL31 combinatória e sip53 no perfil do ciclo celular de células BICR (Figura S3). knockdown dobro do

RPL31

e

p53

aumentou a proporção de células em fase S em comparação com

RPL31

knockdown sozinho.

Nós gerado células LNCaP que expressam exógena RPL31 por transfecção estável para examinar o efeito da sobre-expressão da proteína p53 em RPL31 (Figura S4A). É relatado que a proteína p53 é estabilizada por uma droga docetaxel quimioterapia em células LNCaP [41]. Foram examinados os níveis de proteína p53 nesta situação e descobriu que os níveis de proteína p53 foram diminuídas nas células que sobre-expressam LNCaP RPL31 comparada com a de células que expressam o vector (Figura S4B). Estas experiências ganho-de-função também indicaram que RPL31 poderia regular negativamente os níveis de expressão da proteína p53. Além disso, examinamos se a expressão RPL31 é regulada por bicalutamida (Figura S5). Nomeadamente, foi demonstrado que a bicalutamida mais fortemente induzida a expressão do mRNA RPL31 em células BICR do que em células LNCaP, uma vez, às 24 e 48 h após o tratamento bicalutamida, os níveis de ARNm RPL31 eram significativamente maiores nas células BICR do que as células LNCaP (

P

. 0,01)

Discussão

no presente estudo, foram identificados genes que modulam a resposta bicalutamida em células de câncer de próstata através de triagem funcional, utilizando uma biblioteca shRNA lentiviral combinado com experimentos de siRNA. Fora de ~10,000 shRNAs que foram transduzidas em células LNCaP, selecionamos um pequeno subgrupo de shRNAs com expressão substancialmente reduzida nas células após o tratamento bicalutamida de 1 mês. Dos 13 genes alvo do shRNAs selecionado, descobrimos que knockdown de

RPL31, ADAMTS1

, e

HIST1H2BD

proliferação significativamente inibido de células de câncer de próstata BICR. Estamos focados na caracterização de RPL31 proteína ribossômica na biologia do câncer de próstata, como silenciamento de

RPL31

substancialmente reduzida progressão do ciclo celular de células BICR. Verificou-se que o nível de

RPL31

ARNm foi significativamente elevado em comparação com células BICR células LNCaP, e estudos clínicos mostram que a expressão de expressão RPL31 no carcinoma da próstata é mais elevada do que em tecidos da próstata benigna. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que RPL31 contribui positivamente para o desenvolvimento e fenótipo de câncer de próstata.

Nós procuramos determinar o mecanismo pelo qual

RPL31

knockdown severamente o crescimento preso células cancerosas da próstata BICR. RPL31 é um componente da subunidade grande do ribossoma em eucariotas [15], [17], [18], [42]. Porque o tratamento bicalutamida em células de cancro da próstata prejudica a síntese de RNA ribossómico [43],

RPL31

knockdown poderia agravar ainda mais a desregulação da função ribossómica na presença de bicalutamida. Além disso,

RPL31

knockdown pode mediar funções extraribosomal e modular a via da p53 supressora de tumores. funções Extraribosomal são outros do que a síntese de proteínas, incluindo a replicação do ADN, transcrição, reparação, splicing de ARN, o crescimento celular, apoptose, diferenciação e transformação celular [33] ações celulares, [34], [42], [44] – [49] . Em particular, a relevância das funções extraribosomal do crescimento celular e a divisão celular foi confirmada pela observação de que a deficiência destes processos upregulates p53 e provoca a paragem do ciclo celular [36], [37]. No presente estudo,

RPL31

knockdown aumentaram substancialmente os níveis de proteína de p53, p21 e MDM2. É também notável que RPL31 knockdown humedecido a degradação da proteína p53, por tratamento de ciclo-heximida. RPL31 regulação positiva de knockdown mediado pelo

MDM2

e

p21

mRNA será predominantemente regulada por p53, uma vez que foi significativamente reduzida em p53 siRNA.