Abstract

Fundo

A terapia fotodinâmica (PDT) utiliza a combinação de fotossensibilizantes drogas e luz inofensiva para causar danos selectivos para células tumorais. PDT é, portanto, uma opção para a terapia focal da doença localizada ou para tumores de outra forma não ressecáveis. Além disso, há evidências crescentes de que a TFD pode induzir a imunidade anti-tumoral sistémica, apoio ao controlo das células tumorais, que não foram eliminadas pelo tratamento primário. No entanto, o efeito de PDT não letal sobre o comportamento e potencial maligno das células tumorais sobreviventes PDT é molecularmente não bem definido.

Metodologia /Principais Achados

mudanças Aqui nós avaliamos no transcriptoma de glioblastoma humano (U87, U373) e humano (PC-3, DU145) e células cancerosas da próstata murino (TRAMP-C1, TRAMP-C2) após não letal PDT

in vitro

e

in vivo

usando análises oligonucleotídeo microarray. Nós descobrimos que a resposta global foi semelhante entre as diferentes linhas celulares e fotossensibilizantes tanto

in vitro

e

in vivo

. Os genes regulados positivamente mais proeminente codificado proteínas que pertencem a vias activadas por stress celular ou estão envolvidos na paragem do ciclo celular. Esta resposta foi semelhante à resposta salvamento de células tumorais a seguir dose elevada de PDT. Em contraste, as células tumorais que se ocupam com a TFD não letal foram encontrados para regular positivamente de forma significativa um número de genes imunológicos, que inclui os genes de quimiocina

CXCL2

,

CXCL3

e

IL8 /CXCL8

, bem como os genes para IL-6 e o ​​seu receptor de IL6R, que podem estimular reacções pró-inflamatórias, ao passo que a IL6 e IL6R também pode favorecer o crescimento do tumor.

Conclusões

os nossos resultados indicam que a PDT pode suportar as respostas imunes anti-tumor e é, portanto, uma terapia racional mesmo que as células tumorais não pode ser completamente eliminada por mecanismos primários fototóxicas sozinho. No entanto, não letal TFD pode também estimular o crescimento do tumor de promoção alças autócrinas, como pode ser visto pela regulação positiva de IL-6 e o ​​seu receptor. Assim, a eficácia da TFD para o tratamento de tumores pode ser melhorada, controlando vias de crescimento-estimuladores indesejados e potencialmente deletérios

citação:. Kammerer R, Uma Buchner, Palluch P, Pongratz t, Oboukhovskij K, W Beyer et ai . (2011) Indução de Imunes Mediadores no glioma e câncer de próstata células por Non-Lethal Terapia Fotodinâmica. PLoS ONE 6 (6): e21834. doi: 10.1371 /journal.pone.0021834

editor: Joseph Najbauer, City of Hope National Medical Center e Instituto de Pesquisas Beckman, Estados Unidos da América

Recebido: 11 de dezembro de 2010; Aceito: 13 de junho de 2011; Publicado: June 30, 2011 |

Direitos de autor: © 2011 Kammerer et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Deutsche Krebshilfe (107.320; https://www.krebshilfe.de/deutsche-krebshilfe.html). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a terapia fotodinâmica (PDT) em oncologia é baseado na acumulação selectiva de um fotossensibilizador (FS) em células cancerosas, seguida pela sua activação pela luz que penetra o tecido de baixa energia. Na presença de oxigénio, o PS animado produz espécies reativas de oxigênio (ROS), tais como oxigénio atómico, que são tóxicos para as células vivas [1].

Vários PS existem que todos têm suas vantagens e suas limitações. 5-amino-ácido levulínico (5-ALA) é um precursor natural de heme em células de mamíferos. As células metabolizar 5-ALA em heme, produzindo protoporfirina IX (PpIX) como um produto intermédio em suas mitocôndrias. Uma vez que a conversão de PpIX em heme é um passo limitante da velocidade, a PpIX se acumula nas células cancerosas como resultado de absorção e retenção de 5-ALA preferencial. PpIX localiza intracelularmente para mitocôndrias e para o citoplasma [2]. Photofrin, por outro lado, é um fotossensibilizador exógeno que também se acumula nas células cancerosas, mas situa-se em várias membranas celulares [3]. Em geral, a activação de PS que têm como alvo a mitocôndria conduzir a apoptose de células de cancro, enquanto que a PS que associar com membranas de células predominantemente induzir necrose celular [2].

Originalmente, o objectivo da PDT foi em oncologia para eliminar completamente os tumores localizados . No entanto, a aplicação clínica de TFD no tratamento de cancro já começou a mudar. Recentemente, regimes de tratamento foram aplicadas que visam provocar vasculares-segmentação ou anti-tumorais efeitos imunes [4] – [7]. Isso indica que PDT também poderia ser uma opção de tratamento racional para tumores não superficiais, tais como câncer de próstata e glioblastoma.

O câncer de próstata é a terceira principal causa de mortes relacionadas ao câncer para os homens norte-americanos [8]. O tratamento primário do câncer de próstata inclui prostatectomia radical, a terapia de privação de androgênio, radioterapia e braquiterapia transperineal. Todos estes tratamentos têm um número de efeitos adversos que têm um impacto considerável sobre os pacientes [9]. Devido às melhorias dramáticas em tratamentos focais diagnóstico de câncer de próstata precoce, tais como crioterapia, de alta intensidade ultra-som focalizado e PDT estão surgindo como novas opções terapêuticas [10], [11]. A principal desvantagem da terapia focal é a incerteza de erradicação de células de tumor completa, especialmente uma vez que pouco é conhecido sobre a resposta das células tumorais que escapam da terapia focal. Um cenário indesejado é que essas células tumorais ganhar aumento malignidade ou iniciar a fatores secretos que apoiam a proliferação ou a infiltração de células cancerosas residuais de uma forma parácrina.

O glioblastoma multiforme (GBM) é o tipo mais comum e mais agressiva de tumores primários do cérebro em humanos. O tempo médio de sobrevivência de pacientes com GBM é de 14,6 meses [12]. Um dos traços característicos de glioblastomas é a sua natureza infiltrativa difusa [13]. Recentemente foi observado que a ressecção guiada por fluorescência e PDT repetitivo pode prolongar significativamente a sobrevivência mediana de pacientes com GBM [14], [15]. Além disso, a sobrevivência a longo prazo dos pacientes GBM após PDT baseia-PpIX foi relatado a partir de outros estudos clínicos [16], [17]. Apesar dessas observações promissoras várias questões têm de ser abordadas para otimizar o PDT como uma opção terapêutica para GBM. Por exemplo, a resposta das células tumorais que sobrevivem PDT devido à sua avançada infiltração no tecido cerebral normal não está bem definida, mas poderia ser um alvo para uma terapia adjuvante.

Descrevemos previamente como o transcriptoma de o cancro da próstata linha de células PC-3 responde a PDT à base de ALA-5 [18]. Surpreendentemente as células PC-3 regulada positivamente não apenas genes do stress e de reparação do ADN, mas também genes que codificam para proteínas que estão envolvidas na regulação de respostas imunitárias, incluindo certas quimiocinas e citocinas. Por isso, queríamos saber se deve ou não essa observação vale para outros PS, por outras linhas de células de câncer de próstata, por células tumorais de outra origem do tecido e para tumores

in vivo

. Para este fim, comparativamente analisou o genoma-wide mudanças transcrição depois de baixo nível, PDT não-letal em dois próstata e de glioblastoma linhas de células humanas cada, comparou o transcriptoma da linha de cancro da próstata humano PC-3 depois de 5-Ala- e photofrin baseado PDT e analisadas as mudanças de transcrição de células cancerosas da próstata murino subcutaneamente transplantado em albino C57BL 6 ratos /em cima PDT. Observou-se, independentemente da origem do tecido e do tipo de sensibilizador, uma estimulação da transcrição marcados de genes que codificam para citoquinas pró-inflamatórias, que estimulam e atraem leucócitos predominantemente mielóides e, ao mesmo tempo, a activação de genes que codificam proteínas envolvidas na paragem do ciclo celular. Tomados em conjunto, a destruição incompleta inevitável do tecido tumoral pelo PDT em configurações clínicas pode até mesmo apoiar as respostas imunes anti-tumorais.

Resultados

Sensibilização e irradiação condições para não-letal

in vitro

PDT

a fim de ser capaz de carregar de forma reprodutível células tumorais com fotossensibilizador determinou-se a cinética e o 5-ALA dependência da concentração de formação de PpIX nas linhas celulares de tumor utilizadas. Foram selecionados dois próstata humana (PC-3, DU145) e duas linhas de células de glioblastoma (U87, U373), bem como linhas celulares de carcinoma da próstata de murideo TRAMP-C1 e TRAMP-C2, que são derivados a partir de tumores da linha de ratinho transgénico “modelo transgénico do cancro da próstata “(TRAMP) [19], [20]. A acumulação de fotossensibilizador foi quantificada por citometria de fluxo (Figura 1E). Notamos grandes diferenças específicas de cada linha celular nos níveis de formação de PpIX após incubação com o precursor de PpIX 5-ALA (Figura 1A-C, E). Isto pode ser devido a diferenças nos níveis do ATP-ligação cassete ABCG2 transportador que é conhecido por ser responsável pela exportação de PpIX a partir de células [21]. Com efeito, a presença de ARNm ABCG2 nas diferentes linhas de células correlacionaram-se com os baixos níveis de PpIX após a incubação com 5-ALA com as maiores quantidades de ARNm ABCG2 sendo observado para TRAMP-C1 e células que exibiram os níveis mais baixos de PpIX TRAMP-C2 ( Figura S1; Figura 1). Além disso, a acumulação de PpIX foi diminuída de 2-3 vezes quando a incubação com 5-ALA, foi realizada na presença de soro no meio (Figura 1B, C). Esta foi provavelmente devido à ligação do PpIX à albumina sérica, uma vez transportados para fora da célula, deslocando, assim, os níveis de estado estacionário PpIX [22], [23]. Com base nestes dados, um período de incubação de 16 h com 50 ug /ml de 5-ALA, na presença ou ausência de soro a 5% foi escolhido para a próstata humana (PC-3, DU145) e o glioblastoma humano e linhas de células de cancro da próstata de murideo (U87, U373; TRAMP-C1, TRAMP-C2), respectivamente. Uma concentração relativamente baixa mas eficazmente sensibilizante Photofrin (5 ug /mL) foi seleccionado para evitar a possível toxicidade na ausência de luz (Figura 1D).

As células de tumor foram incubadas com 50 ug /ml (A, E) ou com as concentrações indicadas de 5-ALA (B, C) ou Photofrin (D) na presença (PC-3, U373; a, D, e e linhas vermelhas em B, C) ou ausência de soro a 5% (TRAMP C1, TRAMP-C2; A e linhas azuis em B, C). A menos que indicado de outra forma, o conteúdo de PpIX das células foi quantificado após 16 horas por citometria de fluxo no canal de fluorescência 3 (valores médios ± desvio padrão). histogramas representativos para as linhas celulares de tumores humanos tratados com 5-ALA são mostrados em E. As células não tratadas foram utilizados como controlo; uma amostra de controlo sem representativa 5-ALA incubação é mostrado (vermelho preenchido curva). Os fotossensibilizadores mostrou acumulação saturável, dependendo do tempo de incubação e concentração. O soro no meio de cultura fortemente reduzida formação de PpIX baseada-ALA. As condições para o carregamento sensibilizador usado para as análises transcriptoma são indicadas por linhas tracejadas verticais. AU, unidades arbitrárias.

Em seguida, doses de luz para irradiação de células sensibilizadas foram definidos, o que permitiria a sobrevivência de células por um período de 24 h para 48 h durante o qual as células danificadas poderia ativar genes. Verificou-se que condições de PDT que causou uma redução de actividade no ensaio de viabilidade celular em 30% em 24 h após PDT, em comparação com uma cultura de células não-irradiadas, em vez resultou em paragem do crescimento com pouca ou nenhuma perda de células dentro de um período de 48 h (Figura 2E). Para determinar a dose de luz induzindo uma redução de 30% da viabilidade das células medindo a actividade mitocondrial, as células foram sensibilizados como descrito acima e irradiados com doses crescentes de luz laser. A perda de viabilidade celular aumentou com o tempo após a dose de irradiação e luz e diferiram entre linhas celulares. Por exemplo, a 4 vezes superior dose de luz foi necessário para induzir uma redução de 30% da viabilidade celular 24 horas após a TFD para células DU145, quando em comparação com células U373 ou TRAMP-C1 (Figura 2A-D; Tabela S1). Esta sensibilidade diferencial das diferentes linhas celulares não se correlacionou com a sua capacidade de se acumular de PpIX na presença de 5-ALA. Curiosamente, as doses de luz que conduz ao mesmo perda de 30% de viabilidade celular induzida por um nível diferente de apoptose nas linhas celulares humanas analisadas, conforme medido pela activação da caspase 3 e caspase 7. Considerando que nenhum ou um nível marginal de apoptose foi observada nas as linhas celulares de cancro da próstata DU145 e PC-3, respectivamente, a apoptose máxima foi observada nas linhas celulares de glioblastoma sob as mesmas condições (Figura 2F).

Humanos (a, b, DF a) ou células de tumores de murinos ( C) foram sensibilizadas por incubação com 50 ug /ml de 5-ALA (DU145: 100 ug /ml) ou com as concentrações indicadas de Photofrin durante 16 h na presença (a, D, e, F, PC-3, DU145 ) ou ausência de soro a 5% (B, C; F, U87, U373). As células foram irradiadas com luz laser (635 nm) a entrega das doses de luz indicados. Após os tempos indicados, a viabilidade celular e activação caspase3 7 /foram determinados e exibidos como% de controlo para cada ponto de tempo (A a D, F) ou em unidades de fluorescência relativas (RFU; E, F). Note-se a diferentes propensão das células da próstata e de glioma de sofrer apoptose em baixa dose de PDT.

A transcrição de um subconjunto de genes de quimiocina e de citoquinas é altamente regulada positivamente em células tumorais após não letal

in vitro

PDT

Para determinar os genes que são desregulados 4 h e 24 h após a TFD não letal foi realizada a análise do transcriptoma de células tumorais humanas e de murino irradiadas e não irradiadas sensibilizadas por incubação com 5 ALA (condições são resumidos na Tabela S1). Uma grande fracção de conjuntos de sonda /genes regulados positivamente, após PDT foi partilhada entre linhas celulares ainda entre linhas celulares derivadas de tumores de diferentes tecidos de origem (por exemplo, ~30-60% 24 h após a TFD; Tabela S2, S3 Tabela). Caminho análises usando o programa Gene Conjunto de Análise de Enriquecimento de (AGEE) revelou que 24 horas após a irradiação, de um total de 3479 conjuntos de genes, 208 conjuntos de genes foram significativamente regulada positivamente em células de glioblastoma, 156 conjuntos de genes em cancro da próstata, e 508 conjuntos de genes em as amostras combinadas (p 0,01) (Tabela S4). Os conjuntos de genes mais proeminente regulados positivamente em todas as linhas de células pertencem a vias ativadas por estresse celular, incluindo os processos iniciados pelos danos através de luz ultravioleta, hipóxia e radiação, bem como conjuntos de genes ionizante, as proteínas codificadas que impedem a proliferação ( “regulação negativa da célula ciclo “,” paragem do ciclo celular “e” apoptose “; Tabela 1). Mais significativamente, uma série de vias imunes foram transcricionalmente activados por PDT não letal, tais vias incluem “genes pró-inflamatórias”, “via de interferão-β” e “activação de neutrófilos na cicatrização de feridas” (Tabela 1; Figura 3). O gene Gene ontologia conjuntos mais significativamente regulada negativamente em todas as linhas celulares analisadas foram encontrados para ser associada com vias mitocondriais (3 de 5), que está de acordo com as mitocôndrias sendo o local de produção de PpIX e dano primário por ROS (Tabela S4) .

análise de conjunto enriquecimento Gene (GSEA) revelou ativação de um conjunto de genes 24 h após PDT não-letal de todas as linhas de células de próstata 4 e glioblastoma (os dados são mostrados para PC-3), que também é encontrado para ser característico para a ativação de neutrófilos durante a cicatrização de feridas [55]. Regulação positiva é ilustrada pela concentração das linhas pretas verticais (que representam as posições de membro conjunto de genes dentro da lista gene classificado) no lado esquerdo da lista de genes ( “cruzamento zero”; ver “complô cascata” na parte inferior do gráfico) . Esta distribuição leva a uma pontuação alta e significativa enriquecimento (desvio máximo da linha verde de zero; P 0,001 e taxa de descoberta de falsas (FDR) 0,001).

Quatro horas após não letal PDT, os transcritos de “genes precoces” de resposta estavam entre os genes mais fortemente induzida e mais altamente expresso em ambas as células tumorais humanas e murinas (Figura 4, Tabela S2, S3 Tabela, Figura S2A-C). Este grupo de genes codifica fatores de transcrição como FBJ osteosarcoma murino oncogene viral homólogo (FOS), junho, fator ativador de transcrição 3 (ATF3), resposta de crescimento precoce 1 (EGR1) e-DNA danos inducible transcrição 3 (DDIT3). A sobre-regulação destes genes por sua vez, conduz a transcrição de genes típicos de stress como a proteína de choque térmico (HSP) genes e pode iniciar a prisão e a apoptose (DDIT3) [24], [25] G1. Na verdade, os membros induzíveis da família de genes HSP, ou seja, de choque térmico de 70 kDa proteína 6 (

HSPA6

) seguido na classificação pelo

HSPA1A

e

HSPA1B

foram os induzida mais dominantemente genes de 4 h após a TFD em linhas celulares de tumores humanos (Figura 4A-D). Nos murino TRAMP-C1 e TRAMP-C2 células transcrições das orthologs dos dois últimos membros foram predominantes 4 h após PDT (Figura S2B, C). O domínio de transcritos do factor de transcrição de genes de resposta precoce e HSP foi perdido 24 h após a TFD, a qual foi acompanhada por um aumento da actividade de dois grandes grupos de genes envolvidos em processos celulares opostas. Uma fortemente estimuladas e em alto nível do grupo de genes expressos codifica proteínas que exibem funções anti-proliferativos, pró-apoptóticos e anti-invasivos indutível pelo stress genotóxico como ROS (paragem do crescimento e beta ADN-dano-indutível (GADD45B),-especificidade dupla fosfatase 1 (DUSP1), ADAM metalopeptidase com o tipo de trombospondina 1 motif 1 (ADAMTS1), homocisteína-inducible, retículo membro endoplasmático stress inducible ubiquitina-like domínio 1 (HERPUD1) [26], proteína dedo de zinco 36 (ZFP36); diferenciação do crescimento factor de 15 /AINE-activado o gene 1 (GDF15 /NAG-1 [27], espermidina /espermina N1-acetiltransferase 1 (SAT-1) [28]). O segundo grupo de códigos de genes para proteínas que são conhecidos ou supostamente melhorar a sobrevivência das células após estresse celular através da inibição da apoptose e interrupção do ciclo celular (

cérebro expressa ligada ao X 2

(

BEX2

) [25]) ou através do apoio a desintoxicação de compostos nocivos gerados por ROS (

aldo-ceto redutase 1C1

/

1C2

(

AKR1C1

/

AKR1C2

)) (Figura 4A-D).

Tumor As células foram submetidas a TFD não letal após a sensibilização com 5-ALA (a, C-F) ou Photofrin (B). O ARN total foi isolado a 4 e 24 h após a PDT e analisado por hibridação de oligonucleótidos de microarrays. Após a normalização, a mudança vezes da expressão de genes entre correspondente amostras irradiadas e não irridiated foi calculada e em função do nível de expressão após PDT. Somente genes ( “conjuntos de sondas”) são mostrados que foram para cima e para baixo-regulado ≥3 vezes e para o qual um “presente convite” foi registrado para todas as amostras irradiadas e não irradiadas, respectivamente. O mais fortemente up-ou para baixo -regulated genes e mais altamente expresso nas amostras são identificados por símbolos de genes. representação múltipla de símbolos de genes resultam da presença de vários conjuntos de sondas para os genes individuais. os genes que codificam para proteínas imunomoduladoras são adicionalmente marcadas com pequenos círculos. Note que os últimos genes estão entre os genes mais fortemente regulada positivamente. Um código de cor foi utilizado para discriminar os grupos de genes que codificam proteínas funcionalmente relacionados (ver encaixotado legenda da figura). para todas as amostras a partir de valores médios de expressão foram usadas duplicados. FU, unidades de fluorescência.

Curiosamente, entre os genes altamente regulados positivamente por as células tumorais após a PDT foram um número de genes de resposta imune, em especial de quimiocina e genes de citoquinas, assim como genes de receptores de quimioquinas e citoquinas (Figura 4, Figura 5). Expressão de uma fracção substancial destes genes foi significativamente regulada positivamente 24 h após a PDT frequentemente em ambas as linhas de células da próstata e de glioblastoma (p 0,05; bidireccional ANOVA-teste). Entre os genes mais consistentemente regulados positivamente foram os genes de quimiocinas

CXCL2

,

CXCL3

e

interleucina-8

(

IL8

) /

CXCL8

, bem como o gene de citoquina

IL6

(Figura 5A-C, H). A sobre-regulação da

CXCL2

,

CXCL3

genes foi já observado 4 h após a TFD na maioria das linhas de células (dados não apresentados). Análise da expressão de a rede de produtos génicos que interagem com IL-6 revelaram um possível circuito autostimulatory em células PC-3 que envolvem a IL6 e suas subunidades do receptor IL6R /IL6RA e IL6ST /IL6RB (Figura 6). De nota, a expressão de

CCAAT /proteína de ligação potenciador β

(

CEBPB

) que codifica um fator de transcrição conhecido por estar envolvido na regulação da expressão de

IL6

, foi de 3 fold e 4,2 vezes induzida 4 h e 24 h após a PDT, respectivamente (não mostrado). Além disso, os genes que codificam os reguladores positivos e negativos de IL6 sinalização nomeadamente supressor de citocina 3 (SOCS3) e Janus quinase 1 (JAK1) /JAK2, respectivamente, foram regulados positivamente. Para o

gene IL6

mostrámos previamente que a sobre-regulação transcricional também se traduz em secreção elevados da proteína codificada por células PC-3 após PDT à base de ALA-5 [18]. Nenhuma activação estatisticamente significativa foi observada para alguns genes de quimiocina e de citocinas (por exemplo,

CXCL1

(P = 0,25),

CCL26

(p = 0,24; dados não mostrados);

IL18

, Figura 5J);

CXCL14

foi encontrado para ser significativamente regulada negativamente (Figura 5E). Para validar os dados de expressão obtidos por experiências de micro-arranjo de oligonucleótidos foram analisados ​​os níveis de ARNm de um conjunto de genes seleccionado (IL6, CXCL8 e CXCL14) em RNA total de PDT-tratadas e as células de controlo 24 h após a irradiação. Encontramos um bom acordo entre os dois conjuntos de valores de expressão determinados pelos dois métodos de quantificação diferentes (Figura S3, Figura 5). Isto reflecte-se coeficientes de determinação R

2 perto de 1,0 (0,947 ± 0,072) e uma para cima estatisticamente significativa semelhante (IL6, CXCL8) e para baixo-regulação (CXCL14) como encontrado usando o conjunto de oligonucleotídeo de dados microarray.

As células tumorais foram sujeitas a TFD não letal após a sensibilização com 5-ALA ou Photofrin e o ARN foi analisada após 24 horas de recuperação de PDT por hibridação de oligonucleótidos para microarranjos como descrito na legenda da Figura 4. Os valores médios de expressão em fluorescência relativa unidades (RFU) e os seus desvios para a interleucina e expressa genes de quimiocina e de interleucina receptor de quimiocina e são mostrados. Para o

CXCL8

e

foram usadas CXCL14

genes do 202859_x_at e 222484_s_at conjuntos de sondas, respectivamente. Para PC-3 e amostras U87 significa valores de expressão de duplicatas, por DU145 e amostras U373 foram usadas medições individuais. Os níveis de significância (P) foram calculados usando Two-way ANOVA.

As mudanças de expressão gênica 4 h e 24 h após PDT medidos por análises de microarranjos de oligonucleotídeos são descritos como a mudança vezes (fluorescência do irradiado /não amostra -irradiated). A magnitude da mudança de dobragem é indicado por cores diferentes ( 1,2 vezes, branco; ≥1.2 vezes, 2 vezes, laranja; ≥2 vezes, vermelho). A regulação positiva mais forte de expressão foi observado para a

IL6

gene (12,3 vezes) que poderia parte de uma malha autostimulatory com as subunidades dos receptores IL6 também upregulated (IL6R e IL6ST). O tamanho das ovais indica o nível de expressão após a TFD absoluto ( 100 FU, pequeno símbolo; ≥100, 1,000, símbolo médio; ≥1000, grande símbolo). As linhas entre as ovais simbolizar diferentes tipos de interacção entre as proteínas ou genes.

No entanto, há também uma fracção de genes (~ 25%) que foi preferencialmente upregulated (≥4 vezes) em PC-3 ou células U87 e, assim, pode exibir estimulação de tecido-específicos de origem. Os genes mais diferencialmente estimulada são ou já comparativamente altamente expresso na linha celular sem resposta (por exemplo,

EGR1

,

IL11

,

AKR1C1-3

em U87; CD55 no PC -3) ou provavelmente não pertencem ao repertório de genes expressíveis na respectiva linha de células (

receptor nuclear da subfamília 4 do grupo a membro 1 | (

NR4A1

),

fator de necrose tumoral -α induzida por proteína 6

(

TNFAIP6

),

desidrogenase /reductase (SDR família) membro 9

(

DHRS9

),

ciclina-dependentes quinase inibidor 1A

(

Kip2

) em U87) (Tabela S5)

em comparação, apenas alguns genes /conjuntos de sondas foram reprimidos . 3 vezes após PDT (Figura 4E , F e dados não mostrados). Os genes mais fortemente expresso que foram reprimidos crescimento celular, muitas vezes codificada e proteínas de sobrevivência promovendo.

genes ROS-indutíveis são mais eficientemente regulada pelo PDT baseia-5-ALA do que pela mediada por photofrin PDT

Curiosamente, embora produzida endogenamente PpIX e o Photofrin porfirina oligomérico sintética se pensa actuarem em diferentes compartimentos celulares [3], um conjunto semelhante de genes foi regulada positivamente tanto em 4 h e 24 h após a TFD não letal em células PC-3 (Figura 4A, B). No entanto, apesar de um nível semelhante de inibição da viabilidade das células após 4 h não letal PDT (5-ALA 15 ± 3%; Photofrin 17,5 ± 0,5%; Tabela 1) 14% (28/204) dos conjuntos de genes /sonda, que foram mais de 3 vezes regulada positivamente após PDT baseia-5-ALA, exibiu um ≥4 vezes maior activação de transcrição em comparação com a observada após a TFD Photofrin-mediada (Tabela S6). Os genes preferencialmente upregulated que foram expressos em um alto nível composta, entre outros genes, os genes de resposta precoce (

FOS

), genes HSP (

HSPD1, HSPA6

), genes de sobrevivência celular (cluster de histonas 1 genes), bem como genes de resposta imune (

IL1A

,

CCL26

). Em contraste, nenhum gene fortemente expresso após PDT ( 1000 RFU). Foi estimulada por selectivamente à base de Photofrin PDT (Tabela S6)

transcricional regulação positiva de genes pró-inflamatórios em tumores TRAMP-C2 após PDT não letal

Uma vez que a expressão de genes de citoquinas e quimioquinas foram consistentemente regulada positivamente em linhas celulares após PDT baseia-5-ALA

in vitro

, nós examinamos se baseia-5-ALA PDT também pode induzir a expressão de genes pró-inflamatórios em tumores, que poderiam apoiar antitumorais reacções imunitárias. Foi utilizado como um modelo de tumor células de tumor da próstata TRAMP-C2 murinos cultivados por via subcutânea em albinos ratinhos C57BL /6, o que permitiu a irradiação transdérmica do tumor com a luz visível. Em primeiro lugar, as condições de sensibilização optimizada pela medição da acumulação de PpIX na pele sobre o tumor após injecção i.p. injecção de 5-ALA como uma aproximação para a formação de PpIX no tecido tumoral. Na maioria dos ratos, os níveis máximos PpIX na pele foram alcançadas após 2-3 horas (Figura 7A). Uma cinética semelhante de acumulação de PpIX foi observado por determinação espectrofotométrica de PpIX em extractos de tumor (Figura 7B).

A cinética da acumulação de PpIX em tecidos de ratinho após a administração i.p. injecção de 5-ALA, foi determinada por medição directa da fluorescência de PpIX na pele que cobre o tumor (A) ou por determinação espectroscópicas de fluorescência de PpIX em extractos de tumores a partir de um único rato cada uma, que foi sacrificado no tempo indicado (B). acumulação de PpIX em tecidos diferentes em relação à TRAMP-C2 tumores 3,5 h após a injecção de 5-ALA é mostrado em (C). Em (A), uma cinética típica de acumulação de PpIX na pele é mostrado. acumulação máxima de PpIX na pele e no tecido do tumor foi observada ~180 minutos após a injecção de 5-ALA. Os tumores foram submetidos a PDT (75 J /cm

2) após a sensibilização com 5-ALA durante 180 minutos. Note-se, que o 5-ALA-PDT mediada após a sensibilização máxima tinha apenas uma actividade marginal (D) ou efeito inibidor no crescimento do tumor transiente (E), mesmo após a aplicação duplicado uma semana de intervalo. Para a análise de transcriptoma, sensibilizados tumores a partir de um único rato cada foram tratados ou não com luz laser (635 nm, 75 J /cm

2), excisadas 4, 14 ou 24 h após a irradiação. O ARN foi isolado e analisado por hibridação de oligonucleótidos de microarrays. Após a normalização, as alterações da expressão do gene de dobragem entre as amostras irradiadas e não-irridiated foi calculada e representada graficamente contra o nível de expressão após a TFD (F). Somente genes ( “conjuntos de sondas”) são mostrados que foram upregulated ≥3 vezes e para o qual um “presente convite” foi registrado na amostra irradiada. Os genes mais fortemente regulados positivamente e mais altamente expressos nas amostras são identificados por símbolos de genes. representação múltipla de símbolos de genes resultam da presença de vários conjuntos de sondas para os genes individuais. Os genes que codificam para proteínas imunomoduladoras são adicionalmente marcadas com pequenos círculos. AFU; unidades de fluorescência arbitrárias; n, número de ratinhos testado.

Em comparação com tumores TRAMP-C2, elevados níveis relativos de PpIX foram encontrados em extractos de fígado, vesícula seminal e pele (Figura 7C). Isto pode ser devido ao forte expressão do gene transportador de efluxo PPIX

ABCG2

tumores em C2 e C2 na linha de células de tumor (Figura S1) e pode explicar os efeitos secundários limitantes da dose visto nos murganhos após a TFD. Consequentemente, as doses de luz que podiam ser aplicadas conduziu a um controlo ineficiente do crescimento do tumor (Figura 7D, E). Transcriptoma análises utilizando ARN isolado a partir de todo irradiado e não irradiado tumores 14 h e 24 h após a PDT revelou que a fracção de genes altamente transcricionalmente activados após PDT não letal composta principalmente genes que codificam factores pró-inflamatórias (Figura 7F; Figura S2). Tal como observado para linhas celulares de tumores tratados com PDT,

CXCL2

,

Cxcl3

e

IL6

estavam entre os genes mais fortemente regulada, embora não se possa excluir que estas citocinas foram expressos por células estromais no microambiente tumoral ou tumor-associated células do sistema imunológico. Curiosamente,

Sprr2h

(

pequena proteína rica em prolina 2

) um gene conhecido por ser regulada por IL6 /STAT3 sinalização [29] é o segundo mais induziram fortemente gene 14 h após PDT (Figura 7F). Quatro horas após PDT,

Hsp1a

e

Hsp1b

pertencia ao grupo de genes mais fortemente ativadas e mais altamente expressos (Figura 7F).

Discussão

existem várias razões pelas quais PDT não-letal é muitas vezes aplicada inadvertidamente a células tumorais

in vivo

. Uma dessas razões é que as células dentro de um tumor são muitas vezes heterogéneos e podem diferir na sua capacidade de se acumular PS, bem como na sua susceptibilidade ao estresse oxidativo. Com efeito, observou-se uma variabilidade notável de acumulação de PpIX entre as diferentes linhas celulares de tumor utilizadas. Este não é restrita a células de tumor in

in vitro

, mas também foi observada em células de tumor in

in vivo

[30], [31]. No presente estudo foram identificados genes que são regulados positivamente em células cancerosas em cima não letal PDT

in vitro

e comparou-os com os genes que foram afectados no prazo de tumor tecidos

in vivo

. Mais importante, verificou-se que as células cancerosas, independentemente da sua origem tissular (próstata e do cérebro), por si só regular positivamente genes imuno-relacionados, como uma resposta ao stress celular induzida por PDT. Isto indica que o stress oxidativo induz respostas semelhantes em diferentes tipos de células, todas destinadas a limitar a sensibilidade das células à ROS, para reparar os defeitos celulares infligidas e para coordenar respostas imunes destina-se a limpar o tecido danificado irreversivelmente a partir do organismo.