Abstract

O prognóstico dos pacientes com câncer de ovário manteve-se pobre, principalmente por causa da progressão do câncer agressivo. Uma vez que a transição epitelial-mesenquimal (EMT) é um mecanismo importante mediar invasão e metástases de células cancerosas, alvejando o processo EMT com compostos mais eficazes e menos tóxicos para inibir a metástase, é de um grande valor terapêutico para o tratamento do cancro do ovário. Temos encontrado pela primeira vez que o ginsenoside 20 (S) -Rg3, um componente farmacologicamente ativo da erva tradicional chinesa

Panax ginseng

, potente blocos EMT induzida por hipoxia de células de cancro do ovário

in vitro Comprar e

in vivo

. Estudos mecanísticos confirmar o modo de acção de 20 (S) -Rg3, o que reduz a expressão do factor 1α indutível por hipoxia (HIF-1α) através da activação da via da ubiquitina-proteassoma para promover a degradação de HIF-1α. Uma diminuição em HIF-1α por sua vez leva à sobre-regulação, através da supressão transcricional de Snail, do marcador específico da célula de E-caderina epitelial e a regulação negativa da específico de células vimentina marcador mesenquimais sob condições hipóxicas. Importante, 20 (S) -Rg3 efetivamente inibe a EMT em modelos de rato de xenotransplante nuas de câncer de ovário, prometendo um novo agente terapêutico para a terapia antineoplásica

Citation:. Liu T, Zhao L, Zhang Y, Chen W, Liu D, Hou H, et al. (2014) Ginsenoside 20 (S) -Rg3 Alvos HIF-1α para Block hipóxia-Induced transição epitelial-mesenquimal em células de cancro do ovário. PLoS ONE 9 (9): e103887. doi: 10.1371 /journal.pone.0103887

editor: Joseph Najbauer, Universidade de Pécs Medical School, Hungria

Recebido: 31 de outubro de 2013; Aceito: 04 de julho de 2014; Publicação: 08 de setembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Liu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (No. 30.973.429). O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de ovário, existente predominantemente na forma de câncer epitelial de ovário (EOC), é a neoplasia maligna ginecológica mais letal [1], [2]. A baixa taxa de sobrevivência de pacientes com câncer de ovário é associado com a sua natureza vicioso de invasão e metástase. Entre os contribuintes importantes para a capacidade invasiva e metastática de células de cancro do ovário é a hipóxia do microambiente do tumor [3], [4], que medeia a invasão de células tumorais e metástases através de estabilização da hipoxia-inducible factor-1 alfa (HIF-1α) [5], [6].

Em células normóxicas, HIF-1α é hidroxilado por uma família de hidroxilases prolina (PHD1-3) em Pro402 Pro564 e, conduzindo a uma alteração conformacional que promove a ligação de HIF-1α para a proteína de von Hippel Lindau (VHL) – um componente do complexo grande ligase E3 ubiquitina proteossoma que medeia a degradação do HIF-1α [7], [8]. Sob condições hipóxicas, níveis baixos de oxigénio impede a hidroxilação de prolina, o que leva a estabilização de HIF-1α e a subsequente formação de um heterodímero com constitutivamente expressa HIF-1β. O bioactivo HIF-1 dímero regula, como um factor de transcrição, a expressão de uma vasta gama de genes envolvidos não só no ciclo celular, apoptose [9], a angiogénese [10], [11] e do metabolismo [12], em resposta ao ambiente hipóxico, mas também em um processo celular chamado de transição epitelial-mesenquimal (EMT) [13] – [15]

identificado pela primeira vez no desenvolvimento embrionário, EMT foi encontrado mais tarde para ser estreitamente associado ao processo de. invasão do cancro e metástase [16], [17]. Durante EMT células processo sofrer uma transição de um fenótipo epitelial polarizada a um fenótipo mesenquimal [18], um evento biológico caracterizado por alteração da morfologia celular de uma forma de calçada de uma forma f ibroblastóide dispersa, a perda de marcadores proteicos específicos de células epiteliais e aquisição de propriedades específicas de células mesenquimais, e motilidade celular melhorada e invasão. Enquanto uma variedade de factores, incluindo factores de crescimento e um ambiente hipóxico são demonstradas como indutores de EMT, diversos factores de transcrição, tais como caracol são confirmados como mediadores importantes da EMT [19]. EMT suprime epitelial específica da célula de E-caderina através de uma acção de diversos mediadores, levando à perda de polaridade e célula-célula junção adesão apical-basal, e se regula vimentina específico de células mesenquimais [20], resultando no rearranjo do citoesqueleto e motilidade celular Aprimoramento. Estes eventos constituem as características fundamentais da EMT ao nível molecular. De nota, EMT também está implicada na resistência à droga anticancerígena e dificulta a intervenção terapêutica eficaz de cancros em estágios avançados [21]. Obviamente, tendo como alvo o processo EMT irá proporcionar uma nova idéia para terapia de câncer, especialmente para câncer de ovário tumor que apresenta um forte potencial de metástase.

Ginsenosides são os componentes farmacologicamente activos da

Panax ginseng

[22] que tem sido muito utilizado como uma medicina tradicional chinesa para fins oficinais ou de recuperação [23], [24]. Até à data, mais de 40 compostos ginsenoside foram identificados [25]. Alguns deles, Rg1, Rg3, Rh1 e Rh2, por exemplo, mostrar a actividade anti-cancro potente [24], [26] – [28]. Ginsenoside Rg3, uma extractos bioactivos de

Panax ginseng

, tem vários efeitos médicos, tais como anti-tumor [29] – [32], anti-oxidantes, propriedades anti-inflamatórias [33], [34], a inibição da hiperplasia da cicatriz da pele [35] e angiogênese [36]. Além disso, os estereoisómeros 20 (R) -Rg3 e 20 (S) -Rg3 são duas moléculas quirais opticamente activos que diferem na orientação do grupo hidroxilo (OH) sobre carbono-20 [24]. Embora ambos têm sido relatados para inibir a metástase do tumor [30], de stereospecifity Rg3 parece estar ligada às suas bioactividades. Neste estudo, descobrimos pela primeira vez, que 20 (S) -Rg3 efetivamente inibe EMT induzida por hipoxia de células de cancro do ovário humanos não só

in vitro

mas também em modelos de rato de xenotransplante nus, prometendo um romance agente natural para a terapia anti-cancro do ovário.

Materiais e Métodos

Drogas e anticorpos

20 (S) -Rg3 e 20 (R) -Rg3 foram obtidos a partir TASLY Pharmaceutical Company (Tianjin, China), e a pureza foi ≥99% tal como determinado por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). estereoisómeros RG3 foram dissolvidos em sulfóxido de dimetilo (DMSO) numa solução de 4 mg /ml e armazenada a -20 ° C. Alíquotas da solução de estoque foram adicionados directamente ao meio de cultura

Foram utilizados os seguintes anticorpos:. Anticorpo de coelho para a vimentina, VHL, anticorpo de ratinho para a p-actina (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EUA), de coelho anticorpo de e-caderina (Bioworld Tecnologia, Louis Park, MN, EUA), anticorpo de ratinho para o HIF-1α (Abcam Inc., Cambridge, MA, EUA), anticorpo de ovelha para PhD1 (R D Systems Inc., Minneapolis, MN , EUA), anticorpo de coelho para Snail (Abnove, Taipei, China). Peroxidase de rábano (HRP) de imunoglobulina conjugado de cabra anti-ratinho (IgG), de cabra anti-IgG de ratinho e IgG anti-ovelha de coelho (Pierce, Rockford, IL, EUA), de HRP-polímero de ratinho anti-/coelho Kit de IHC (Fuzhou Maixin Biology Co. Ltd., Fouzhou, Fujian, China)

as linhas celulares e cultura

a linha de células de cancro do ovário humano SKOV3 foi obtido a partir de Xangai Cell Bank da Academia chinesa de Ciências (Shanghai, China), 3AO foi comprado pela Academia Shandong de Ciências Médicas (Jinan, China) .Cells foram mantidas em RPMI 1640 suplementado com 10% de soro de bovino recém-nascido (GIBCO, Grand Island, NY, EUA) sob condições de normóxia (21% o

2, 5% de CO

2, 37 ° C, 100% de humidade) durante 24 h antes de tratamento adicional. Para indução de hipoxia, as células foram incubadas em 1% de O

2, 5% de CO

2, 94% N

2, 37 ° C, 100% de humidade numa câmara HF100 hipoxia (Heal Force, Hong Kong , China) durante mais 24 horas com ou sem exposição a 80 ug /ml de 20 (S) -Rg3 (por SKOV3) ou 160 ug /ml de 20 (S) -Rg3 (por 3AO), ou 80160 ou 320 ug /20 ml de (R) -Rg3 (para células SKOV3 e 3AO).

a viabilidade celular ensaio

As células foram semeadas a uma densidade de 5000 células por poço em placas de 96 poços em 200 ul de meio RPMI 1640 contendo soro de bovino recém-nascido a 10% (NBS). Após a incubação de 24 horas, as concentrações de 20 (S) -Rg3 e 20 (R) -Rg3 aumentando foram adicionados. 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5- difeniltetrazólio (MTT) os ensaios foram realizados após 24 h e 48 h de tratamento, respectivamente. 20 uL de 5 mg /mL de MTT foi adicionado em cada poço. As células foram então incubadas durante 4 h a 37 ° C, seguido pela adição de 150 ul de DMSO. Os valores de absorção de comprimento de onda 570 nm foram medidos usando Enspire leitor de placas multimodo (PerkinElmer, Waltham, MA, EUA). Todas as experiências foram realizadas em triplicado e repetidas três vezes.

reacção em cadeia da polimerase em tempo real (PCR)

O ARN total foi extraído a partir de células cultivadas utilizando RNAfast 200 (Fastagen Biotech Co. Ltd. , Shanghai, China) de acordo com as instruções do fabricante. a concentração e a pureza do RNA foram determinadas num espectrofotómetro de UV (BioRad Inc., Hercules, CA, EUA) por a razão de absorvâncias 260 nm de absorvância e 260/280 nm, respectivamente. a síntese de cDNA foi realizada usando o kit de síntese de RevertAid primeira cadeia de cDNA (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. As reacções foram realizadas a 25 ° C durante 5 min, seguido de 42 ° C durante 60 min e 70 ° C durante 5 min. Os cDNAs foram armazenadas a -80 ° C para uso posterior. Quantitative PCR em tempo real foi realizada em um sistema em tempo real, PCR CFX-96 (Bio Rad, Hercules, CA, EUA) utilizando SYBR Verde Master Mix (Takara Co., Ltd. Biotecnologia, Dalian, China). Para a normalização, foi utilizado o gene β-actina. As condições de amplificação foram como se segue: desnaturação inicial a 95 ° C durante 30 s, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 5 s e 60 ° C durante 31 s. Cada medida foi realizada em triplicado, e foram incluídos no-modelo controles para cada ensaio. Após a PCR, uma análise da curva de dissociação foi feito. expressão gênica relativa foi calculada automaticamente usando o

-ΔΔCt o método 2. Todos os iniciadores de oligonucleotídeos foram desenhados e sintetizados por Shanghai Shenggong Biotecnológica Ltd. (Xangai, China). Foram usadas as seguintes sequências iniciadoras: HIF-1α-frente, 5′-ATCCATGTGACCATGAGGAAATG-3 ‘; HIF-1α-inverso, 5’-TCGGCTAGTTAGGGTACACTTC-3 ‘; PhD1-frente, 5’-AGGCTGTCGAAGCATTGGTG-3 ‘; PHD1- reverso, 5’-GGGATTGTCAACGTGCCTTAC-3 ‘; PhD2-frente, 5’-AAGCCCAGTTTGCTGACATT-3 ‘; PhD2-inverso, 5’-TTACCGACCGAATCTGAAGG-3 ‘; PHD3-frente, 5’-AGCCCATTTTTGCCAGACTCC-3 ‘; PHD3-inverso, 5’-GATTTCAGAGCACGGTCAGTC-3 ‘; BVS-forward, 5’-GCAGGCGTCGAAGAGTACG-3 ‘; BVS-reverso, 5’-CGGACTGCGATTGCAGAAGA-3 ‘; Snail-frente, 5’-TCCAGAGTTTACCTTCCAGCA-3 ‘; Snail- reverso, 5’-CTTTCCCACTGTCCTCATCTG-3 ‘; -Β-actina para a frente, 5’-TCCCTGGAGAAGAGCTACGA-3 ‘; β-actin- reversa, 5’-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3 ‘.

Western Blot

extratos de proteínas totais de células foram preparadas por lise de células em tampão RIPA no gelo. As células foram recolhidas por raspagem e transferidos para tubos de microcentrífuga. As amostras foram brevemente sonicada e centrifugada a 12000 rpm durante 30 min para remover os detritos insolúveis. O sobrenadante foi recolhido e quantificada utilizando o kit de ensaio de proteína de iniciação rápida Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). As proteínas foram fervidos antes de serem separados por electroforese em dodecil sulfato de sódio electroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), geles e transferidas para membranas de nitrocelulose (Pall das ciências da vida, Nova Iorque, EUA), utilizando um dispositivo de transmembrana molhado (Amersham Pharmacia Biotech., Piscataway, NJ , EUA). As membranas foram bloqueadas com leite não gordo a 5% à temperatura ambiente durante 1 hora, sondadas durante a noite com anticorpo primário (E-caderina 1:500, vimentina 1:2000, β-actina 1:1000, HIF-1α 1:500, PhD1 1:2000, BVS 1:1000) em TBST seguido de incubação com peroxidase de rábano apropriado (HRP) conjugado com anticorpo secundário (anticorpo de cabra anti-rato /IgG de coelho 1:2000, de coelho anti-IgG de ovelha 1:1000) como indicado. reagente ECL (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA) foi utilizado para desenvolver as manchas. Todos os valores foram normalizados para a p-actina.

cicatrização de feridas ensaio

As células foram semeadas em placas de 6 poços 24 h antes do tratamento. As monocamadas foram riscados com uma ponta de pipeta de 200 uL e lavadas com meio sem soro, para remover as células destacadas. As células foram mantidas em meio sem soro sob normoxia, hipoxia ou hipoxia em presença de 20 (S) -Rg3 durante 24 horas, respectivamente. As áreas feridas foram fotografadas, em seguida, após incubação durante um período indicado.

A migração celular ensaio

As células (1 x 10

5 /poço) em 100 ul de meio sem soro foram adicionados a millicells com tamanho de poro de 8 um (Millipore Co., Bedford, MA, EUA), inseridos em cavidades que continham RPMI 1640 com 20% de soro fetal de bovino como factor quimiotáctico. Após 24 h de incubação, as células remanescentes na superfície superior do filtro foram removidas com uma mecha de algodão, e as células que migram foram fixadas com 5% de dialdeído glutárico seguido por coloração com Giemsa para a quantificação do número de células. O número de células que migram em três campos de elevada potência das superfícies inferiores das membranas foram contadas. Um mínimo de três poços foram contadas por experiência.

pequeno RNA de interferência (siRNA) knockdown

Knockdown de PhD1 e BVS foram realizadas utilizando siRNAs específicos adquiridos de GenePharma Company (Xangai, China). Sequências de siRNAs são como se segue: siPHD1-A, 5′-GCAUCACCUGUAUCUAUUATT-3 ‘; siPHD1-B, 5’-CCAACAUCGAGCCACUCUUTT-3 ‘; siPHD1-C, 5’-GCUAGCAUCAGGACAGAAATT-3 ‘; siVHL-A, 5’-CCACCCAAAUGUGCAGAAATT-3 ‘; siVHL-B, 5’-GUCUCAUUCUCAGAGUAAATT-3 ‘; siVHL-C, 5’-AACUGAAUUAUUUGUGCCAUCTT-3 ‘. Um siARN mexidos (5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ‘) foi utilizado em experiências paralelas como controlo negativo. siRNAs foram transfectados para células SKOV3 e 3AO a 40-50% de confluência com ARNsi reagente de transfecção (Roche, Indianapolis, IN, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. siRNAs eficazes foram rastreados de acordo com os resultados de tempo real de RT-PCR após 48 h de incubação e por Western blot após 72 h, respectivamente. Em seguida, os siRNAs eficazes foram transfectados em células e incubou-se durante 24 h, seguida por indução de hipoxia com ou sem 20 (S) -Rg3 tratamento durante mais 24 h. O efeito de PhD1 e BVS silêncio sobre a supressão de HIF-1α por 20 (S) -Rg3 foi avaliada ao nível da proteína.

luciferase repórter ensaio

Depois de ser semeadas em placas de 24 poços, durante 24 h, as células foram transitoriamente transfectadas com e-caderina promotor de luciferase repórter plasmídeo pGL2Basic-e-cadK1 (Addgene, Cambridge, MA, EUA) e phRL-TK vector (Promega, Madison, WI, EUA). 24 h mais tarde, as células foram tratadas com ou sem 20 (S) -Rg3 em ambientes hipóxicos durante 24 h com células transfectadas normoxically cultivado como controlo. O lisado celular foi colhido 24 h mais tarde e a actividade da luciferase foi medida por um luminómetro (Promega, Madison, WI, EUA) utilizando a luciferase dupla Reporter System (Promega, Madison, WI, EUA). a actividade da luciferase de E-caderina foi normalizada para a da luciferase de Renilla. Os resultados foram obtidos a partir de três experimentos independentes e cada ensaio contendo poços em triplicado.

Os estudos em animais

O tratamento ea utilização de animais experimentais foram aprovados pelo comitê de ética da Primeira Affiliated Hospital, e foram aderente com as diretrizes institucionais e padrões éticos. Todas as seis semanas de idade ratos nus BALB /c fêmeas foram alojadas em instalações de barreira SPF sob um ciclo de 12 horas de luz /escuridão. Os pesos corporais de animais e os tumores subcutâneos diâmetros perpendiculares foram gravadas a cada dois dias. Os volumes tumorais foram calculados de acordo com a fórmula V = 0.5236 × (L × W

2) (V: volume do tumor, L: comprimento, W: largura).

Para o experimento xenoenxerto subcutâneo, células SKOV3 foram tripsinizadas e ressuspensas em PBS a uma concentração final de 2 x 10

7 células /ml. 2 × 10

6 células foram injectados por via subcutânea no flanco dos murganhos. 10 dias mais tarde, os ratinhos nus foram aleatoriamente atribuídos a grupos de tratamento (n = 4) e grupo de controlo (n = 4). Os ratos nestes dois grupos foram tratados por injecções intravenosas de 5 mg /kg de 20 (S) -Rg3 ou igual volume de PBS na veia da cauda a cada dois dias depois. Após 30 dias nos tratamentos experimentais, os ratinhos foram sujeitos a eutanásia por CO

2 asfixia. As amostras de tumor foram recolhidos e fixados em paraformaldeído a 4% durante 24 h à temperatura ambiente, embebido em parafina, seccionado e para análise imuno-histoquímica.

Para o modelo de xenoenxerto intraperitoneal, células SKOV3 foram tripsinizadas e ressuspensas em PBS a uma concentração de 1 × 10

8 /ml. Os ratinhos foram inoculados com 1 x 10

7 células no interior da cavidade abdominal no dia 0. Do dia 1, 5 mg /kg de 20 (S) -Rg3 (grupo de tratamento, n = 7) ou um volume igual de PBS (controlo grupo, n = 7) foi injectado via veia da cauda-a cada dois dias. Os ratinhos foram observados diariamente e sacrificados após 30 dias. Necropsias foram realizadas, tumores disseminados foram ressecados a partir de ratos, e líquido ascítico foi recolhido. Peso total do tumor e volume de líquido de ascite em cada rato foram medidos. Todos os conteúdos das experiências com animais que temos aqui relatados estão em conformidade com as diretrizes chegar.

Imunohistoquímica

lâminas histológicas foram preparados a partir dos blocos de tecido de câncer de ovário embebidos em parafina. Os espécimes foram desparafinados em xileno, re-hidratadas numa série de álcool descendente, seguido por aquecimento em 0,01 M de tampão de citrato (pH 6,0) em um vapor durante 1,5 minutos, para recuperar os locais de ligação antigénicos. A detecção de antigénios foi efectuada usando a incubação com os anticorpos primários (E-caderina 1:200, vimentina 1:400, HIF-1α 1:200), durante 2 horas à temperatura ambiente, seguido por incubação com um anticorpo secundário marcado com HRP ( MaxVision-HRP anti-ratinho de polímero /Kit de IHC coelho, 1:200) à temperatura ambiente durante 30 minutos e o desenvolvimento de cor com DAB. amostras de controlo negativo foram incubados em PBS sem o anticorpo primário, sob as mesmas condições. As lâminas foram contrastadas com hematoxilina, desidratadas numa série de álcool ascendente, e montado para análise. As imagens digitais foram adquiridas em um Olympus BH-2 microscópio (Tóquio, Japão) instalado com o Camera DeltaPix e software (Maalov, Dinamarca).

A análise estatística

As diferenças estatísticas foram determinadas por dois atados

t

-teste ou teste da soma de postos de Wilcoxon (apenas para o volume de ascite). Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando software SPSS (Chicago, IL, EUA). As diferenças foram consideradas significativas (*) no

P Art 0,05 e altamente significativa (**) a

P

. 0,01 para todas as comparações

Resultados

20 (S) -Rg3, mas não 20 (R) -Rg3, blocos de EMT em SKOV3 e células de câncer de ovário 3AO

em primeiro lugar, examinou o efeito de 20 (S) -Rg3 induzido por hipoxia e 20 (R) -Rg3 sobre a viabilidade celular das duas linhas de células de cancro do ovário humano SKOV3 e 3AO em uma série de ensaios MTT. As estruturas de 20 (S) -Rg3 e 20 (R) foram -Rg3 mostrado na Figura S1-A. 20 (S) -Rg3 inibiu o crescimento celular de um modo dependente da dose, dando origem a IC

50 (concentração inibidora em que a viabilidade celular de 50%) é inibida valores de 146,8 e 242,6 ng /ml, respectivamente, para e SKOV3 células 3AO 24 h (ou 48 horas) após o tratamento (Figura S1-B.). Em contraste, 20 (R) -Rg3 não mostrou inibição aparente da proliferação de ambos os tipos celulares em concentrações de até 640 ng /ml (Figura S1 AC).

próxima examinaram a capacidade de 20 (S) -Rg3 e 20 (R) -Rg3 para influenciar EMT induzida por hipoxia. Como mostrado na Fig. 1A, quando expostos a 1% O

2 durante 24 horas tanto células SKOV3 e 3AO EMT submetidos caracterizadas por uma alteração na morfologia celular de o aparecimento apertado-junctioned paralelepípedo semelhante a uma forma dissociada fusiforme. Esta alteração foi acompanhada por uma diminuição da regulação significativa do marcador E-caderina epitelial e uma marcada sobre-regulação do marcador de vimentina mesenquimais como revelado pela análise de transferência de Western (Fig. 1B). O tratamento de células SKOV3 e 3AO com 20 (S) -Rg3 em 80 ug /ml, 160 ug /ml, respectivamente, eficazmente evitada a alterações morfológicas associadas com hipoxia induzida por EMT (Fig. 1A), consistente com um nível elevado de E -cadherin e um nível reduzido de vimentina sob condições hipóxicas (Fig. 1B). Em contraste, o tratamento de células SKOV3 com 20 (R) -Rg3 a 80 ug /ml e 160 ug /ml, respectivamente, não conseguiu recuperar as células de sofrer EMT (Fig. 1A), como evidenciado por níveis inalterados de E-caderina e vimentina sob condição de cultura hipóxica (Fig. 1C). Para verificar melhor que 20 (S) -Rg3 bloqueada EMT induzida por hipoxia, a mobilidade celular foi avaliada na cicatrização de feridas e

In vitro

ensaios de migração. Como mostrado na Fig. 2A e B, enquanto que a hipoxia claramente promovido mobilidade celular e de encerramento de feridas, estes efeitos foram em grande parte contrariado pelo tratamento de células SKOV3 e 3AO com 20 (S) -Rg3.

(A) células foram primeiro cultivadas em comum condição durante 24 h. Para indução de hipoxia in vitro, as células SKOV3 e 3AO foram incubadas em uma câmara de hipoxia de 1% O

2, 5% de CO

2 e 94% N

2 durante mais 24 h sem (hipoxia) ou com RG3 (hipóxia + RG3) a concentração indicada durante 24 h. Os controlos foram cultivadas sob condições normóxicas (normoxia) para 24 h. imagens de células foram captadas com uma microscopia de contraste de fase (100 ×). (B) As proteínas de células expostas a normoxia, hipoxia e hipoxia acrescido de 20 (S) -Rg3 foram colhidas e a expressão de E-caderina e vimentina foram analisados ​​por Western blot, utilizando β-actina como um controlo de carga. diminuição hipoxia proteína E-caderina e aumentar a proteína vimentina, que foi revertida por 20 (S) co-tratamento -Rg3. (C) O efeito de 20 (R) -Rg3 sobre a expressão de marcadores de células de EMT em SKOV3. Não foi observado efeito de 20 (R) -Rg3 sobre a expressão de marcadores EMT induzida por hipoxia. Todos os tratamentos nesta figura foram efectuados em triplicado.

Mobilidade celular

(A) detectado pelo ensaio de cicatrização da ferida. As células foram incubadas sob condições de normóxia durante 24 h seguida por raspagem da camada de células confluentes e expondo a normoxia, hipoxia ou hipoxia, acrescido de 20 (S) -Rg3 durante mais 24 h, respectivamente. O encerramento do zero foi monitorizado durante 24 h e as fotografias foram mostradas a 0 h e 24 h após arranhão. mobilidade (B) celular examinado pelo

in vitro

ensaio de migração. Normoxically células cultivadas foram semeadas em millicells, seguido por incubação durante 24 h, sob normoxia, hipoxia ou hipoxia, acrescido de 20 (S) -Rg3, respectivamente. O número de células que passaram através da membrana por 20 × lente ampliada foram contadas e usadas para representar a capacidade de migração de células. Todos os tratamentos nesta figura foram efectuados em triplicado, e os resultados são apresentados como médias ± DP. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01,

t

-test

No seu conjunto, os nossos resultados fortemente. indicam que 20 (S) -Rg3, mas não 20 (R) -Rg3, é capaz de inverter alterações EMT induzida por hipoxia na morfologia celular, marcadores celulares, mobilidade celular e, sublinhando a sua função potencial como um inibidor de EMT induzida por hipoxia e EMT-mediada metástase do câncer.

20 (S) -Rg3 reduz a expressão de HIF-1α através da promoção de degradação da proteína HIF-1α em um PhD1 /BVS /proteassoma forma dependente

Para entender melhor o mecanismos moleculares pelos quais 20 (S) blocos -Rg3 EMT induzida por hipóxia nas células de cancro do ovário, analisamos a expressão de HIF-1α, um regulador crucial da EMT, tanto a nível de transcrição e tradução. Quando cultivados na presença de 1% de O

2 durante 24 horas o nível de proteína HIF-1α foi elevada em células SKOV3 e 3AO, enquanto que o nível de ARNm de HIF-1α foi dificilmente afectada. O tratamento das células com 20 (S) -Rg3 em ambientes hipóxicos idênticos marcadamente suprimida a expressão de HIF-1α ao nível da proteína com o nível de ARNm inalterada, indicando que o HIF-1α foi regulada por 20 (S) -Rg3 (pós-transcricionalmente a Fig. 3A e B)

.

(a) RNA total a partir de células expostas a normoxia, hipoxia ou hipoxia, acrescido de 20 (S) -Rg3, respectivamente, durante 24 h foram extraídos. Em tempo real Os ensaios de RT-PCR foram realizadas para analisar o efeito de 20 (S) -Rg3 no nível de ARNm de HIF-1α, e nenhuma alteração foi detectada. (B) As células cultivadas durante 24 h, sob normoxia, hipoxia ou hipoxia, acrescido de 20 (S) -Rg3, respectivamente, foram monitorizadas por Western blot para a sua expressão de HIF-1α. 20 (S) -Rg3 interferiu com o aumento do HIF-1α induzida por hipoxia. (C) MG132 bloqueou o efeito de inibição da 20 (S) -Rg3 no nível de proteína HIF-1α. Os níveis de proteína HIF-1α foram comparados entre as células hipóxicas, células hipóxicas co-tratados com 20 (S) -Rg3, e células pré-tratadas com 20? M MG132 durante 30 minutos, seguido de exposição a hipoxia e 20 (S) -Rg3 durante 24 h. (D) As células expostas a normoxia, hipoxia e hipoxia na presença de 20 (S) -Rg3, respectivamente, foram avaliados por PCR em tempo real para a transcrição de PhD1, PhD2, PHD3 e VHL. Depois de 20 (S) -Rg3 tratamento, a transcrição de genes PhD1 e VHL, que foram reduzidos em condições de hipoxia, foram aumentadas em ambas as células SKOV3 e 3AO. (E) Os extractos de proteína a partir de células tratadas foram analisados ​​por Western blot para expressão de PhD1 e BVS, com proteína a partir de células cultivadas como normoxically controlo e β-actina como controlo de carga. PhD1 e BVS diminuiu em células hipóxicas. 20 (S) -Rg3 recuperou sua expressão sob condições de hipóxia. Todos os tratamentos nesta figura foram efectuados em triplicado, e os resultados são apresentados como médias ± DP. *

P Art 0,05, **

P

. 0,01,

t

-test

Uma vez que a redução da proteína HIF-1α estava intimamente relacionado com a degradação da proteína por meio da via da ubiquitina-proteassoma, 26S específico do proteassoma MG132 inibidor de protease foi utilizado para investigar se o 20 (S) -Rg3 promovida a degradação proteossómica de HIF-1α. Como mostrado na Fig. 3C, o pré-tratamento de 20 uM de MG132 durante 30 min sob condições hipóxicas restaurado proteína HIF-1α em células SKOV3 e 3AO tratados com 20 (S) -Rg3, demonstrando que a 20 (S) -Rg3 regulada negativamente HIF-1α no proteassoma forma dependente. Como membros da família PHD e a proteína de VHL são factores que medeiam ubiquitina /degradação HIF-1α dependente do proteassoma, o efeito de 20 (S) -Rg3 sobre os níveis de mRNA de PhD1, PhD2, PHD3 e BVS conhecido foi adicionalmente examinada. Os dados de PCR em tempo real mostrou que a hipóxia consistentemente sub-regulada PhD1, PHD3 e BVS (Fig. 3D). Este efeito de hipoxia, especialmente em PhD1 e VHL, no entanto, foi revertida por 20 (S) -Rg3 em ambas as células SKOV3 e 3AO. Como esperado, os níveis de proteína de VHL PhD1 e foram largamente restaurado, como foi o caso para o ARNm, a seguir a tratamento de células SKOV3 e 3AO com 20 (S) -Rg3 para neutralizar a sub-regulação de PhD1 e proteínas de VHL (Figura mediada por hipoxia. 3E).

para melhor elucidar os papéis de PhD1 e BVS na mediação da actividade da 20 (S) -Rg3 no que diz respeito à degradação HIF-1α, células SKOV3 e 3AO foram transduzidas com ARNsi-PhD1 (siPHD1) ou siRNA-BVS (siVHL). Baseando-se na PCR em tempo real e western blot, foram selecionados dois siARN mais eficaz para silenciar PhD1 (siPHD1-A e siPHD1-B) e BVS (siVHL-B e siVHL-C), respectivamente (Figura S2), seguido por estimulação hipóxia e 20 (S) -Rg3 tratamento. Tal como determinado por Western blot, de knock-down PhD1 ou BVS inibiu o efeito pró-degradação de 20 (S) -Rg3 em HIF-1α (Fig. 4A e B), com o efeito de siPHD1 mais significativa do que a de siVHL em HIF recuperação de proteína -1α. Colectivamente, estes resultados sugerem que a 20 (S) -Rg3 bloqueado EMT induzida por hipoxia das células de cancro do ovário por activação da via da ubiquitina /proteassoma PHD1- BVS-de facilitar a degradação de HIF-1α.

Efeito do PhD1 ( A) e BVS (B) no dia 20 de silêncio (S) HIF-1α -Rg3-suprimidos. células SKOV3 e 3AO foram transitoriamente transfectadas durante 24 h com ou siPHD1 siVHL, seguido por incubação sob condições hipóxicas durante mais 24 h. O nível de proteína de PhD1, BVS e HIF-1α foram então detectados utilizando western blot. Todos os experimentos foram repetidos pelo menos três vezes.

20 (S) -Rg3 abole a repressão da transcrição da caderina-E através da repressão Snail

induzido por hipoxia

Durante o processo de EMT, E-caderina é geralmente suprimida pelos seus repressores transcricionais incluindo caracol que por si só é transcricionalmente activado pelo HIF-1. Para entender melhor como 20 (S) -Rg3 impediu hipóxia induzida por infra-regulação da caderina-E, nós investigamos o efeito de 20 (S) -Rg3 em caracol. PCR de transcrição reversa resultados mostrou que a hipoxia provocou um aumento drástico de Snail ARNm, o que aparentemente foi inibida por 20 (S) -Rg3 (Fig. 5A). Por conseguinte, a regulação de proteína Snail estimulado por hipoxia foi severamente atenuada por 20 (S) -Rg3 tratamento (Fig. 5B).

células SKOV3 (A) foram cultivadas em condições normais durante 24 h, e em seguida, cultivadas em 21% de O

2 (normoxia) ou 1% de O

2 (hipoxia) ou 1% de O

2 e 80 ug /ml 20 (S) -Rg3 (hipóxia + 20 (S) -Rg3) durante mais 24 h. Snail de ARNm foi determinada por RT-PCR com β-actina como um controlo interno, e normalizados em relação ao nível presente nas células cultivadas normoxically. A expressão de Snail foi aumentada a nível de ARNm em células SKOV3 após estimulação hipoxia durante 24 h. 20 (S) tratamento -Rg3 revogada caracol upregulation causado por hipóxia. (B) Os extractos celulares foram sujeitos a análise de imunomarcação para detectar o nível de proteína Snail, e β-actina foi utilizado como um controlo de carga. Baixo nível de proteína Snail foi detectada em células cultivadas normoxically, enquanto a proteína Snail foi aumentada em células hipóxicas. 20 (S) -Rg3 reduzida expressão de Snail induzida por hipoxia. (C) ensaio da luciferase em células SKOV3 e 3AO. a actividade do promotor de E-caderina foi reduzida significativamente em células hipóxicas. As diminuições na actividade do promotor de E-caderina foram revertidas por 20 (S) co-tratamento -Rg3. Actividade do promotor da E-caderina do pirilampo construções de luciferase foi normalizada para a de um

Renilla luciferase

construto co-transfectado. Todos os tratamentos nesta figura foram efectuados em triplicado e os valores são apresentados como médias ± DP de três experiências. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01, para

t

-test

Para investigar se a repressão. de Snail por 20 (S) -Rg3 foi responsável pela recuperação de E-caderina em condições hipóxicas, um ensaio de repórter de luciferase dupla foi realizada. Um promotor-luciferase construção repórter da E-caderina e um vector de controlo interno capaz de expressar luciferase de Renilla foi co-transfectado em células. A hipoxia foi encontrada para processar a perda de quase 50% da intensidade do sinal da luciferase em ambas as células SKOV3 e 3AO, enquanto que 20 (S) -Rg3 suprimida efeitos hipóxicas e causou um aumento significativo da intensidade da luciferase (Fig. 5C). Estes resultados demonstraram que 20 (S) -Rg3 bloqueada inibição hipóxica da atividade do promotor E-caderina.

20 (S) -Rg3 inibe o crescimento e câncer de ovário EMT

in vivo

< Como mostrado na Fig.