Abstract

sinalização Wnt é uma via regulamentar crítico no desenvolvimento e na doença. Muito pouco se sabe sobre os mecanismos de sinalização Wnt no câncer de próstata, a principal causa de morte em homens. Uma análise quantitativa da expressão da proteína Wnt5a em matrizes de tecido humano, contendo 600 núcleos dos tecidos da próstata, revelou 50% de aumento em comparação com núcleos maligna benignas (

P

0,0001). Em um par correspondente de cancro da próstata e da linha de células normais, a expressão de proteína Wnt5a também foi aumentada. ondas de cálcio foram induzidos em células da próstata em resposta a Wnt5a com um aumento de 3 vezes na intensidade Flou-4. A atividade do Ca

2 + /calmodulina proteína quinase dependente (CaMKII), um transdutor da não-canônica Wnt /Ca

2 + de sinalização, aumentou 8 vezes em células cancerosas; não foi observada alteração na expressão β-catenina, que se sabe activar a via /β-catenina canónica Wnt. Mineração de conjuntos de dados humanos disponíveis publicamente fenótipos cancro da próstata revelou que a expressão de vários genes (por exemplo, CCND1, CD44), sob o controlo de transcrição β-catenina é regulada para baixo. Confocal e microscopia eletrônica quantitativa mostrou que a inibição específica de CaMKII em células de câncer provoca remodelação do citoesqueleto de actina, bordas da ferida irregulares e arquitetura intercelular solto e um aumento de 6 e 8 vezes na frequência e duração dos filopodios, respectivamente. Por outro lado, as células da próstata normais não tratados mostraram uma borda da ferida irregulares e arquitectura intercelular solta; incubação de células normais da próstata com Wnt5a recombinante induzida proteína remodelação da actina com uma borda da ferida regular e reforçada ferida capacidade de cicatrização. imagem de células vivas mostraram que uma consequência da inibição funcional CaMKII foi de 80% de decréscimo de capacidade de cicatrização de feridas e redução da motilidade celular em células cancerosas. Propomos que não canônica Wnt /Ca

2 + sinalização através de atos CaMKII como novo regulador da plasticidade estrutural e motilidade celular no cancro da próstata

Citation:. Wang Q, Symes AJ, Kane CA, Freeman Um, Nariculam J, Munson P, et al. (2010) um novo papel para Wnt /Ca

2 + Sinalização citoesqueleto de actina Remodelação e motilidade celular em câncer de próstata. PLoS ONE 5 (5): e10456. doi: 10.1371 /journal.pone.0010456

editor: Neil A. Hotchin, da Universidade de Birmingham, Reino Unido

Recebido: 19 de novembro de 2009; Aceito: 08 de abril de 2010; Publicado em: 04 de maio de 2010

Direitos de autor: © 2010 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi financiado pelo Instituto Nacional do Câncer Research e Prostate Cancer Research Center, Reino Unido. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Wingless /Wnt genes codificam para uma família de glicoproteínas segregadas que regulam muitos processos celulares [1], [2]. sinalização aberrante através de vias de sinalização Wnt está ligada a um número de doenças, incluindo o cancro [3] – [6]. sinalização Wnt ocorre via canônica (Wnt /β-catenina, CTNNB1) e não-canônica (Wnt /Ca

2 +) caminhos [3], [7]. Uma via Wnt menos bem descritas, é a via Wnt-JNK [8]. A sinalização através da via /β-catenina Wnt activa a transcrição de muitos genes, tais como ciclina Ds e as metaloproteinases de membrana (MMPs), através de TCF /LEF factores. Wnt /Ca

2+ via leva a um aumento no cálcio intracelular [9] e activação da proteína quinase dependente de calmodulina II (CaMKII) [10] e é conhecido por modular o movimento celular e comportamento [11], [12] e induz mudanças estruturais [11], [13], [14]. A ligação entre o aumento da sinalização β-catenina em tumorigénese e aumento da transcrição de genes envolvidos na transformação de células e proliferação estão documentados, no entanto, o papel não canónicas Wnt /Ca

2+ sinalização no cancro é apenas lentamente a ser elucidado [15] , [16].

contas de câncer de próstata para uma estimativa de 25% de todos os novos casos de câncer e é a segunda principal causa de mortes por câncer em homens [17]. Nem a expressão de proteínas Wnt nem os mecanismos de sinalização Wnt no cancro da próstata são entendidas [18]. Estudos anteriores concentraram-se na caracterização de receptores de Wnt, proteínas relacionadas com receptores e a expressão de genes Wnt [5], [19] – [21], em linhas celulares de cancro da próstata. interacção directa entre o receptor de androgénio (AR) e TCF para β-catenina e outros co-factores de transcrição, também foi sugerido [22]. No entanto, apenas uma pequena percentagem de amostras de cancro da próstata têm desregulado destruição complexa ou mutado β-catenina [18]. É provável, portanto, que outros mecanismos, talvez directamente relacionadas com a sinalização de Wnt, podem estar envolvidos

Recentemente, mostrou [23] que genes WNT5A (um dos 19 membros da família Wnt) a expressão do gene é aumentada ( 50 vezes) em tecido de cancro da próstata e células de câncer linhas devido à hipometilação. No entanto, questões importantes sobre a expressão Wnt5a e os mecanismos de sinalização mediada Wnt5a no câncer de próstata permanecem. Por exemplo, não sabemos (i) se o aumento no resultado de transcrição do gene WNT5A no aumento da expressão da proteína Wnt5a em tumores malignos? (Ii) Se a via de sinalização canônica ou não-canônico é ativado no câncer de próstata? (Iii) Qual é o papel funcional da sinalização Wnt no câncer de próstata? Para responder a estas questões foram testadas as seguintes hipóteses: (i) que a expressão da proteína Wnt5a é aumentada no cancro da próstata humana (ii) que sinalização de Wnt /β-catenina deve resultar num aumento da expressão de genes alvo TCF /LEF, como as MMPs e TIMP3 em cancro da próstata (iii) Activação de Wnt /Ca

2+ sinalização em células de cancro da próstata deve resultar num aumento na actividade da enzima CaMKII causando alterações no citoesqueleto e motilidade celular. Nós demonstramos pela primeira vez, que a expressão da proteína Wnt5a é aumentada na próstata humana maligna em comparação com tecido benigno e Wnt /Ca

2+ mecanismo de sinalização é activado em células de cancro da próstata. Nós também fornecemos nova evidência mecanicista de um papel crítico para CaMKII como um modulador do citoesqueleto de actina e motilidade celular no câncer de próstata.

Resultados

avaliação de RNA transcrito usando PCR em tempo real

Medimos os níveis de mRNA para genes WNT5A (Tabela S1), previamente identificados na nossa análise fenótipos ser desregulado nas células do câncer de próstata [23]. Genes WNT5A mRNA exibida uma magnitude similar de mudança (~ 50 vezes) em 1542-CP

células cancerosas 3TX em comparação com as células normais 1542-NPTX, seja medido utilizando fenótipos [23] ou PCR em tempo real (Tabela S1). transcrição genes WNT5A também é expresso em outras linhas de células de cancro da próstata e.g. PC3 e DU145 [19], [23].

expressão da proteína Wnt5a em malignos e benignos

próstata humana

3,3-diaminobenzidina (DAB) da etiqueta, o que representa a expressão Wnt5a, foi observada em ambos malignos e benignos núcleos de tecidos (Fig. 1A e B). Foram quantificados o rótulo, de uma maneira imparcial, usando uma análise de partículas reprodutível, semi-automatizado (Analisar Partículas) protocolo usando software ImageJ [24] depois de converter imagens RGB em 16 bit em tons de cinza (Fig 1C e D) a partir de 600 tecido da próstata indivíduo núcleos (ver Materiais e Métodos). parâmetros calculados de contagem, a área total, a dimensão média e fracção de área são dadas na Tabela S2. A integração da área sob a curva revelou um 55%, 25% e 45% de aumento na área total, dimensão média e fracção da área (área total /total de pixels), que representa a amplitude e a intensidade de coloração, em núcleos malignas (n = 301 ) em comparação com núcleos benignas (n = 299), respectivamente (Figura 1E, F e G), que foram altamente significativas (p 0,0001, teste t de Student). Estes resultados indicam que a expressão Wnt5a é aumentada em comparação com maligno da próstata humana benigna.

Representante maligna (A) e benigna (B) a partir de matrizes de núcleo tecido da próstata humana usadas para calcular a expressão Wnt5a (etiqueta DAB, castanho, largamente em células acinares). imagens RGB (A e B) foram convertidos em 16 imagens bits (C e D) para a quantificação do sinal DAB usando Analisar protocolo de partículas no software ImageJ obter Área Total manchado (E) e tamanho médio da partícula medida (F) , em pixel, e fração de área (G, área total dividido pelo total de pixels na imagem). expressão 5A Wnt foi aumentada em v núcleos benignas malignas (p 0,0001). Cada bin são dados para um indivíduo, maligna (vermelho, n = 301) ou benigno (verde, n = 299) do núcleo.

Mecanismos de Wnt-sinalização no cancro da próstata

a expressão da proteína Wnt5a também foi maior em 1542-CP

células cancerosas 3TX comparação com células normais pareados 1542-NPTX (Fig. 2A). Há também uma diminuição concomitante (2,5 vezes) em transcrito de ARNm de CTNNB1 e outros elementos de sinalização de Wnt /β-catenina (por exemplo, axina, DVL1, GSK3β) em células cancerosas em comparação com as células normais (Tabela S1). Antagonismo de β-catenina, devido à sobre-expressão de Wnt5a, que conduz a regulação negativa de alvo /β-catenina Wnt foi proposto anteriormente em melanoma [25] e embriões de Xenopus [11]. a expressão da proteína β-catenina, utilizando transferência de Western revelou uma única banda (~94kDa) de um modo dependente da concentração de proteína, em lisados ​​celulares de ambos CP-1542

3TX e 1542-NPTX células (Fig. 2B). A análise densitométrica revelou que não havia alteração na proteína β-catenina no cancro, em comparação com a linha celular normal (Fig. 2C). Além disso, de acordo com os nossos dados fenótipos [23] uma série de /β-catenina TCF mediada genes alvo transcrição Wnt mostrou diminuição da expressão de mRNA em células cancerosas (Tabela S3). Um exame detalhado em proteína e nível funcional de alvos selecionados de TCF /LEF transcrição (por exemplo MMP2, MMP14 e TIMP3) [26] confirmou estas observações. a expressão de ARNm para estes genes foi 3-10 vezes mais baixa em células cancerosas em comparação com as células normais (Tabela S1) suportados por imunofluorescência indirecta (Fig. S1). MMP-14 actividade deve reflectir o equilíbrio entre a MMP-14 catalítico e TIMP3 actividades de regulação. actividade de MMP foi 3 ± 0,06 vezes mais baixos nas células cancerosas usando zimografia de gelatina (Fig. S2). Estes resultados confirmaram que numerosos alvos da via de sinalização /β-catenina Wnt foram regulados negativamente no gene, a proteína ou o nível funcional.

Western blot de (A) a expressão da proteína Wnt5a, mostrando níveis mais elevados em 1542-CP

3TX (CP) células em comparação com 1542-NPTX células (NP). β-actina foi utilizado como um controlo de carga. (B) β-catenina (94kDa) expressão no lisado celular de 1542-CP

3TX e 1542-NPTX linhas celulares (GAPDH, 35 kDa, utilizada como um controlo de carga de proteína no mesmo blot). Análise (C) densitométrica foi efectuada utilizando o software comercial (GeneTools, quadros sinópticos, UK). NP (bar cheio) = 1542-NPTX e CP (barra vazia) = 1542-CP

3TX.

Análise da expressão gênica de metas CTNNB1 e TCF de transcrição /LEF, usando Oncomine [27 ] e de software GeneSpring e publicamente disponíveis conjuntos de dados de microarray para normal (não-neoplásica ou benigna)

vs tecido da próstata

cancro, mostraram que a expressão de quase todos os Wnt /β-catenina /TCF objectivos analisados, com excepção de c-myc , foi diminuída em cancro da próstata (Fig. S3). Estes resultados são similares àqueles para linhas de células de próstata e demonstram que o aumento mediado β-catenina em TCF transcrição não era susceptível de ser o mecanismo de sinalização Wnt no cancro da próstata. Por isso, testamos a hipótese de que, no câncer de próstata, a sinalização de Wnt é transduzido via Wnt /Ca

2 + via. Realizamos experimentos para determinar se Wnt5a induzida directamente liberação de cálcio em células da próstata. Adição do péptido induzida ondas de cálcio Wnt5a, durando até 100s, na linha celular de cancro da próstata com um aumento de 3,1 ± 0,1 (n = 12) vezes na intensidade de Flou-4 a partir da linha de base (Fig 3 e Filme S1).

um gráfico representativo da libertação de cálcio na linha de células de cancro da próstata (PC3) como uma função de Fluo-4 mudança de intensidade ao longo do tempo utilizando imagiologia confocal de células vivas. A linha verde representa a alteração na intensidade de Fluo-4 (linha verde) no controlo (A) (após a adição de veículo PBS) ou (B) de péptido Wnt5a recombinante (100 ng /ml). Houve um aumento de 3,1 vezes em 0,1 ± Fluo-4 após a adição de intensidade Wnt5a (n = 12). Em alguns experimentos Fura Red (linha vermelha) foi carregado com Fluo-4. A relação de mudança de Fluo-4 e Fura-vermelho é representada em (C).

atividade CaMKII e seu papel na plasticidade estrutural das células da próstata

CaMKII é um grande transdutor de Wnt /Ca

2 + sinalização. Em todas as linhas de células de próstata atividade da enzima CaMKII foi Ca

2 + dependentes, pelo menos em 1542-NPTX, maior em 1542-CP

3TX e DU145 e pronunciado na linha de células PC3 (Fig. 4). Houve um aumento de 4 e 8 vezes no Ca

2 + atividade CaMKII dependente in1542-NPTX e 1542-CP

células 3TX (Fig. 4), respectivamente. Mais importante, o Ca

2 + atividade dependente da CaMKII foi aumentado em ~ 4 vezes em 1542-CP

3TX comparação com 1542-NPTX (

inserir

Fig. 4). Estes resultados indicam um aumento na actividade de CaMKII em células cancerosas em comparação com células normais.

A actividade de fosfotransferase de CaMKII nos lisados ​​celulares foi medida utilizando um [γ-

32P] ATP ensaio baseado CaMKII ( Upstate, UK) com Ca

2 + (barras tracejadas) ou sem Ca

2 + (barras ocas).

Inset

: Ca

2 + atividade CaMKII dependente foi calculada como descrito em Materiais e Métodos. Os valores são média ± DP de 3 experiências. NP is1542-NPTX, CP is1542-CP

3TX, DU é DU145 e PC é a linha de células de próstata PC3.

Para investigar o papel da sinalização Wnt no citoesqueleto de actina das células da próstata normais e cancerosas , utilizou-se um ensaio de ferida /scratch em combinação com microscopia eletrônica confocal e digitalização e imagens de células vivas. Em primeiro lugar, foi observado o bordo de ataque da ferida para a actina-remodelação, utilizando microscopia confocal após coloração com faloidina marcada com fluorescência. Em 1542-CP

células 3TX a ponta da ferida, a 4 h após o ferimento, mostrou, coloração de actina regular, liso, com células que aparecem em um lamellipodia como a formação (Fig. 5A). Em 1542-NPTX células a borda da ferida foi irregular, com morfologia das células individuais, alguns com filopódios bem como estruturas visíveis em 4 h (Fig. 5B).

As células foram feridos e coradas com fluoresceína phalloidin- -5-isotiocianato (FITC, verde) para visualizar os filamentos de actina, utilizando uma Leica confocal SP2 microscópio. A, B e G são células CP-1542

3TX, 1542-NPTX e PC3 não tratados, respectivamente. C, D e H são AIP (10 uM) tratados 1542-CP

3TX, 1542-NPTX células e PC3, respectivamente. E e F são 1542-CP

3TX e 1542-NPTX tratada com Wnt5a recombinante (100 ng /ml). Irregular de ponta ferida e solta de conexões intercelulares e finos filamentos de actina (filopódios como saliências), setas brancas, são visíveis em 1542-NPTX células normais e após o tratamento AIP em

células 3TX e câncer PC3 1542-CP. iodeto de propídio foi utilizado para corar o ácido nucleico (vermelho). Barra de escala = 10 mm

A seguir, testou as seguintes hipóteses: (i) inibição da CaMKII deve perturbar a ferida (ii) a ativação do Wnt5a sinalização em 1542-NPTX células de ponta em linhas celulares de cancro da próstata deve promover a remodelação da actina da ferida como observado em 1542-CP

células 3TX. Usamos peptídeo com ácido mirístico relacionados com autocamtide-2 inibitória (AIP), um inibidor de CaMKII, e a proteína recombinante Wnt5a (para activar a sinalização de Wnt) em células normais e cancerosas para testar essas hipóteses (Fig. 5). A microscopia confocal de feridos monocamada /riscado de 1542-CP

células 3TX incubadas com AIP (10? M) apresentou interrompido, ferida de ponta irregular com filopódios fina (Fig. 5C, setas) em comparação com borda da ferida regular em células não tratadas (Fig . 5A). O bordo de ataque de células feridas 1542-NPTX com ou sem AIP mostrou uma borda irregular, com célula solta de contacto das células e saliências finos filamentos de actina (Fig. 5B e D). Estas micrografias indicam que a inibição da CaMKII em 1542-CP

células cancerosas 3TX induzir filopódios como saliências. Por outro lado, ferido 1542-NPTX células normais, incubadas com a proteína Wnt5a recombinante (100 ng /ml), mostrou um bordo de ataque normal (Fig. 5E) da ferida em comparação com o controlo não tratado (Fig. 5B). Não foi observada diferença aparente na borda da ferida principal para não tratado vs proteína Wnt5a incubadas 1542-CP

células 3TX (Fig. 5A e F).

Para validar que a remodelação da actina foi mediada por CaMKII e não via outras quinases (por exemplo, CaMKIV, PKA, PKC, Raf ou MAPK1, JNK1α1, ou Raf), utilizou-se tatCN21a, um inibidor específico de CaMKII [28]. 1542-CP

células 3TX tratados com 5 M de tatCN21a mostrou bordas da ferida irregular, células solto para contato celular e formação filopódios (Fig. S4) como a observada com AIP (Fig. 5). Inibição de CaMKII também induzido, borda da ferida irregulares, afrouxamento da célula para contacto célula e filopios em outras linhas de células de cancro da próstata, incluindo PC3 (Fig. 5G e H e A Fig. S5), DU145 (Fig. S6) e a linha celular LnCaP sensível androgénio (Fig. S7).

O mecanismo pelo qual a inibição CaMKII causada formação filopódios em células de câncer de próstata foi considerada próxima. Utilizou-se microscopia eletrônica de varredura para quantificar o filopódios como estruturas (Fig. 6). micrografias eletrônicas de varredura baixa ampliação de 1542-CP

células 3TX mostrar bordas da ferida regulares e irregulares em não tratada (

inserir

Fig. 6A) e as células AIP tratados (

inserir

Fig. 6B ). As imagens de alta ampliação mostram claramente numerosos e estendeu filopódios bem como projeções da membrana celular (Fig. 6B) em AIP tratada 1542-CP

células 3TX em comparação com células não tratadas (Fig. 6A). Inibição de CaMKII com AIP causou um efeito semelhante em linhas celulares PC3 (Fig. 5H e a Fig. S5B). A frequência ea duração do filopódios foi medida manualmente usando software ImageJ. Um ajuste gaussiana do histograma de distribuição de comprimento de tratada e não tratada 1542-CP

células 3TX revelou um aumento de 8 vezes no comprimento e um aumento de 6 vezes no número total de filopios como saliências em AIP tratados em comparação com não tratada 1542-CP

3TX células (Fig. 6C e Tabela 1). O histograma pode ser montado para, pelo menos, dois comprimentos de filopios como saliências em 1542-CP

sub células 3TX: tempo (até 2 mm) e muito longo ( 2 pM). Outras análises mostraram que houve um aumento de cinco vezes em comprimento, mas um aumento muito maior (15 vezes) da frequência dos muito longos protuberâncias em células AIP tratado, em comparação com células não tratadas (Tabela 1). Estes resultados confirmam um papel importante para CaMKII mediada sinalização Wnt na remodelação da actina no cancro da próstata, diminuindo a duração ea frequência das filopódios.

Principais imagens são imagens representativas (barra de escala de 1 mm) de não tratada (A) e AIP (10 uM) tratada células (B). Inset é a imagem baixa ampliação (barra de escala de 10 mm) da imagem principal. borda da ferida irregular e filopódios bem como protrusão são visíveis após o tratamento com AIP (B, imagem principal). Comprimento de filopios como saliências foi medida usando o software Image J. e convertidas em células histograma de distribuição (C) para AIP tratados (barras ocas) e não tratados (barras sombreadas). Observou-se um aumento de 8 vezes na área sob a curva para tratados em comparação com células não tratadas usando um ajuste de Gauss.

implicações funcionais de Wnt /Ca

2 + Sinalização de próstata células cancerosas

citoesqueleto desempenha um papel integral na motilidade celular. Para investigar as possíveis manifestações de alterações do citoesqueleto testamos a hipótese de que a inibição CaMKII diminui a motilidade celular em linhas celulares de cancro da próstata. Utilizou-se o ensaio de ferida zero e imagens de células vivas com Incucyte (Essen Instruments) para calcular a taxa de fechamento da ferida como uma medida da motilidade celular. A taxa de fechamento da ferida foi reduzido em 80% em linhas celulares de cancro PC3 tratadas com AIP (Fig. 7 e Filme S2, controle e Filme S3, AIP).

linhas celulares de cancro da próstata PC3 confluentes foram feridos e fotografada durante a noite em intervalos de 1h. As imagens foram compostas (ver filmes S2, controle e S3, AIP) e os dados importados para uma folha de cálculo. Além da AIP (10 mM, bar chocado) reduziu a taxa de fechamento da ferida em 80% em relação ao controle (barra oca, * p 0,001) ou Wnt5a (100 ng /ml, barra sólida). Os dados são apresentados como médias ± EP, de significância de diferença entre o controlo e AIP foi obtido por ANOVA. Taxa de fechamento da ferida foi determinada através da realização de regressão linear para calcular o declive da linha (

Inserção

, representativo de n = 6-7) para o controlo não tratado (triângulos a cheio,

R

= 0,99) , Wnt5a (quadrados preenchidos,

R

= 0,99) ou AIP (círculo preenchido,

R

= 0,97) células PC3 tratadas.

Discussão

expressão e mecanismos de sinalização Wnt Wnt continua a ser uma área pouco investigada na próstata. Nós demonstramos que a expressão de (i) proteína Wnt5a é aumentada em comparação com o tecido maligno da próstata humana benigna e cancro em linhas celulares, em comparação com o normal. (Ii) Wnt5a é importante transdutor de sinalização Wnt através da activação de Wnt /Ca

2 + via Wnt e não via /β-catenina em células da próstata. (Iii) Activação de CaMKII é um novo e crucial regulador do citoesqueleto no cancro da próstata. (Iv) inibição CaMKII diminui significativamente a motilidade celular e a capacidade de cicatrização de feridas em linhas celulares de cancro da próstata.

Uma compreensão das bases moleculares do câncer de próstata, e o papel desempenhado pela sinalização redes como Wnt-caminho, requer não só uma descrição completa da expressão do gene e da proteína no tecido da próstata humana, mas também um sistema de célula com a qual para investigar os mecanismos de sinalização e as suas consequências funcionais na doença. As nossas investigações de arranjo de tecido da próstata mostram que houve uma correlação altamente significativa (p 0,0001) aumentar tanto na área total (extensão) e o tamanho médio das partículas marcadas (intensidade) e fracção da área (Figura 1E, F e G e A Tabela S2) . Estes resultados suportam as observações anteriores do aumento na expressão de gene Wnt5a no cancro da próstata devido a hipometilação [23] e também um relatório muito recente por Yamamoto

et um

l [29] que é utilizado convencional, não-quantiative , exame histológico para avaliar Wnt5a expressão da próstata. Esses dados também está de acordo com o obtido para normal (1542-NPTX) e câncer (1542-CP

3TX) linhas celulares (Fig 2). Tomados em conjunto os dados de tecidos e linha de células humanas sugerem que a proteína Wnt5a é expressa em tecidos normais (ou benigna), mas a sua expressão é dramaticamente aumentada em (cancro) tecido prostático maligno e esta alteração reflecte-se nas linhas de células utilizadas neste estudo

Quase todos os alvos de transcrição conhecidos ativados pela via /β-catenina Wnt, por exemplo, CTNNB1, CCCNDs, MMPs, PITX2, CD44, APCDD1, junho [30] – [32], permanecem inalteradas ou estão sub-regulada no tecido ou célula linhas de câncer de próstata em comparação com o tecido normal ou linha celular (Fig. S3 e Tabela S1) . Estes resultados indicam que o conjunto de dados de linha celular reflecte, em grande parte o padrão de expressão do gene de TCF /LEF genes regulados tanto a linha de células e o tecido de cancro. Além disso, não houve aumento na expressão da proteína ou da actividade funcional de alvos a jusante de sinalização de Wnt-canónica (por exemplo, MMP-14). Isto sugere que a 1542-NPTX e 1542-CP

3TX e linhas celulares PC3 pode ser um modelo útil para investigar os mecanismos de sinalização Wnt no cancro da próstata, como a integridade de Wnt elementos em cancro da próstata de sinalização são conservados nestas linhas celulares pelo o gene, proteína e níveis funcionais.

CaMKII é um mediador chave da Wnt /Ca

2 + sinalização embora um subconjunto adicional da sinalização Wnt não-canônico via Wnt5a se propõe a ser um β-catenina via de degradação, que não necessitam de activação de CaMKII [33]. Um aumento de 3 vezes na concentração de cálcio intracelular livre foi observada após adição de Wnt5a em células da próstata (fig 3 e Filme S1). Além disso, nós não ver uma diminuição na expressão da proteína β-catenina e a atividade de CaMKII foi encontrado para aumentar em linhas celulares de cancro da próstata, indicando que Wnt /Ca

2 + via era susceptível de ser operativa via CaMKII na próstata cancer

Os múltiplos papéis de CaMKII na remodelação da actina, motilidade celular e migração dos queratinócitos normais, músculos e células nervosas são conhecidos [34] – [36].. No entanto, o envolvimento de CaMKII mediada Wnt /Ca

2 + Sinalização doença tem sido menos bem caracterizado. Pukrop

et al [37] sugeriram que a via não-canónico pode estar envolvida no aumento da migração /invasividade de linhas celulares de cancro da mama MCF7, quando Wnt5a recombinante é adicionada à cultura de células. No entanto, os mecanismos ou se Wnt5a mediada seu efeito através da ativação CaMKII, não foram investigados. motilidade celular requer dois tipos principais de estruturas baseadas em actina na membrana da célula, e lamelip�ios filopios. Foi proposto, em fibroblastos, que a formação de filopodia lamelip�ios é um processo fortemente regulado que é parcialmente controlado por proteínas de ligação a actina, tal como activado fosfoproteína estimulada vasodilatador (Ena) /(VASP) capping o filamento de actina [38]. Fibroblastos mover estendendo lamellipodia na vanguarda e formação de estruturas de actina finas na vanguarda provoca movimento retrógrado [39]; seqüestro de Ena /VASP para mitocôndrias aumenta, enquanto que a sua segmentação a membrana celular diminui a motilidade [38]. O papel da sinalização mediada Wnt5a na motilidade celular [37] e outras proteínas intermediários (por exemplo Ena /VASP, Arp2 /3) na formação de filopodia foi investigada em [14], [40] e [41] as células de melanoma de ratinho humanos. Weeraratna e colegas [40] sugeriram que Wnt5a aumento da motilidade celular em linhas celulares de melanoma humano por activação da proteína cinase C (PKC). Witze

et al

[14] mostraram que a resposta aguda de linhagens de células de melanoma para Wnt5a envolve o recrutamento das principais proteínas do citoesqueleto (actina e myoxin IIB) e Frizzled 3 e molécula de adesão de células de melanoma em uma estrutura intracelular através da regulação Wnt5a de Rab4 e RhoB guanosina trifosfatases. Outro estudo investigou o papel de Ror2 quinase na migração celular induzida Wnt5a [42]. Ao contrário dos dados aqui apresentados, esses estudos [40], [42] não investigou nem manipulado diretamente atividade CaMKII em seus experimentos ou investigado o seu papel na formação filopódios. Utilizou-se tatCN21a, um inibidor específico de CaMKII (mas não CaMKIV, PKA, PKC, MAPK1, JNK1α1, ou Raf). O tratamento de células de cancro da próstata com tatCN21a também causou um afrouxamento da célula para contacto das células e formação de filopodia induzida (Fig. S4) semelhante aos resultados obtidos com AIP (Fig. 5). Estes resultados indicam que a inibição directa de CaMKII (e não CaMKIV, PKC, PKA e outras quinases) resulta na perda de célula para célula e a formação de contacto filopios em células de cancro da próstata.

Em linhas celulares de cancro da próstata (1542 -CP

3TX e PC3) uma superfície lisa e regular borda da ferida é observado com células perto de contato celular anterior à lamellipodia como de ponta (Fig. 4 e 5). Em contraste, o tratamento com AIP induz um aumento na filopodia como saliências com um afrouxamento da célula para contacto célula anterior à extremidade da ferida (Fig. 5 e 6 e Tabela 1). Com efeito, a taxa de fechamento da ferida foi reduzido em 80% após a inibição de CaMKII na linha celular de cancro (PC3). Por outro lado, a adição de Wnt5a a linha celular normal (1542-NPTX) aumentou a taxa de encerramento de feridas (pM /h) em comparação com células não tratadas em 25 ± 4%. Sugerimos que a ativação de CaMKII via de sinalização Wnt5a é vantajoso para a mobilidade de células de câncer, uma vez que suprime a formação de filopódios fina que induzem movimento retrógrado reduzindo, assim, a mobilidade celular.

A expressão de proteínas de Wnt5a no cancro da próstata humana e mecanismos de sinalização Wnt em linhas de células normais e de cancro da próstata, descritos aqui, fornecer o primeiro quadro no qual a participação exacta dos receptores Wnt e secretora frizzled proteínas relacionadas com [20], [21] e várias proteínas de ligação a actina e intermediários moléculas de sinalização, tais como Ena /VASP e ERK1 [34], [38], poderia ser investigado no câncer. Investigações adicionais para identificar o receptor (s) para a ligação Wnt5a e outras proteínas envolvidas na sinalização a jusante através de CaMKII na motilidade celular no cancro da próstata irá ajudar a elucidar o papel romance de CaMKII na supressão da formação de filopios para aumentar a motilidade celular no cancro da próstata . Em conclusão, a partir dos resultados apresentados aqui e nosso estudo recente [23] mostrando hipometilação como um regulador da transcrição de genes Wnt5a na próstata, poderia prever-se a seguinte sequência: (i) A expressão gênica de Wnt5a é aumentada em câncer em comparação com as células normais devido a hipometilação da região do promotor do gene da (ii) aumento nos resultados de expressão de genes no aumento da expressão de proteínas de Wnt5a no cancro da próstata humana (iii) Wnt /Ca

2+ via (e não via β-catenina) é activado no cancro da próstata células (iv) sinalização via Wnt /Ca

2 + via ativa CaMKII (v) a atividade CaMKII, mais provavelmente através de sinalização intermediário envolvendo proteínas se ligam à actina, provoca uma reorganização de citoesqueleto em células cancerosas, diminuindo a duração ea frequência de multa , filopódios como estruturas de actina. (VI) pode ser notada Citoesqueletal devido a CaMKII provoca um aumento da motilidade celular. Segmentação de Wnt /Ca

2 + de sinalização, especialmente CaMKII pode fornecer uma ferramenta útil na terapia do cancro da próstata.

Materiais e Métodos

cultura celular

A próstata humana células epiteliais line1542-NPTX e linha celular de cancro da próstata 1542-CP

3TX [43] (derivadas a partir de tecido normal e cancro da próstata a partir do mesmo paciente [43]) foram obtidos a partir de SL Topalian, National Cancer Institute, NIH, EUA, originadores destas linhas celulares. carcinoma da próstata PC3 linha celular foi obtida a partir de M E Kaighn os originadores de esta linha de células [44]. DU145 foi obtido a partir do banco de células mantidas por Jørgen Fogh no Sloan Kettering Cancer Center, Nova Iorque, EUA, a partir de um depósito feito por o originador da linha de células [45]. PC3 e DU145 foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Invitrogen) contendo 5 mM de L-glutamina e soro fetal de bovino (FBS) e 1542-NPTX e médio 1542-CP

3TX foram mantidas em queratinócitos-SFM (KSFM) e suplementos ( Invitrogen) com 5% de FBS e suplementos KSFM (Invitrogen).

quantitativo em tempo real PCR

Fluorescent PCR em tempo real (TaqMan, Applied Biosystems, UK) foi utilizado para verificar a expressão do gene em 1542 -NPTX e 1542-CP

3TX inicialmente identificado a partir dos experimentos de microarray [23]. Isolamento de ARN é descrito noutro local [23]. As sondas TaqMan e iniciadores para a PCR em tempo real foram adquiridos como um sistema de ensaio pré-desenvolvido; Applied Biosystems IDs de ensaio para as sondas utilizadas e uma breve protocolo é dada na Tabela S4.