Abstract

A glutationa peroxidase selenoproteína-2 (GPX2) parece ter um duplo papel na carcinogênese. Embora os ratinhos protegidos a partir de cancro do cólon num modelo de carcinogénese desencadeada-inflamação (azoximetano tratamento e sulfato de sódio de dextrano), promoveu o crescimento das células de tumor xenoenxertados. Portanto, analisamos o efeito de GPX2 em um rato modelo simulando câncer colorretal (apenas tratamento azoximetano) esporádica. GPX2-knockout (KO) e do tipo selvagem (WT) ratos foram ajustados para um tanto marginalmente deficiente (-se), adequado (+ SE) ou supranutritional (++ Se) estado de selênio e foram tratados seis vezes com azoximetano (AOM ) para induzir o desenvolvimento do tumor. Nos grupos -se e ++ SE, o número de tumores foi significativamente menor no GPX2-KO que nos respectivos ratinhos WT. Na dieta + SE, o número de criptas displásicas foi reduzida em ratinhos GPX2-KO. Isto pode ser explicado pela mais basal e morte celular por apoptose induzida por OMA em ratinhos GPX2-KO que elimina as células epiteliais danificadas ou pré-malignas. Em WT criptas displásicas GPX2 foi regulada em comparação com criptas normais que podem ser uma tentativa de suprimir a apoptose. Em contraste, nos números de tumor Grupos + Sé foram semelhantes em ambos os genótipos, mas o tamanho do tumor foi maior em ratinhos GPX2-KO. O último foi associado a um ambiente inflamatório e indutor de tumores, como evidente a partir de células inflamatórias infiltradas na mucosa intestinal de ratos GPX2-KO mesmo sem qualquer tratamento e caracterizado como inflamação de baixo grau. Em ratinhos WT o número de tumores tendem a ser mais baixo em comparação com + Sé -se e ++ alimentação Sé indicando que o selénio pode atrasar a tumorigénese apenas no estado adequado. Em conclusão, o papel de GPX2 e, presumivelmente, também de selênio depende do estágio do câncer e, obviamente, sobre o envolvimento da inflamação

Citation:. Müller MF, Florian S, Pommer S, Osterhoff M, Esworthy RS, Chu FF , et ai. (2013) Supressão de desenvolvimento de câncer de glutationa peroxidase-2 Colon Inibe Azoximetano Induzida. PLoS ONE 8 (8): e72055. doi: 10.1371 /journal.pone.0072055

editor: Gautam Sethi, Yong Loo Lin Faculdade de Medicina da Universidade Nacional de Cingapura, Cingapura

Recebido: 03 de junho de 2013; Aceito: 08 de julho de 2013; Publicação: 19 de agosto de 2013

Direitos de autor: © 2013 Müller et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Fundação alemã de Pesquisa (Br 778 /8-1). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CCR) é a segunda principal causa de morte relacionada ao câncer nos países ocidentais. Estudos epidemiológicos ligados um estado de selênio sub-óptima a um risco aumentado de desenvolver CRC [1]. Isso é relevante para as populações fora da América do Norte como na Europa, onde os níveis de selênio no plasma média são 90 mg /L (revisto em [2]). As diferenças nos níveis de selênio no plasma da linha de base de sujeitos participantes podem ter contribuído para os resultados inconsistentes de estudos de intervenção realizadas para estudar as propriedades anti-cancerígenas putativos da suplementação de selênio. Assim, tanto a Prevenção Nutricional do Câncer (NPC) e do selênio e vitamina E Cancer Trial (SELECT) revelou que os participantes de entrar no estudo com os níveis de selênio no plasma de ≥120 mg /L não lucrar com a suplementação [2]. Desde selenoproteína P, o marcador mais sensível para o estado de selênio [3], é saturado a 120 ug de selénio /L de plasma, sugere-se que a prevenção do cancro Se-mediada depende expressão óptima selenoproteína [2].

o selenoproteome consiste de proteínas codificadas por 25 genes em humanos [4]. Entre elas estão cinco peroxidases dependente de selênio de redução de hidroperóxidos de glutationa (GPx), nomeadamente GPx1-4 e GPx6. GPx1-4 são expressos no epitélio intestinal murino [5], mas apenas GPX2 está predominantemente localizada na base da cripta [6], [7], em que também as células estaminais reside intestinais. Além disso, GPX2 é altamente expressa em tumores colorrectais [6], [8], [9]. O papel da GPX2 durante o desenvolvimento CRC ainda é incerto. Por um lado, um decréscimo no número GPX2 tumor em um modelo de carcinogénese do cólon-triggered inflamação após a aplicação de azoximetano (AOM) e sulfato de dextrano de sio (DSS), agindo anti-inflamatório [10]. Isto é consistente com o ileocolite espontânea e câncer intestinal em camundongos GPX2 GPx1 /duplo knockout [11], [12]. Ambos podem ser quase completamente resgatado por um alelo WT de GPX2 mas não da GPx1 [13]. Por outro lado, GPX2 parece apoiar a proliferação. Os tumores produzidos por tratamento OMA /DSS foram menores em GPX2-KO que em ratinhos WT [10] como foram xenoenxertos de tumores derivados de células HT-29 GPX2 deficiente em comparação com células de controlo [14]. Além disso, GPX2 é sobre-regulada pela proliferação induzindo β-catenina [7], [15] e ΔNp63 [16], ambos.

Os objetivos do presente estudo foram analisar o papel da GPX2 e selênio em um modelo no qual CRC é induzida apenas por OMA, imitando assim a carcinogénese do cólon esporádicos em humanos [17]. o desenvolvimento do tumor foi monitorado em GPX2-KO e camundongos WT alimentados com uma dieta moderada deficientes em selênio (-se), -adequate (+ Se) ou -supranutritional (++ Se). Desde AOM induz mutações ativadoras em β-catenina (revisto em [18]), foi analisada co-localização de β-catenina nuclear e expressão GPX2 reforçada.

Métodos

Animais e Experimental Design

camundongos C57BL /6J WT e GPX2-KO, gerados como C57BL /6J; 129Sv /J híbrido tinha sido retrocruzado de camundongos C57BL /6J por cinco gerações [19] antes de entrar no estudo como irmãos. Os animais foram alojados em gaiolas ventiladas individualmente sob condições específicas de cada isentos de agentes patogénicos com 12 h de ciclo-escuro luz e livre acesso a comida e água. Os ratos foram alimentados com uma dieta à base de levedura torula (No. C1045, Altromin, Lage, Alemanha) com um teor de selênio basal de 0,054 mg por kg de dieta (-se). Se e + ++ dietas SE foram produzidos pela adição de ácido L (+) – selenometionina (Acros Organics, Geel, Bélgica) para atingir uma concentração de selénio final de 0,15 mg de (+ SE) e 0,6 mg (++ Se) por kg de dieta, respectivamente [20]. O conteúdo de selénio foi medida fluorimetricamente como previamente descrito [21]. ratos recém-desmamados foram alimentados com as dietas experimentais durante 4 semanas para ajustar o estado de selênio antes OMA-tratamento e, em seguida, ao longo da experiência (Fig. 1A). 10 mg /kg de peso corporal AOM (Sigma, Steinheim, Alemanha) ou um volume igual de solução salina (Sigma) foram injectados por via intraperitoneal uma vez por semana, durante seis semanas. Foram analisados ​​os efeitos agudos da OMA em 5 camundongos 8 h após a primeira injeção AOM (experimento de curto prazo). Os tumores foram analisados ​​16 semanas após a última injecção de AOM (experiência a longo prazo). 20 AOM-tratados e 10 ratos tratados com solução salina em cada grupo foram analisados ​​para a tumorigénese e adicional de 5 animais foram usadas para histologia. Os estudos foram aprovados pelo Comité Governamental animal Ética (MLUV 32-2347 /4 + 68). Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento. Os ratinhos foram anestesiados com Isofluran® e mortos por deslocamento cervical. pesos do baço foram determinados e amostras de tecidos foram congeladas rapidamente em azoto líquido e armazenado a -80 ° C.

(A) ratos desmamados foram alimentados com uma dieta experimental que era ou selénio-pobre (-se), -adequate (+ SE) ou -supranutritional (++ Se) por um período mínimo de 4 semanas antes da injecção de AOM. AOM foi injectado uma vez por semana, durante seis semanas e os ratinhos foram sacrificados 16 semanas após a última injecção de AOM (experiência a longo prazo). Para estudar os efeitos agudos AOM, os ratinhos foram mortos 8 horas após a primeira injecção OMA (experiência de curta duração). actividade (B) total da GPx foi determinada após 8 h uma injecção de solução salina (simples grupos da experiência de curta duração de controlo) no jejuno e no fígado de ratos GPX2-KO e WT. Os valores são médias + SD, n = 5. A significância foi calculado utilizando 2-way ANOVA com pós-teste de Bonferroni. *** P≤0.001 vs. WT,

# P ≤ 0,05,

## p≤0.01 e

### p≤0.001 vs. + Se.

o exame histopatológico de tumores do cólon e pré-neoplásicas lesões

Para identificar tumores e lesões pré-neoplásicas, o cólon foi aberto longitudinalmente, achatada em papel de filtro e fixados em 4% de formalina tamponada com fosfato de pH 7,0 (Roth, Karlsruhe, Alemanha). Para a identificação de tumores e focos de criptas aberrantes (FCA), o cólon foi corado com azul de metileno a 0,1% [22]. Depois focos mucina empobrecido (MDF) foram identificados no mesmo tecido do cólon através de coloração sequencial com diamina de alta ferro (HID) e 1% de azul de Alcian (AB). As amostras foram analisadas utilizando um microscópio estéreo (Olympus SZH10, Olympus Corporation, Tóquio, Japão). A localização e o diâmetro das lesões e o número de criptas dentro de um ACF ou MDF (multiplicidade cripta) foram registados. Todos MDF composta por mais de duas criptas e todos os tumores foram extirpados e verificado pela hematoxilina e eosina (H E). Cortes corados

A imuno-histoquímica e histoquímica

Os dois pontos de cinco animais tratados com AOM no longo prazo experimento foi preparado como rolo suíço por análises de imuno-histoquímica. Para estudar o efeito de curto prazo de otite média aguda, imuno-histoquímica (IHQ) foi realizada sobre o cólon distai de acordo com o protocolo descrito [20], com algumas modificações. tecidos do cólon fixadas em formalina foram embebidas em parafina e seccionadas fina (2 mm). Depois de re-hidratação, as secções de tecido foram microondas em tampão de citrato pH 6.0 (Dako, Glostrup, Dinamarca) para recuperar antigénios. A actividade de peroxidase endógena foi bloqueada através da incubação em 3% H

2O

2 e as amostras foram incubadas com anticorpos primários durante a noite a 4 ° C. Os anticorpos primários e suas diluições foram: anti-β-catenina (# 610153, BD Transduction Laboratories ™, Lexington, KY, EUA; 1:8.000), anti-Ki-67 (M7249, Dako, 1:60), anti- antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA, # 2714-1, Epitomics, Burlingame, CA, EUA, 1:20.000), anti-p53 (NCL-p53-CM5p, Novocastra Laboratories Ltd, Newcastle Upon Tyne, Reino Unido, 1:1.600), anti-anti-soro GPX2 [23] (1:12.000), e anti-F4 /80 (MCA497, Serotec, Kidlington (Oxford), Reino Unido, 1:8.000). anticorpos ou kits secundários (N-Histofine® Mousestain Kit, N-Histofine® simples PO mancha rato MAX para tecidos de ratinho, anti-rato ou anti-coelho, tudo a partir de Nichirei Biosciences, Tóquio, Japão), foi aplicada durante 30 min a sala temperatura. A ligação do anticorpo foi visualizada com diaminobenzidina (Dako). Imunorreatividade foi marcado de forma cega. O comprimento da zona de positivos a PCNA e o comprimento total de cripta foi medida utilizando Mirax Visualizador de software (versão 1.12.22.0, Carl Zeiss, Gottingen, Alemanha) a partir de 100 criptas por animal. células F4 /80-positivos na lâmina ao longo de cortes transversais das criptas foram marcados em 10 criptas por animal.

A quantificação de células apoptóticas foi realizada por meio de critérios morfológicos em secções coradas com hematoxilina do cólon distai em 200 criptas por animal aberto longitudinalmente, tal como descrito [20]. Para identificar MDF em cortes de tecidos, mucinas foram visualizados por coloração sequencial com 1% de AB, pH 2,5 e ácido periódico de Schiff (PAS) e contracoloração com hematoxilina. Cortes seriados foram corados com PAS /AB, H E, β-catenina, ki-67, e GPX2 individualmente. β-catenina e GPX2 imunorreatividade foi marcado com relação a localização subcelular ea posição na cripta. Um imunoreactividade aumentada foi definido como uma intensidade de coloração máxima aumentada em comparação com o tecido normal adjacente, ou uma ampliação da área positiva em células ou criptas ou ambos.

Actividade total da GPx

A actividade da GPx foi medida num teste de glutationa acoplada-redutase [24] que foi modificado para placas de microtitulação de 96 poços, como descrito [20] utilizando um leitor de placas de absorvância (Synergy2 leitor de Microplacas, BioTek, Bad Friedrichshall, Alemanha) a 340 nm. A actividade total GPx foi calculada a partir do consumo mol NADPH por minuto de acordo com a lei de Lambert-Beer e expressa como mU /mg de proteína.

Análise Estatística

Comparando dois grupos, diferenças significativas foram calculados por Student independente do t-teste. Para a comparação de mais de dois grupos, 2-way ANOVA seguido do pós-teste de Bonferroni foi utilizado (GraphPad Prism® versão 5.0, San Diego, CA, EUA). incidência tumoral foi analisada com tabelas de contingência utilizando o teste exato de Fisher (SPSS, versão 16, IBM). Para consideram os números de tumor, tabelas de contingência foram calculados para a incidência de tumores ponderados com o número de tumor. Um valor de p 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

GPX2-KO ratinhos desenvolvem tumores induzidos por OMA Menos do que WT Ratos sob as duas, a Selenium-pobres e -supplemented. dieta

Depois de alimentar ratos do -Se e ++ dietas sE, atividade da GPx jejuno e hepática foi significativamente reduzida e aumento, respectivamente, em comparação com grupos + sE (Fig. 1B). Aumento da actividade da GPx foi encontrado no jejuno de GPX2-KO em comparação com ratinhos WT, em ++ Se dieta (Fig. 1B), presumivelmente causada por uma compensatório a sobre-regulação de GPx1 como anteriormente descrito para o íleo e cólon [20]. A localização intestinal de GPX2 foi analisada por IHC no cólon de ratinhos WT (Fig. S1A). GPX2 foi maior em bases cripta e indetectável no terço superior das criptas. Níveis similares de proteína GPX2 foram detectados no cólon dos camundongos WT sobre + SE e ++ dietas SE, enquanto que a expressão GPX2 foi regulada para baixo em dietas -se.

A fim de testar o efeito de uma GPx2- KO sobre o desenvolvimento do tumor, os ratinhos foram desafiados seis vezes com AOM e analisados ​​16 semanas após a última aplicação AOM. Embora a incidência do tumor não foi significativamente diferente entre os grupos experimentais, -Se e ++ Se GPX2-KO ratinhos tinham números de tumor significativamente mais baixos do que os camundongos WT nas mesmas dietas (Fig. 2A). Embora o número de tumores foram igualmente baixas em ratinhos GPX2-KO independentemente do estatuto de selénio (-se: 5, + SE: 5, ++ Se: 3), os números de tumor em ratinhos WT foram maiores no -Se ++ e grupos SE do que no grupo + SE (-se: 14 e ++ Se: 13 vs. + Se: 7). O estado de selênio não afetou significativamente a incidência de tumores ou o número total de tumores. Todos os tumores eram adenomas não-invasivos localizado do cólon transverso ao recto, [25].

16 semanas após a última injecção foram analisados ​​OMA ratinhos WT e KO-GPX2 para a incidência de tumores e o número total de tumor por grupo ( a) e para ACF consistindo em 4 criptas (B) ou ≥4 criptas (C) por coloração com azul de metileno. MDF (D) foram contadas no cólon corado HID /AB. números ACF e MDF são mostrados como gráficos de dispersão de pontos, com média. o diâmetro do tumor é representado como a caixa de bigodes e min para max (E). P-valores para (A) foram calculados utilizando o teste exato de Fisher. Para teste de significância para o número total do tumor, a incidência tumoral foi ponderado com o número de tumor. P-valores para (B-E) foram calculados utilizando o teste t de Student não pareado. * P ≤ 0,05 e ** p≤0.01 vs. WT,

# P ≤ 0,05 vs -Se. Nenhuma ACF, MDF ou tumores foram observados em controlos tratados com solução salina (n = 10).

quantificada ACF e MDF, que ambos são considerados como marcadores pré-neoplásicas [26]. Nós diferenciadas entre ACF com um baixo ( 4) e um alto (≥4) multiplicidade cripta porque este último é suposto ser um melhor marcador biológico para o desenvolvimento do tumor do que o anterior [26]. Números de ACF não foram afetados pelas dietas de selênio (Fig. 2B e C). Enquanto -Se ratinhos WT tendeu (P = 0,06) a ter menos ACF com baixa multiplicidade de cripta respectivos ratinhos GPX2-KO (Fig. 2B), -Se WT ratinhos tinham significativamente mais elevada multiplicidade ACF com cripta do que os ratos GPX2-KO (Fig . 2C). Nós também quantificada MDF, que são caracterizadas por alterações na composição celular do cripta incluindo a perda de células caliciformes. Em contraste com a ACF, MDF sempre consistem de criptas displásicas propensos a desenvolver em tumores [26], [27]. Apenas + Sé ratinhos WT tinham significativamente mais MDF em comparação com ratinhos GPX2-KO (Fig. 2D) enquanto -Se ++ e ratinhos WT Se tinham mais tumores do que os ratos GPX2-KO (Fig. 2a). Assim, em selénio-adequação a diferença entre os genótipos só foi detectada ao nível do MDF. números de tumor foram igualmente baixa em ambos os genótipos sob + Se o que pode implicar que as condições para o desenvolvimento do tumor foram mais apropriadas em -Se e ++ grupos SE WT.

diâmetro do tumor foi medido como um parâmetro para o crescimento do tumor. camundongos GPX2-ko e WT sobre -Se e ++ dietas Sé tinha o tamanho do tumor semelhante, ao passo que os tumores foram significativamente maiores em + Se GPX2-KO do que em camundongos + Se WT (Fig. 2E). ++ Se GPX2-KO ratinhos tinham tumores menores em comparação com camundongos -se GPX2-KO. Em grupos WT, selênio na dieta não afetou significativamente o tamanho do tumor.

GPX2 e β-catenina foram elevadas em pré-neoplásicas lesões

expressão GPX2 é aumentada especialmente durante as fases iniciais de transformação neoplásica no intestino humano [6], que pode ser mediada por β-catenina [7]. Para testar se a expressão GPX2 também está aumentada em lesões pré-neoplásicas de ratinhos tratados com AOM, GPX2 foi analisada por IHC em ratinhos WT + Sé 16 semanas após a última aplicação AOM. O PAS /AB coloração identificados 67 MDF em cinco camundongos. Cortes seriados foram coradas para β-catenina, GPX2, e ki-67. p-catenina imunorreactividade foi aumentada em 85% (57/67) de MDF em comparação com o tecido normal circundante, de acordo com os dados publicados [27]. GPX2 imunorreactividade foi aumentada em 67% (45/67) de MDF em comparação com criptas normais.

MDF foram adicionalmente caracterizados com base no seu grau de displasia e multiplicidade cripta para determinar se GPX2 e β-catenina co-localizados . MDF com um menor grau de displasia tinha uma morfologia aproximadamente normal cripta, uma baixa multiplicidade, alguns restantes células caliciformes (Fig. 3A-I), e uma distribuição normal das células-Ki-67 positiva (Fig. 3A-IV). Estes MDF exibiu mais localizadas na membrana β-catenina, que foi detectada predominantemente na parte luminal (Fig. 3A-II seta azul) da cripta ou em criptas inteiras em comparação com criptas normais. GPX2 imunorreatividade foi ligeiramente aumentada na base da cripta dos MDF em comparação com criptas normais e estendido para o lado luminal (Fig. 3A-III seta preta). Por isso, em MDF com menor GPX2 displasia e β-catenina são elevados nas células epiteliais diferentes.

coloração IHC série do cólon rolos suíços foi realizada para o PAS /AB, β-catenina, GPX2, e ki-67 em cinco ratinhos WT + Sé 16 semanas após a última OMA-tratamento (a-C). colorações representativos de um MDF caracterizada por um menor grau de displasia e baixa multiplicidade cripta (a), uma MDF com displasia avançada e mais elevada multiplicidade (B), e um microadenomas (C). florida inflamação em ratinhos tratados com AOM GPX2-KO, -Se foi identificado por PAS /AB, F4 /80, e H E de coloração (D). os pesos dos baços foram normalizados ao peso do corpo (E). Meios + SD, n = 10, nos animais tratados com solução salina e n = 20, em grupos tratados com AOM. A significância foi determinada utilizando 2-way ANOVA com pós-teste de Bonferroni. * P ≤ 0,05 vs WT,

xP≤0.05 vs. salina.

MDF com displasia avançada foram caracterizados por uma maior multiplicidade, células epiteliais espessadas, a perda quase completa das células mucosas e melhorada Ki-67 de coloração (fig. 3B-I e IV) e exibiu tanto mais β-catenina e a imunorreactividade GPX2 em toda a cripta (Fig. 3B-II e III). Ao nível celular, GPX2 e β-catenina co-localizado no meio de MDF com displasia avançada, sugerindo que os altos níveis de ambas as proteínas foram apenas detectável numa zona específica da cripta durante um tempo específico de transformação displásico.

Além disso, um microadenomas foi caracterizada pela perda completa de células caliciformes, perturbado arquitectura cripta (Fig. 3C-I), enorme aumento da regulação da β-catenina nuclear e citoplasmática (Fig. 3C-II), e um número elevado de células-Ki-67 positiva (Fig. 3C-IV). Nesta estrutura, expressão GPX2 foi completamente perdido na área com elevada β-catenina, enquanto se manteve sobre-regulada em menos indiferenciadas criptas vizinhas (Fig. 3C-II e III, cabeças de seta) com características semelhantes como MDF com displasia avançada.

camundongos GPX2-KO -Se AOM-tratados selênio pobre Mice GPX2-KO desenvolveu um florido inflamação no cólon

tratados AOM

desenvolveu uma inflamação clara variando de moderada a um estado florida , que não foi observada em todos os outros grupos (Fig. 3D). No cólon distai, inflamação moderada como foi caracterizada pela degeneração cripta, infiltração de células imunes (mostrado pelas células mielóides /80-positivos F4), e um aumento no tecido conjuntivo. No início do cólon transverso uma inflamação florida (Fig. 3D) com a infiltração de células imunes em massa foi observada. arquitetura Crypt foi distorcida nas áreas afetadas, provavelmente devido a uma falha de renovação das células epiteliais.

Um indicador bem estabelecido para a inflamação sistêmica é o peso do baço. O peso do baço tende a ser aumentada em todos os grupos tratados com AOM (Fig. 3E) e foi significativamente mais elevada em ratinhos GPX2-KO -Se-OMA tratados do que nos respectivos ratinhos WT. Isto correlaciona-se com a inflamação do cólon. Devido ao enorme distorção na morfologia epitelial, β-catenina e co-localização GPX2 em ratinhos GPX2-KO -se não pode ser comparado com os outros grupos. Não foram observadas diferenças evidentes nas estruturas displásicas ou correspondentes níveis de β-catenina entre + Se e ++ Se GPX2-KO e camundongos WT (dados não mostrados).

AOM-tratamento aumentou apoptose celular Morte em células epiteliais de Ratos GPX2-KO

AOM é conhecida por induzir adutos DNA de alquilação que o pico 8 h após a sua aplicação [28]. A capacidade para remover aductos de ADN por apoptose ou de reparação do ADN dependente de p53 das células danificadas é crítica para a prevenção do desenvolvimento do cancro [29]. Como relatado anteriormente, o número de células apoptóticas na base da cripta é significativamente mais elevada em GPX2-KO que em ratinhos WT e é diminuída dependente da dose, aumentando o fornecimento de selénio [20]. Está bem estabelecido que a curto prazo OMA-tratamento aumenta a apoptose [28]. Nós contado o número de células apoptóticas (Fig. 4A-D) e analisados ​​de localização nuclear de p53 (Fig. S1B e C) 8 h após a injecção de AOM. Como esperado, a coloração nuclear de p53 na base cripta foi aumentada em todos os ratinhos tratados com AOM (Fig. S1B e C), enquanto que não foi detectável em ratinhos sem AOM-tratamento (Fig. S1C). AOM não alterou a actividade da GPx (dados não mostrados) ou expressão GPX2 em ratinhos WT (Fig. S1A).

(A-D) 8 h após a injecção de soro fisiológico ou de otite média aguda, células epiteliais apoptóticas foram contadas em 200 criptas por animal usando seções manchadas de H do cólon distal. Criptas foram divididos em 4 trimestres. O primeiro indica que a parte superior da cripta e da quarta base de cripta. Os dados são apresentados como média ± DP, n = 5. A signif icância foi determinada usando 2-way ANOVA com pós-teste de Bonferroni. * P ≤ 0,05, *** p≤0.001 vs. WT,

# P ≤ 0,05,

## p≤0.01,

### p≤0.001 como indicado,

xxP≤0.05 ,

xxxP≤0.001 vs. salina.

AOM-tratamento não afetou o número de células em apoptose na luminal 1

st cripta trimestre (Fig. 4A), independentemente do genótipo ou selênio estado. GPX2-KO ratinhos tinham significativamente mais células em apoptose induzida por OMA em grupos -se e + SE de The 2

º trimestre crypt (Fig. 4B) e no grupo -Se do 3

rd cripta trimestre (Fig . 4C) do que as respectivas ratinhos WT. No 4

th trimestre cripta, o número de células apoptóticas induzidas por OMA era igualmente elevado em ambos os genótipos (Fig. 4D). O aumento do número de células apoptóticas na base cripta de ratinhos não tratados GPX2-KO pode ser confirmada (Fig. 4D, solução salina). Em resumo, GPX2-KO ratinhos tinham mais células apoptóticas induzidas por OMA do que ratinhos WT que são especificamente localizados no meio da cripta, o 2

ND e 3

rd trimestre cripta. células Assim, iniciadas AOM pode ter sido eliminado de forma mais eficiente em GPX2-ko camundongos, resultando no desenvolvimento de menos tumores.

Comprimento Crypt e Zona proliferativa são ampliadas no cólon de GPX2-KO Mice

Para analisar se as alterações nas células apoptóticas poderia afectar ainda mais a morfologia da cripta, o seu comprimento e a altura da zona de positivos a PCNA proliferativa foi medida. Ambos foram significativamente aumentados em ratinhos KO-GPX2 independentemente do estatuto de selénio ou AOM-tratamento (Fig. 5). O alargamento da zona de positivos a PCNA persistiu após a normalização para o comprimento das criptas (dados não mostrados), o que significa que em ratinhos GPX2-KO a zona proliferativa coberto ~ 10% a mais do comprimento total da cripta do que no WT. Desde OMA só induz a apoptose em células de proliferação [28], as células apoptóticas induzidas por AOM deve ser co-localizada com as células PCNA positivas proliferativas. O IHC para PCNA de ratos GPX2-KO revelaram que as células em proliferação não residem apenas na 4

th e 3

rd cripta trimestre como observado em ratinhos WT, mas também na

º trimestre cripta 2 (Fig. 5B). Este correlacionada com mais células em apoptose no

º trimestre cripta 2 em -Se e + de camundongos Se GPX2-KO (Fig. 4B).

O comprimento das criptas e na zona PCNA-positivas na distal cólon de ratinhos WT e KO-GPX2 alimentados com as dietas diferentes de selénio foi determinada 8 h após uma dose única de solução salina ou de otite média aguda. (A) O comprimento da zona de positivos a PCNA (cor cinza) e PCNA zona livre (cor branca) foram medidos no cólon distai. barras inteiras representam comprimento total cripta. Os valores são médias + SD, n = 5. A significância foi calculado utilizando 2-way ANOVA com pós-teste de Bonferroni. * P ≤ 0,05, ** p≤0.01, *** p≤0.001 vs. WT. Símbolos acima das barras cinzentas indicam diferenças na zona de positivos a PCNA. Símbolos acima das barras brancas indicam diferenças no comprimento total cripta. (B) Representante PCNA coloração, ratos -Se WT e GPX2-KO tratados com solução salina.

Mice GPX2-KO são caracterizados por um baixo grau inflamação intestinal

Análises prévias têm demonstrado que uma dupla eliminatória da GPx1 e GPX2 resultado em ileocolite espontânea [11]. Para caracterizar a situação inflamação intestinal basal em ratinhos GPX2-KO não tratadas, as células mielóides /80-positivas F4 invadindo a lâmina própria do epitélio do cólon foram contados. As diferenças genotípicas foram novamente mais elevada nos grupos -se, diminuiu em + Se e desapareceu em ++ Se grupos (Fig. 6A). Além disso, -Se ratinhos GPX2-KO tinham mais células T CD3-positivas na lâmina própria do que os ratos WT (dados não mostrados). Considerando AOM-ratinhos tratados GPX2-KO -se desenvolveu uma inflamação florido com perturbada arquitetura crypt (Fig. 3D), os ratos -Se não tratada GPX2-KO exibiram inflamação menos grave e manteve uma morfologia cripta intacta (Fig. 6B). Em resumo, os ratinhos KO-GPX2 desenvolvido um baixo grau de inflamação basal, que foi mais elevada na -Se.

F4 /80-positivos células mielóides foram analisadas em ratinhos GPX2-KO WT e não tratados após 7 semanas na dietas selênio. células /80-positivos F4 na lâmina adjacente a uma cripta foi contado no cólon (A). Meios + SD, n = 4. representativas F4 /80 de coloração do -Se WT e KO-GPX2 cólon (B). A significância foi determinada utilizando 2-way ANOVA com pós-teste de Bonferroni. * P ≤ 0,05, ** p≤0.01 vs. WT,

## p≤0.01 vs. -Se.

Discussão

desenvolvimento do tumor e Iniciação

ratinhos GPX2-KO desenvolveram menos tumores no -Se ++ ou Se e dietas menos MDF na dieta + Sé do que as respectivas ratinhos WT (Fig. 2A e D). Isto indica que os ratinhos KO-GPX2 são mais resistentes ao cancro induzido por AOM. Em contraste, os ratos GPX2-KO desenvolveram mais tumores em um modelo /AOM induzida por DSS cancro do cólon [10], que se correlacionou com um DSS-colite mais grave após a exclusão GPX2. Assim, a actividade anti-cancerígena de GPX2 no cancro do cólon desencadeada-inflamação é causada principalmente pela sua função anti-inflamatória. A atividade pró-cancerígena do GPX2 após AOM-tratamento sozinho destaca o impacto crucial do DSS-colite como força-motriz tumor no modelo /DSS OMA. AOM induz G /A conversões de bases que resultam, principalmente, na activação de mutações em β-catenina. Estas mutações são contrabalançada por mecanismos de defesa, incluindo a reparação de bases de DNA ou apoptose. Por isso, a apoptose desempenha um papel predominante na prevenção de cancro induzido AOM. Em 6-8 h pós-tratamento AOM, células epiteliais de cripta sofrem apoptose de um modo dependente da p53 [30], [31] (Fig. S1B e C). Se as células progenitoras danificadas escapar apoptose, podem produzir criptas aberrantes, que pode desenvolver-se em tumores [32]. Camundongos deficientes em genes pró-apoptóticos como

p53

[33],

Bak

[34], e

Puma

[35] têm números mais elevados de ACF ou tumores e uma menor taxa de apoptose induzida por OMA.

Nós mostramos aqui e anteriormente que a deficiência GPX2 aumenta a taxa de apoptose basal em bases criptas do epitélio intestinal independentemente do status de selênio, embora a maioria, evidentemente, no estado -Se (Fig . 4D, solução salina) [20]. Outra característica do epitélio intestinal GPX2-KO é uma zona alargada proliferação (Fig. 5) que, presumivelmente, é uma tentativa para contrariar a perda de células apoptóticas. 8 h após AOM-tratamento, mais células em apoptose induzida por OMA foram contadas em meados-crypt região (2

º e 3

rd cripta trimestre; A Fig. 4B e C) de -Se e + Se GPx2- KO, em comparação com ratinhos WT. Apenas os ratinhos KO-GPX2 têm um maior número de células em proliferação nesta região. Níveis mais altos de basal e apoptose induzida por OMA em camundongos GPX2-KO é suposto para eliminar eficazmente células-iniciadas OMA. Em ratinhos WT, criptas displásicas são caracterizadas por níveis aumentados GPX2 (Fig. 3A e B), que presumivelmente suprimir a apoptose. Em criptas displásicas GPX2-KO uma taxa aumentada de apoptose pode contrariar a progressão maligna. Com base nestes resultados, GPX2, obviamente, é capaz de melhorar o desenvolvimento do câncer por suprimir a apoptose que de outra forma elimina células danificadas ou transformadas.

tamanho do tumor e Promoção

Inesperadamente, os tumores eram maiores em + Se GPx2- KO do que em ratinhos WT (Fig. 2E). Isso não se encaixa com a função pró-proliferativo das GPX2 como postulado a partir de um modelo de xenoenxerto com knockdown mediado por siRNA de GPX2 [14] e ratos OMA /tratados com DSS GPX2-KO [10], o que teria resultado em tumores maiores em o WT, em vez de na GPX2-KO. No presente estudo, o tamanho do tumor foi igual nos -se e + Sé ratinhos GPX2-KO e diminuíram significativamente com a ++ Se (Fig. 2E). Este correlacionado com a quantidade de células inflamatórias infiltradas (Fig. 6) no cólon não tratada GPX2-KO, que só foi aumentada em -Se e + SE, mas não em ++ Se GPX2-KO, em comparação com ratinhos WT. Os ratinhos deficientes em ambos GPx1 e GPX2 desenvolvem espontaneamente ileocolite [11] e colite induzida por DSS é mais grave em ratinhos deficientes em GPX2 [10]. Aqui, demonstramos que os ratinhos KO-GPX2 não desafiados tem uma colite de baixo grau, caracterizada por um aumento do peso do baço (Fig. 3E), infiltração de células inflamatórias (Fig. 6), e alongamento cripta (Fig. 5A). Além disso, níveis de TNFa no plasma foram aumentados em ratinhos + Sé GPX2-KO (observação não publicada).