Sumário

células-tronco cancerosas (CSCs) são pensados ​​para ser responsável pela iniciação do tumor e recorrência após a quimioterapia. Segmentação CSCs e não-CSCs com compostos específicos pode ser uma abordagem eficaz para reduzir o crescimento do câncer de pulmão e metástase. O objectivo deste estudo foi investigar o efeito de salinomicina, um inibidor selectivo de CSCs, com ou sem combinação com paclitaxel, em um modelo metastático. Para avaliar o efeito destas drogas na metástase e tumor microambiente que aproveitou a imunocompetentes e modelo altamente metastático LLC mouse. Aldefluor ensaios foram utilizados para analisar os ALDH +/- populações LLC murino e H460 humana e as células de câncer de pulmão H1299. Salinomicina reduziu a proporção de ALDH + CSCs em células LLC, enquanto paclitaxel aumentou tal população. Foi observado o mesmo efeito para as linhas de células H460 e H1299. Salinomicina reduziu a capacidade de formação de tumorsphere LLC por mais de sete vezes, mas o paclitaxel não mostrou nenhum efeito. Em

in vivo

experimentos, paclitaxel reduziu o volume do tumor primário, mas aumentou o número de nódulos metastáticos (p 0,05), enquanto salinomicina não teve efeito sobre tumores primários, mas reduziu metástase pulmonar (p 0,05). Combinação de ambas as drogas não melhorou o efeito de terapias individuais. níveis ALDH1A1, SOX2, CXCR4 e SDF-1 de ARNm eram mais elevados nas lesões metastáticas do que em tumores primários, e foram significativamente elevados em ambos os locais de tratamento com paclitaxel. Pelo contrário, esses níveis foram reduzidos (ou em alguns casos, não se alterou) quando os murganhos foram administrados com salinomicina. O número de F4 /80 + CD11b + e as células foi também reduzida com a administração de ambos os medicamentos, mas particularmente nas metástases. Estes resultados mostram que salinomicina alvo ALDH + pulmonares CSCs, que tem efeitos terapêuticos importantes

in vivo

, reduzindo as lesões metastáticas. Em contraste, o paclitaxel (apesar de reduzir o crescimento do tumor primário) promove a selecção de ALDH + células que provavelmente modificar o microambiente do pulmão para promover metástases

Citation:. Larzabal L, El-Nikhely N, Redrado M, Seeger W, Savai R, Calvo A (2013) Efeitos diferenciais de drogas que alvejam Cancer Stem Cell (CSC) e não-CSC Populações de pulmão tumores primários e metástases. PLoS ONE 8 (11): e79798. doi: 10.1371 /journal.pone.0079798

editor: Ilya Ulasov, da Universidade de Chicago, Estados Unidos da América

Recebido: 27 Março, 2013; Aceito: 25 de setembro de 2013; Publicação: 20 de novembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Larzabal et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela “projeto UTE CIMA”, ISCIII-RTICC RD06 /0020/0066 da concessão, PIUNA (ref. 12.028.402) e Gobierno de Navarra (ref. 2179) (a AC). LL foi apoiado por uma bolsa Gobierno Vasco. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é uma das principais causas de mortalidade em todo o mundo e a causa mais comum de morte por câncer em homens e mulheres [1]. A maioria dos casos de cancro do pulmão pertencem ao cancro das células não pequenas do pulmão (NSCLC) tipo (85% deles). O prognóstico para mais de 60% dos pacientes com NSCLC é pobre, em parte porque estágio avançado no momento do diagnóstico impede cirurgia curativa, e em parte porque os tratamentos médicos são ineficazes. Em 2007, as taxas de sobrevida em 5 anos para os homens e mulheres com diagnóstico de câncer de pulmão foi de 16%. Infelizmente, estas percentagens não mudaram substancialmente ao longo de várias décadas, apesar dos avanços significativos no diagnóstico e opções terapêuticas [2]. Embora o uso de terapias direcionadas para o câncer de pulmão tem sido um grande avanço na pesquisa do câncer, apenas uma pequena proporção de pacientes beneficiar deles. Por conseguinte, há uma clara necessidade de novas terapêuticas alternativas para um tratamento mais eficaz deste tipo de tumor. Uma nova avenida terapêutica que está actualmente a ser testado em experimentos pré-clínicos para uma variedade de tumores sólidos tem como alvo as células-tronco cancerosas (CSCs). A hipótese CSCs afirma que CSCs são responsáveis ​​pela iniciação do tumor, a sobrevivência das células após a terapia, metástase e recorrência tumoral [3]. Embora evidências recentes sugerem que os cânceres de pulmão humano, como outros tumores, também pode abrigar populações CSC, identificação de CSCs pulmão humano tem sido dificultada pela falta de marcadores de células tronco confiáveis. Expressão e atividade da aldeído desidrogenases (ALDH) servem como marcadores CSC no peito [4] e pulmonares [5] tumores. Além disso, o aumento da actividade de ALDH foi encontrada em populações de células estaminais em diferentes tipos de tumores, incluindo mieloma humano múltiplo, leucemia mielóide aguda, cérebro, mama, fígado, cólon, pâncreas [6], [7] e, mais recentemente, no pulmão, onde expressão ALDH1A1 está associada a menor sobrevida em uma coorte de fase I NSCLC pacientes [8]. A fração de ALDH + é enriquecida em células tumorais iniciando com o aumento da migração, capacidade de adesão e potencial metastático [9]. Juntos, esses resultados sugerem que a medição dos níveis de ALDH ou atividade enzimática pode servir como um pulmão CSC marcador.

CSCs são resistentes a muitos tratamentos atuais contra o câncer, incluindo quimioterapia e radioterapia [10], [11]. Isto sugere que muitas terapias contra o câncer, ao matar a maior parte do tumor, pode vir a falhar porque eles não eliminam CSCs, que conseguem sobreviver e regenerar novos tumores. evidência experimental recente também sugere uma grande plasticidade de ambos CSC e populações de CSC não [12]. Isso levou alguns autores a hipótese de que visando as populações tanto CSC e não-CSC são susceptíveis de ser necessário para um tratamento mais eficaz, embora esta questão não tenha sido testado experimentalmente ainda.

salinomicina, um ionóforo de potássio, foi recentemente identificada como um inibidor selectivo de células-tronco do câncer de mama humano

in vitro

[13]. Embora o mecanismo de acção de salinomicina ainda não é claro, que parece actuar como um inibidor potente da resistência a múltiplos fármacos de P-glicoproteína (P-gp /MDR1 /ABCB1) [14].

e migração de células tumorais metástase, como características importantes do tumor biologia partilham muitas semelhanças com o tráfico de leucócitos, que é criticamente regulada por quimiocinas e seus receptores. Acumulando dados sugerem que o CXCR4 (receptor quimioquina CXC-4) e SDF1 (estroma celular derivada de factor-1, ou CXCL12) poderia regular a migração e metástase em uma variedade de células de cancro de pulmão, mama e próstata [15]. Além disso, a sobre-expressão de CXCR4 correlacionada com um mau prognóstico em muitos tipos de tumores [16]. CSCs expressam o receptor CXCR4 e responder a um gradiente quimiotáctica específica do seu ligando SDF-1 [17], o que sugere que os CSCs provavelmente representam uma subpopulação capaz de iniciar a metástase [18]. Uma melhor compreensão do mecanismo migratório envolvendo células e CSCs câncer iria fornecer ferramentas mais adequadas para o desenvolvimento de novas terapias para reduzir ambas as recorrências locais e distantes.

CSCs interagir com envolve as células não malignas e ambos os tipos de células são co- regulada dentro do microambiente do tumor [19]. As células do microambiente do tumor, não só pode aumentar o crescimento do tumor primário, mas também facilitar a sua disseminação metastática para órgãos distantes. crescimento metastático de sucesso depende, assim, a capacidade de células cancerígenas para tirar vantagem do microambiente em torno de cada etapa do processo metastático. Microambiente tumoral compreende várias células incluindo as células endoteliais, fibroblastos do estroma e uma variedade de células derivadas da medula óssea (tais BMDCs) nos macrófagos, células mielóides derivadas de eliminadores, Tie2-expressam os monócitos e as células estaminais mesenquimais [20]. Quando as células tumorais chegar ao local de metástases que têm de se adaptar a um novo microambiente que é diferente daquele do tumor primário [21]. As interações tumor-estroma precisos no tumor primário e local de metástases são em grande parte desconhecido.

-específica CSC Anterior trabalho seminal mostrou que salinomicina e paclitaxel exibiu modos distintos de ação em um modelo de rato com câncer de mama, com salinomicina possuindo actividades inibidoras [13]. Considerando-se que CSCs podem ser mediadores-chave da metástase, a hipótese de que CSCs visando especificamente com salinomicina reduziria o potencial metastático de células tumorais residuais. Para lidar com esta hipótese, investigou-se a eficácia da droga específica presumido salinomicina-CSC no crescimento e disseminação metastática de NSCLC. Relatamos aqui que salinomicina diferencialmente afecta a taxa de crescimento do tumor primário e metastático em relação NSCLC potencial aos do paclitaxel agente quimioterapêutico convencional, correlacionando-se com actividades biológicas medidas de traços CSC. Também usando o carcinoma pulmonar de Lewis (LLC) modelo do rato, relatamos como estes compostos afetam o microambiente do tumor em ambos os locais de tumores primários e metastáticos.

Materiais e Métodos

Cultura de Células e compostos

As linhas celulares utilizadas neste estudo incluiu carcinoma rato Lewis pulmão (LLC) e H460 humana e H1299. Todas as linhas celulares foram obtidas da American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA) e foram mantidas em meio RPMI (Sigma, St Louis, MO, EUA) com soro de bovino fetal a 10% (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA) e 1% de penicilina-estreptomicina (Lonza, Basileia, Suíça), a 37 ° C e 5% de CO

2 atmosfera. Salinomicina e paclitaxel foram obtidos a partir de Sigma (St. Louis, MO, EUA) e foram dissolvidos em 20% de DMSO em PBS (veículo). As concentrações finais de paclitaxel e salinomicina usados ​​em todas as

in vitro

ensaios foram de 1 ug /mL para a salinomicina e 40 ng /mL para o paclitaxel. As células tratadas com veículo foram utilizados como controlos. Essas doses foram utilizados com base em publicações anteriores [13].

Formação Sphere Ensaio

Para a formação de esfera, as células foram cultivadas em meio de cultura livre de soro DMEM /F12 + GlutMAX ™ (Gibco, Paisley, UK ) suplementado com factores de crescimento (MEGM SingleQuots, Lonza, Basileia, Suíça) e B27 (Gibco, Paisley, Reino Unido). As células foram plaqueadas em placas de 6 cavidades de fixação ultrabaixo (Corning, Lowell, MA, EUA) a uma densidade de 1000-5000 células por cavidade, dependendo da linha de células e foram cultivadas durante 7-10 dias. Para avaliar o potencial de auto-renovação destas células, a primeira geração de esferas foi recolhido por centrifugação suave, dissociados em suspensões de célula única, e cultivadas sob as condições acima descritas por mais 7 a 10 dias. Para testar o efeito das drogas na capacidade formação esfera, as células foram plaqueadas na presença de 20% de DMSO (veículo), salinomicina (1 ug /mL) ou o paclitaxel (40 ng /mL) no início da experiência, sem mais adição da droga. Após 7 dias, as placas foram analisadas para a formação tumorspheres pulmonares e o número de esferas por poço foi quantificado utilizando um microscópio invertido (Olympus, Hamburgo, Alemanha). Para avaliar o efeito do tratamento com fármaco na ALDH + população em esferas LLC-derivados, as esferas formadas foram tratados com paclitaxel (40 ng /mL) ou veículo durante 72 horas. Após incubação, os ensaios foram realizados Aldefluor por citometria de fluxo.

ALDH Coloração e separação de células

O kit Aldefluor (StemCell Technologies, Durham, NC, EUA) foi utilizado para caracterizar e separar células com alta e atividade enzimática baixo ALDH. As experiências foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, 1 x 10

6 células foram incubadas em tampão contendo o substrato Aldefluor proteína ALDH (BAAA, BODIPY-aminoacetaldeído, 1 mmol /L) durante 30 minutos a 37 ° C. As células que poderiam catalisar BAAA ao seu produto fluorescente (BAA) foram considerados ALDH +. Triagem FACS para portões foram tiradas em relação à linha de base de fluorescência celular, o qual foi determinado pela adição do inibidor específico dietilaminobenzaldeído-ALDH (DEAB) durante a incubação. 7-aminoactinomycin D (7-AAD, Sigma-Aldrich) foi usado para enumerar células viáveis, apoptóticas e mortas (Figura S1A). As células foram classificados em um FACSAria Ilu (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EUA) e a pureza das células separadas foi ensaiada após o processo foi concluído (Figura S1B). Os dados foram analisados ​​pela Cell Missão Pro (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, EUA) e softwares FlowJo (Ashland, EUA).

CXCR4 Citometria de Fluxo

Após a incubação de células LLC com veículo, salinomicina (1 ug /mL) ou o paclitaxel (40 ng /mL) durante 72 horas as células foram lavadas uma vez com PBS e, em seguida, colhidas com tripsina a 0,05% /EDTA a 0,025%. As células separadas foram lavadas com PBS /EDTA /BSA (tampão de lavagem) e ressuspensas no tampão de lavagem (10

6 células /100 uL). anticorpo CXCR4 (Sigma) ou o seu respectivo controlo de isotipo foi adicionado à suspensão de células a 1:50 a concentração e incubadas a 4 ° C durante 30 min. As células marcadas foram lavadas mais uma vez e adicionou-se o anticorpo secundário conjugado com FITC (BD Bioscience) e incubou-se a 4 ° C no escuro durante 30 min. As células foram lavadas e analisadas num FACSCalibur (BD Biosciences).

clonogênica Ensaio

Para avaliar o potencial clonogênica de ALDH populações positivas e negativas de células LLC, após separação, a 500 células por poço foram semeadas em placas de 6 poços em condições aderentes. Após 10 dias em cultura, as colónias foram fixadas com 4% de formalina tamponada (Panreac, Barcelona, ​​Espanha) e coradas com violeta de cristal a 2%. Determinou-se o número de colónias por poço.

proliferação celular e Ensaio de Citotoxicidade

A proliferação celular foi determinada pelo ensaio de MTT (Roche, Palo Alto, EUA). Ordenada ALDH populações positivas e negativas de células LLC ou de células LLC não ordenados foram semeadas em placas de cultura de 96 poços (1000 células por poço) em 100 ul de meio. 24, 48, 72 e 96 horas depois 10 ul de MTT foi adicionado. absorvância espectrofotométrica foi medida a 570 nm.

Para o ensaio de citotoxicidade, as células LLC cultivadas em aderente ou em anoikis-resistente (condições de formação de esfera) foram plaqueadas em placas de 96 poços (1000 células por poço) e tratada com paclitaxel diluídas em série (0-100 nM). Setenta e duas horas após a incubação, MTT Os ensaios foram realizados seguindo o protocolo do fabricante. A percentagem de sobrevivência celular foi normalizada dividindo a absorvância final de amostras tratadas por o do controlo não tratado, e o CI

50 foi calculado.

Extração de RNA e PCR em tempo real quantitativo (qRT-PCR)

O ARN total foi isolado a partir de células, contendo peletes-esfera, ou amostras de tecido congelado, utilizando RNeasy Minikit QIAamp (Qiagen, Chatsworth, CA). Após tratamento com DNase I, a transcrição reversa foi realizada com a transcriptase reversa Superscript II (Invitrogen, Carlsbad, CA) para gerar o DNA complementar (cDNA). qRT-PCR foi executado em um 7900 em tempo real PCR máquina de Applied Biosystems. reacções de qRT-PCR foram realizadas com SYBR Verde mistura de PCR Master (Applied Biosystems, Forster City, CA, EUA) e os níveis de GAPDH foram utilizados como controlos. O valor de limiar significativo ciclo (Ct) para o gene de interesse, normalizados para o valor Ct do gene de manutenção (GAPDH) foi utilizado para calcular valores de expressão de genes. Os ensaios foram realizados para quantificar os níveis de ARNm de rato e /ou ALDH1A1 humano, os genes SOX2, CXCR4, SDF-1, CD11b, VEGF e VEGFR1. As sequências dos iniciadores são mostrados na Tabela S1. Os dados são apresentados como 2

-ΔΔCt ou 2

-ΔCt.

Migration Assay (Boyden Secção)

ensaios de migração foram realizados em uma câmara de Boyden. 20000 células por poço em meio livre de soro foram semeadas no Transwell superior de placas de 24 poços (Costar) na presença de veículo, salinomicina (1 ug /mL) ou o paclitaxel (40 ng /mL). O meio com 10% de soro, utilizado como um quimioatractor, foi colocado no compartimento inferior. Após 48 horas, as células na câmara superior foram esfregadas com uma mecha de algodão, e as células do compartimento inferior foram fixadas com 4% de formalina e coradas com violeta de cristal. O número de células migratórias foi avaliada com um microscópio Leica LED DMIL usando o software LAS EZ (Leica Microsystems).

Os estudos em animais

Os estudos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes éticas estabelecidas pelo nosso instituições (Universidade de Navarra), ao abrigo de um protocolo de animais aprovado pela Comissão de Ética de Experimentação animal da Universidade de Navarra (069/11). Todos os animais foram alojados em gaiolas microisolator e em condições SPF. Todos os procedimentos de cirurgia foi realizada sob anestesia e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento dos animais

.

Para a avaliação do tumor capacidade de iniciação dos CSC, seis semanas de idade NSG (NOD camundongos SCID IL2RG de The Jackson Laboratory, EUA) foram utilizados. Mil ou cinco mil células LLC classificadas positivas ou negativas ALDH foram injectados subcutaneamente nos flancos de ratinhos em PBS. O volume do tumor foi medido após 3 semanas com um paquímetro electrónico. No final da experiência os animais foram sacrificados por CO

2 inalação. Foram utilizados quatro ratos por grupo.

Para testar o efeito do paclitaxel e salinomicina

In vivo,

5 × 10

5 células LLC foram injectados por via subcutânea no flanco de 8-semanas de idade murganhos C57BL /6. O tratamento da droga foi iniciado 6 dias após a injecção das células tumorais, o tempo em que o tumor primário atingiu cerca de 50 mm

3. Os animais foram administrados com quer 20% de DMSO em PBS (veículo), salinomicina (5 mg /kg), paclitaxel (5 mg /kg), ou uma combinação de ambos os fármacos a cada 2 dias, por injecção intraperitoneal, durante 5 semanas. Estas doses e esquemas de tratamento foram selecionados com base em publicações anteriores [13]. Os tumores foram medidos cada 2 dias com um paquímetro electrónico. Quando os tumores primários atingiu aproximadamente, 300 mm

3, os tumores foram cirurgicamente removidos e as incisões foram costuradas. A operação foi realizada com ratos anestesiados utilizando isoflurano (Esteve, Barcelona, ​​Espanha) e em condições assépticas. A fim de reduzir o sofrimento dos animais que foram administrados com o cetoprofeno (5 mg /kg) a cada 24 horas, durante 3 dias após a cirurgia. Três semanas mais tarde, os animais foram sacrificados por CO

2 inalação e pulmões foram removidos para análise de nódulos metastáticos. Cada grupo compreendia 5 ratinhos e a experiência foi repetida duas vezes, de modo a confirmar os resultados.

Coloração e Análise de Imagem

As secções de tecido foram fixadas em 4% de formalina tamponada, embebidos em parafina, e seccionado (5 um de espessura). As lâminas foram coradas com H E. Para a quantificação de metástases do pulmão, imagens digitais a partir de secções de pulmão a partir de cada um dos animais (n = 5 por grupo) foram adquiridas com um microscópio Axioplan 2 (Zeiss, Alemanha) utilizando um Metamorph macro in-house (Molecular Devices, USA), que permite para compor imagens em mosaico capturados em 2,5x, com foco automático e correção de sombra. As imagens foram analisadas automaticamente com ImageJ e a área ocupada por nódulos de tumor em relação à área do pulmão não-maligna foi quantificada.

A imuno-histoquímica e imunofluorescência

Para corar as células mastro, uma solução de azul de toluidina ( 0,1%) aplicou-se às secções de tecido após desparafinização e reidratação.

para imuno-histoquímica CD31, a recuperação de antigénio foi efectuada por lâminas de aquecimento num forno de microondas durante 20 min em tampão de citrato 10 mM, a pH 6. os tecidos foram então incubou-se durante 1 h à temperatura ambiente com anticorpo anti-CD31 primário (Dianova, Hamburgo, Alemanha) na diluição de 1:20. Em seguida, as lâminas foram incubadas durante 30 min à temperatura ambiente com um anticorpo anti-rato de coelho secundário (Dako) a diluição 1:50 em diluente de anticorpo Dako real (Dako). As lâminas foram depois incubadas durante 30 min à temperatura ambiente com o ™ sistema de detecção anti-coelho EnVision (Dako). A actividade da peroxidase foi desenvolvida com DAB como anteriormente descrito. As amostras foram contrastadas com hematoxilina, desidratadas e montadas com DPX (VWR, Leicestershire, Reino Unido). Para quantificações, 150 imagens aleatórias (200x) por grupo experimental (30 por animal) foram capturados com um microscópio Leica (Wetzlar, Alemanha) equipado com o software de análise ™. imunocoloração positiva foi filtrada a partir do tecido não-coradas e quantificado com imagem J (imagem de NIH, Bethesda, EUA).

Para imunofluorescência, secções de tecido foram hidratados e incubados com tripsina durante 10 min para a recuperação de antigénio. Em seguida, os tecidos foram imersos em 5% de BSA com 0,1% de Triton X em PBS durante 1 h à temperatura ambiente, para evitar a ligação não especifica dos anticorpos. Os seguintes anticorpos primários foram utilizados para a rotulagem de imunofluorescência: anti-F4 /80 (1:200; AbD Serotec, Raleigh, Carolina do Norte, EUA) e anti-CD11b (1:100; Abcam, Cambridge, UK). Após incubação com os anticorpos primários, a 4 ° C durante a noite, as lâminas foram incubadas com 488 AlexaFluor-anticorpo secundário marcado (Molecular Probes, Invitrogen, Paisley, UK), contra-coradas com 4,6-diamidino nuclear-2-fenilindole (DAPI) e coloração montado com Dako fluorescente de montagem meios (Dako). Quantificação de CD11b, F4 /80 e células positivas para o azul de toluidina foi realizada por análise de imagem assistida por computador, utilizando sistemas QWin 500IW (Leica Instruments) Leica DMLA e. Em tumores primários, cada amostra foi analisada em 5-10 campos ópticos escolhidos aleatoriamente e foi calculada a percentagem de células positivas em relação ao número total de células coradas com DAPI. Em nódulos pulmonares, células positivas foram contadas manualmente, porque achamos que é mais confiável nestes tipos de lesões pequenas, e os dados foram expressos como uma percentagem da área do tumor (mm

2).

Para ALDH1A1 imunocoloração, As células H460 foram crescidas em lâminas de câmara (BD Biosciences) e, quando confluentes, as lâminas foram fixadas /permeabilizadas em acetona /metanol 01:01, durante 5 min. A peroxidase endógena foi extinta com uma solução de peróxido de hidrogénio a 3% e sítios de ligação não específicos foram bloqueadas durante 30 minutos com soro normal de cabra a 5%. As células foram então incubadas com anticorpo anti ALDH1A1 (BD), em 1:100 diluição, durante 2 h, à RT e lavadas em TBS. A detecção do anticorpo primário foi realizada com o sistema anti-rato Envision (Dako, Glostrup, Dinamarca). A actividade da peroxidase foi desenvolvida com DAB (3,3′-diaminobenzidina; Dako) e as células foram contrastadas com hematoxilina. Finalmente, as lâminas foram com glicerol montagem de médio escorregou-cover.

Métodos Estatísticos

As diferenças estatísticas entre os grupos foram examinados com o Student

t

teste ou análise de variância para variáveis ​​paramétricas desemparelhados e de Mann-Whitney

U

teste ou Kruskal-Wallis para variáveis ​​não paramétricas desemparelhados. A normalidade foi analisada com o teste de Shapiro-Wilk. Os dados foram analisados ​​com o software estatístico SPSS (versão 17.0 para Windows SPSS) e GraphPad Prism 5 software (GraphPad). Os valores são expressos em média ± SEM ou SD, ea significância estatística foi definida como P 0,05 (*), P 0,01 (**), e P . 0.001 (***)

Resultados

identificação da População ALDH + CSC-como na LLC Cells

Nós e outros mostraram anteriormente que a medição da actividade da ALDH é um método adequado para a identificação de células-tronco do câncer de pulmão (CSCs) [22] , [23], mas se este marcador pode ser usado para isolar e caracterizar a população LLC CSC era desconhecida. Para avaliar a presença desta população na linha celular de LLC com base na sua actividade enzimática da ALDH, Aldefluor ensaio, seguido de análise de FACS foram efectuados. Como mostrado na Figura 1A, a linha celular de LLC tinha uma média de células positivas ALDH 11,43 ± 0,38%, que está de acordo com resultados previamente publicados para outras linhas de células humanas e células primárias a partir de pacientes [5]. O uso de DEAB (um inibidor de ALDH específico) serviu como controle negativo.

A. A fracção de ALDH + célula (medida por ensaios Aldefluor) representa -11% do total de células da linha de células LLC. B. Isolado LLC ALDH + células possuem a capacidade de auto-renovação, como mostrado pela sua capacidade de gerar ambos os ALDH +/- populações após 8 dias em cultura, enquanto que as células ALDH- só dão origem a células negativas. C. Número de clones gerados por células LLC ALDH + e ALDH- após separação. A população ALDH + mostra maior capacidade clonogênica do que a sua contraparte negativa. D. Número de esferas gerados por células LLC ALDH +/-. análise E. qRT-PCR dos níveis de ARNm em células LLC ALDH1A1 cultivadas em condições aderentes, esferas primárias (S1) e esferas de segunda geração (S2). F. quimiorresistência de paclitaxel de LLC cultivadas em condições tanto aderentes ou em esferas (S1) foi medida com um ensaio MTT. IC

50 para as células LLC aderentes: 35,8 nM; IC

50 para esferas LLC S1: 93,6 nM. Dados de erro e bares: média ± SD. * P 0,05. ** P 0,01. *** P 0,001. Todos os experimentos foram repetidos pelo menos 3 vezes independentes (cada um deles em triplicata).

As propriedades típicas da CSC incluem as suas capacidades de auto-renovação e diferenciação,

in vivo

tumorigênico e potencial de resistência à quimioterapia [24]. Para verificar estas características em células LLC, primeiro analisou a capacidade de auto-renovação da ALDH + população. Após separação de células ALDH, frações celulares positivas e negativas foram semeadas separadamente. Após 8 dias em cultura, Aldefluor ensaio foi realizado para analisar o fenótipo da população celular resultante. ALDH + cultivadas células foram capazes de regenerar ambas as populações de células positivas e negativas da ALDH. Pelo contrário, as células cultivadas foram ALDH- incapaz de gerar a ALDH + população (Figura 1B). Este resultado demonstra que apenas as células ALDH + são capazes de reconstituir toda a população celular, uma propriedade típica das CSCs. ensaios MTT revelou que não houve diferenças nas taxas de crescimento entre ALDH + e populações de células ALDH- (Figura s1c). Não foram encontradas diferenças entre a população parental não triados e ALDH + ou populações ALDH- (dados não mostram).

Para comparar o potencial tumorigénico de células ALDH + e ALDH- LLC, ratos NSG foram injectados por via subcutânea com 1 × 10

3 ou 5 × 10

3 células. Como mostrado na Tabela 1, o crescimento do tumor foi observada em três de quatro ratinhos depois da inoculação com 1 × 10

3 ALDH + células, ao passo que não foi observado o crescimento do tumor nas células ALDH-. Após a injecção de 5 × 10

3 células ALDH +, 3/4 ratos apresentaram uma massa tumoral com um volume tumoral médio de 235,3 ± 64,6 milímetros

3, enquanto apenas 2/4 ratinhos desenvolveram um pequeno tumor após a injeção do população ALDH- (com um volume de tumor de 27,45 ± 5,47 milímetros

3).

em seguida, analisamos o potencial clonogénico das fracções de células LLC ALDH + e ALDH- por plaqueamento de 500 células por poço em uma placa de 6 poços e cultivando-as a uma densidade clonal durante 10 dias. células ALDH + deu origem a um número significativamente maior de colónias do que as células ALDH- (p 0,05; Figura 1C), mostrando assim que as células ALDH + exibir clonogenicidade aumentada. A capacidade clonogénico da linha celular parental foi intermediária entre a ALDH + e fracções ALDH- (dados não mostram)

ALDH + células produziram um maior número de esferas do que as células ALDH-. (P 0,01; Figura 1D). Analisamos também a capacidade de toda a população LLC para formar esferas e de auto-renovação, dando origem a uma população esfera secundária (S2). Após 7 dias no soro e condição livre aderentes, as células LLC formado esferas primárias (S1). A desagregação das esferas S1 e cultura nas mesmas condições demonstrou a formação de um (S2) da população secundária esfera. A fim de confirmar que as esferas foram enriquecidos em CSCs, quantificou níveis de mRNA da ALDH em células cultivadas em esferas (S1 e S2) condições aderentes e não aderentes. Por análise de qRT-PCR, observou-se que as esferas S1 tinham significativamente maior (p 0,001) os níveis de ARNm de ALDH do que as células cultivadas em condições aderentes, e que as esferas S2 também foram enriquecidos na expressão de ALDH (p 0,05), em comparação com as esferas S1 (Figura 1E). Além disso, a análise Aldeflour demonstraram um maior número de células em esferas ALDH + (34,2% ± 6,56%) do que em células cultivadas em condições aderentes (11,43 ± 0,38%) (Figura 1D e Suplementares Figura 1A). Portanto, estes experimentos confirmaram que as esferas resistentes a anoikis continha uma população enriquecida ALDH + CSC-like que era capaz de se submeter a auto-renovação.

Uma outra característica de CSCs é a sua resistência a agentes quimioterapêuticos convencionais. Assim, utilizou-se o paclitaxel, uma droga utilizada contra NSCLC, para avaliar quimiorresistência de células LLC cultivadas em esferas ou em condições aderentes. Como mostrado na Figura 1F, células LLC cultivadas como esferas exibiu maiores taxas de sobrevivência quando tratados com diferentes doses de paclitaxel do que as células cultivadas em condições aderentes. A IC

50 valores para ambas as populações de células eram significativamente (p 0,01) diferente: IC

50 para as células LLC aderentes foi de 38,5 nM e 93,6 nM para esferas LLC-derivados (Figura 1F). Para avaliar se as células-derivadas S1 correspondeu à ALDH + população com maior resistência ao paclitaxel, foram analisados ​​por Aldefluor a percentagem de ALDH + células em esferas após o tratamento com fármaco. Inesperadamente, não se observou um aumento significativo na percentagem de células ALDH + em resposta ao paclitaxel no modelo de LLC em condições de cultura de esfera. No entanto, como veremos a descrever abaixo, este fenómeno foi evidente nos modelos NSCLC humanos, apoiando a premissa de que as células-S1 derivados incluem ALDH + células paclitaxel-resistente. Tomados em conjunto, todos estes resultados sugerem fortemente que a ALDH + fração de células LLC corresponde a uma população CSC resistente a medicamentos.

efeito diferencial da salinomicina e Paclitaxel em Segmentação CSC vs.-CSC não Populações

Depois de ter demonstrado que a linha de células LLC tem um ALDH + sub-população com características CSCs, quisemos estudar o efeito de salinomicina, um composto identificado recentemente que inibe selectivamente as células-tronco do câncer de mama humano

in vitro

[13] . Comparamos o efeito de salinomicina com a do paclitaxel em populações CSC vs. não-CSC.

Para subsequente

in vitro

experimentos, trataram células LLC com 1 ng /mL salinomicina ou 40 ng /mL de paclitaxel, o que lhes permite recuperar durante 24 horas na ausência da droga. Para determinar os efeitos específicos de salinomicina e paclitaxel em ALDH +/- populações de células, ensaios Aldefluor seguido por análise FACS foi realizada. Após a separação de células, as células positivas e negativas ALDH foram plaqueados separadamente e administrados com salinomicina (1 ug /mL) ou o paclitaxel (40 ng /mL) durante 72 horas e a viabilidade celular foi avaliada por ensaios de MMT. Como mostrado na Figura 2A, a sobrevivência de células após ALDH + salinomicina tratamento foi significativamente mais baixa do que a de células ALDH- (p 0,05). Em contraste, a sobrevivência após o tratamento com paclitaxel de células ALDH + não foi afectada, enquanto que apenas 67,7% de células ALDH- estavam vivos (p 0,05). Estes resultados mostram que salinomicina é altamente citotóxica para células ALDH + mas paclitaxel afecta a população ALDH negativo.

A. * P 0,05. * P 0,05. * P 0,05. ** P 0,01. ** P 0,01.