Abstract

A radiação ionizante (IR) de invasão tumoral Enhanced está emergindo como um contribuinte para o benefício limitado de radioterapia ; no entanto, seu mecanismo ainda é incerto. Nós já mostrou que adenocarcinoma de pulmão subclonado células A549 (células P), que sobreviveram 10 Gy IR (células IR), adquirida alta capacidade de invasão

in vitro

. Aqui, nós tentamos identificar o mecanismo pelo qual as células IR aumentar a sua capacidade de invasão, examinando a expressão do gene alterado e vias de sinalização em células de IR em comparação com aqueles em células P. Para simular o microambiente

In vivo

, as células foram incorporados em uma imagem tridimensional (3D) colagénio do tipo I em gel, em que as células foram alongadas IR, enquanto que as células P eram esféricas. O padrão de expressão de integrina foi pesquisada, e os níveis de expressão da integrina e α2 subunidades b1 foram significativamente elevados em células de IR. Knockdown de expressão α2 ou bloqueio funcional do α2β1 integrina resultou em uma morfologia rodada de células de IR, e revogou a sua invasão na matriz de colágeno, sugerindo papel essencial da molécula na disseminação e invasão celular em colágeno 3D. receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) também apresentaram expressão aumentada e a activação em células de IR. O tratamento com inibidor da tirosina-cinase EGFR, PD168393, diminuiu a proporção de células alongadas e invasividade de células. Moléculas de sinalização, incluindo cinase regulada por sinal-1/2 (ERK1 /2) e Akt, exibiu maior activação extracelular em células IR. A inibição da activação de Akt por tratamento com fosfoinositida 3-quinase (PI3K) inibidor LY294002 diminuiu a invasão de células de IR, enquanto que a inibição de ERK1 /2 por activação da proteína cinase cinase activada por mitogénio (MEK) U0126 inibidor não o fez. Nossos resultados mostram que a integrina α2β1 e EGFR cooperativamente promover uma maior capacidade de invasão das células cancerosas do pulmão IR-sobreviveram, mediada em parte pela PI3K /Akt via de sinalização, e pode servir como alvos alternativos em combinação com radioterapia

Citation.: Li X, Ishihara S, Yasuda H, Nishioka t, Mizutani T, Ishikawa M, et al. (2013) cancro do pulmão células que sobrevivem Radiação Ionizante mostram aumento da integrina Invasividade α2β1- e EGFR-dependente. PLoS ONE 8 (8): e70905. doi: 10.1371 /journal.pone.0070905

editor: Ferenc Gallyas, Universidade de Pecs Medical School, Hungria

Recebido: 26 Abril 2013; Aceito: 26 de junho de 2013; Publicação: 08 de agosto de 2013

Direitos de autor: © 2013 Li et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por bolsas-in-Aid para jsps Fellows (11J06280) para SI, Investigação Científica (a) (21249065) para HS e H. H., Pesquisa Científica (B) (24390285) para M.Y., T. N. e H. H., Pesquisa Científica em áreas inovadoras (24106502) para T.M. e Investigação exploratória (23651099) para K.K. do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia, no Japão. Esta pesquisa também foi parcialmente financiado pelo orçamento extraordinário para “Reverse Translational Research de Tecnologia Médica Avançada ao Avançado Life Science” a M.I., H. S. e H. H. financiado pelo Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão é a principal causa de mortalidade relacionada ao câncer em todo o mundo, com câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), que representam a maioria dos casos. As opções de tratamento para NSCLC incluem cirurgia, quimioterapia, radioterapia, e terapia de combinação sequencial ou simultânea [1]. A radioterapia é o uso médico de radiação (IR) ionizante, e é considerado um tratamento local não-invasiva, que afecta principalmente as células e os tecidos que estão situados no interior do feixe de IR. Sem dúvida, ele tem sido comprovada como uma ferramenta fundamental disponível na batalha contra o câncer.

No entanto, cada vez mais dados experimentais sugerem que, em circunstâncias ainda não compreendido, a radioterapia do tumor primário pode favorecer a metástase, o que pode explicar por melhor controle local da radiação não consegue traduzir em tempo de sobrevida mais longa, livre de metástases distantes [2]. Portanto, além de esforços consideráveis ​​em aumentar a radiossensibilidade [3] – [6], a identificação de moléculas e os mecanismos de progressão do cancro metastático induzida por IR são necessários para melhorar a eficácia da radioterapia e a taxa de sobrevivência dos pacientes. Muitos estudos têm demonstrado que a irradiação pode promover a invasão e /ou metástase por regulação positiva da expressão de genes e a activação de vias de sinalização que são envolvidas no processo metastático. Entre eles, os receptores da superfície celular, tais como as integrinas e receptores de factores de crescimento, são frequentemente alterados por IR e são capazes de activar diversas vias de sinalização diferentes com várias respostas celulares. Por exemplo, os níveis de integrina avp3 nas células de glioma de [7] e α5β1 no cancro pancreático [8] expressão são regulados positivamente por IV, o que facilita tanto a migração celular e invasão. Integrina α3β1 é sobre-expressa após IR, promover a migração de células através de meningioma quinase de adesão focal (FAK) e quinase regulada por sinal extracelular (ERK) [9]. O nosso grupo [10] e outros [11] mostrou um papel fundamental de β1 integrina na invasão induzida pelo IR no cancro do pulmão e meduloblastoma, respectivamente. IV também pode aumentar a invasão por meio de activação do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) e o receptor de insulina-like growth factor 1 (IGFR1) [12], [13], e a secreção do factor de crescimento de hepatócitos (HGF) [14].

Aqui, buscou-se compreender melhor o mecanismo subjacente ao aumento da capacidade de invasão das células de câncer de pulmão que sobreviveram IR. Foi demonstrado que a integrina α2β1 é selectivamente regulado positivamente em células de IR, e é necessário para o fenótipo agressivo e invasão de células de IR no gel de colagénio tridimensional (3D). EGFR foi também sobre-expressa e mais activa em células IR, contribuindo para IR de invasividade bem. A investigação de várias moléculas de sinalização importantes mostrou activação de extracelular de sinalização regulada quinase-1/2 (ERK1 /2) e Akt em células de IV, mas apenas fosfoinositida 3-quinase (PI3K) /Akt mediada por transdução de sinalização invasiva de integrina α2β1 e EGFR . Entender como IR promove a invasão das células cancerosas podem fornecer informações sobre a metástase e potenciais alvos terapêuticos para prevenir a recorrência de tumores secundários após a radioterapia.

Materiais e Métodos

Cultura de Células

humano linha celular de adenocarcinoma do pulmão A549 foi obtido a partir da American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA). células P e células de IV foram geradas como previamente publicada [10]. Ambas as linhas celulares foram mantidas em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM; Sigma, St. Louis, MO) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS; Equitech-Bio, Kerrville, TX) e 1% de mistura de antibióticos de penicilina /estreptomicina (Sigma ). As células foram mantidas numa incubadora humidificada a 37 ° C com 5% de CO

2.

Reagentes

EGFR PD168393 inibidor de cinase (Calbiochem, Merck KGaA, Damstadt), inibidor de PI3K LY294002 ( Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), e activada por mitogénio proteína cinase cinase (MEK) inibidor U0126 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) foram utilizados na concentração indicada em DMSO. Um anticorpo de bloqueamento da função contra α2β1 integrina (BHA2.1) foi adquirido a partir da Millipore (Billerica, MA). Os anticorpos específicos para Western blotting A integrina alfa2 e b1 subunidades foram adquiridos a BD Bioscience (San José, CA). O anticorpo p-EGFR (Tyr1068) foi comprado de Signalway Antibody (College Park, Maryland). Os anticorpos específicos para o EGFR, Akt, p44 /42 Raf activada por mitogénio MAPK P-Akt (Ser473) proteína quinase (ERK1 /2), p-p44 /42 MAPK (ERK1 /2) (Thr202 /Tyr204), transdutor de sinal e activador de transcrição 3 (Stat3), p-Stat3 (Ser727), p38 MAPK, e MAPK p-p38 (Thr180 /Tyr182) foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). anticorpo GAPDH foi adquirido a partir da Ambion (Austin, TX). MFP488 faloidina foi comprado de Mo Bi Tec (Molecular Biologische Technologie, Gottingen).

Cultura colagénio 3D

Uma solução de colagénio a 1,6 mg /ml foi preparada por mistura de 3 mg /mL de colagénio de tipo IP porco solução (Nitta Gelatin, Osaka), 2,6 × meio DMEM (Sigma) e tampão (Nitta Gelatin) numa proporção de 07:05: 1 em gelo. Um prato de 30 mm foi revestida em primeiro lugar com 150 mL de solução de colagénio e deixada a polimerizar a 37 ° C durante 30 min, em seguida, lavadas com meio. Em seguida, 10 ul de 2 x 10

5 células em suspensão foi bem misturada com 150 ul de solução de colagénio e plaqueadas sobre a camada inferior de gel de colagénio. Após a polimerização de colagénio a 37 ° C durante 30 min, a mistura de células-colagénio foi coberto com 2 ml de meio contendo FBS e cultivadas a 37 ° C e 5% de CO

2 para posterior análise. Para análise da morfologia e da observação de lapso de tempo, um prato de vidro foi substituído por o prato de plástico. Para a observação mais fácil de movimentação das células no mesmo plano, utilizou-se cultura de gel de areia. As células foram primeiro colocadas em placas e deixadas a aderir sobre o gel inferior e, após 16 h, o gel superior foi revestida e polimerizada a 37 ° C durante 30 min. As células foram mantidas em 2 mL de meio contendo FBS a 37 ° C e 5% de CO

2.

Morfologia celular Análise

morfologia celular foi analisado depois de estar no gel de colagénio 3D durante 24 h. Quando indicado, inibidores ou anticorpos foram adicionados ao meio. imagens de contraste de fase foram retirados aleatoriamente a partir de 4 campos por amostra, e a percentagem de células alongadas foi determinada a partir de pelo menos 3 experiências independentes incluindo mais de 100 células individuais. Uma célula foi considerado alongada quando a sua dimensão mais longa foi o dobro da dimensão mais curta, e quando se mostrou pelo menos uma saliência, como relatado anteriormente [15].

Microscopia lapso de tempo e quantificação da velocidade de invasão celular

2 × 10

4 células foram cultivadas por ensaio de gel 3D-areia durante 24 h, e observado numa câmara a 37 ° C por meio de um microscópio de contraste de fase (TE300, Nikon Instech, Tóquio). Imagens de células escolhidas aleatoriamente foram tomadas a cada 5 minutos, durante 6 h. Para as experiências de inibição, os inibidores ou os anticorpos foram adicionados ao meio de cultura depois de gel de sobreposição quando indicado. Para quantificar a velocidade de células, que acompanhou os movimentos de células individuais por programa Image-Pro (Media Cybernetics Inc., Silver Spring, MD). A velocidade de invasão celular foi calculado como a distância (mm) por minuto a partir pelo menos 3 experiências independentes, incluindo 50 células individuais.

3D Spheroid Invasion Ensaio

Spheroids foram produzidos utilizando o sistema de gravidade Plus (InSphero , Zurique, Suíça) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, 40 uL de suspensão de células contendo 10

3 células foi semeado em cada poço da placa durante 4 d, e esferóides foram transferidas para gel de colagénio e sobrepostas, logo em seguida. Depois de estar em gelatina a 37 ° C durante 30 min, foi adicionado meio com FBS, e as células foram cultivadas durante 24 h. Quando indicado, foram adicionados inibidores ou anticorpos durante a cultura. Em seguida, as células foram fixadas com paraformaldeído a 4% em PBS, permeabilizadas com 0,5% de Triton X-100 em PBS, e coradas com faloidina MFP488. imagens de fluorescência foram obtidos por microscopia confocal de varrimento laser (sistema de imagem confocal C1;. Nikon Instech, Tokyo). O perímetro e a área de esferóides foram determinadas pelo software ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland) como descrito anteriormente [16]. Em breve, mudar a imagem para o tipo de 8-bit, e usar a função limite para converter áreas de interesse para as áreas pretas saturadas de uma maneira uniforme para ter um (preto branco) binário de imagem. Em seguida, excluir todas as partículas de menos de 3 pixels de tamanho e remover qualquer tipo de artefato, comparando a imagem binária para as imagens de fluorescência. Use a caixa de diálogo medições set para especificar a área e perímetro. Utilize a caixa de diálogo analisar partículas para medir todas as partículas e para gerar um “relatório de partícula” para cada imagem, em que a área e perímetro de partículas individuais e a área da soma das partículas individuais está documentada. A relação de aspecto foi calculado a partir do perímetro

2 /[4π (área)]. A proporção mais elevada significa um, infiltrando-estrutura esferóide mais irregular. Os resultados foram determinados a partir de 3 experiências independentes realizadas em triplicado.

Western Blot

As células em cultura de colágeno 3D foram fixados em 500 Ácido tricloroacético gelada mL (TCA) por 3 min, e digerido com 200 uL de 0,1% de colagenase a 37 ° C durante 1 h. Os sedimentos celulares foram recolhidos por centrifugação a 14.000 rpm durante 2 min, ressuspensas em 100 ul de tampão de Laemmli, e aqueceu-se a 95 ° C durante 5 min, antes de ser lisados ​​sonicadas durante 30 seg e armazenado a -20 ° C até à sua utilização. Para executar a transferência de Western, os lisados ​​celulares foram separados num gel de 12% SDS-poliacrilamida, e transferidos para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (Millipore, Bedford, MA). A membrana foi bloqueada com 5% de leite em pó desnatado reconstituído numa solução de TBST (Tris-HCl a 10 mM contendo NaCl a 150 e 0,05% de Tween 20, pH 7,5). As membranas foram incubadas com anticorpos primários diluídos em TBST ou pode obter sinal imunorreação Enhancer Solução 1 (Toyobo, Osaka) a 4 ° C durante a noite. Após a lavagem com TBST, rábano anticorpos secundários conjugados com peroxidase diluído em TBST ou possam obter Signal imunorreação Enhancer Solution 2 foram aplicadas e as transferências foram desenvolvidas pelo Sistema Avançado Quimioluminescência Detection (Perkin Elmer, Waltham, MA). Níveis de imunocomplexos GAPDH foram utilizados como um padrão interno para o carregamento igual. A quantificação da intensidade do sinal foi realizada utilizando o software ImageJ e normalizadas para o valor de controlo.

RT-PCR

As células foram lisadas com TriPure (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) para a extracção de RNA, e a reacção de transcrição reversa foi realizada por Kit ReverTra Ás qPCR RT (Toyobo). Para células de cultura em gel de colagénio 3D, a extracção foi realizada duas vezes. A PCR foi efectuada com polimerase Taq em tampão ThermoPol (NEB, Ipswich, MA). Os iniciadores foram como se segue: α1:5′-GCCTCCTTTCTTGCTGTGTC-integrina 3 ‘(para a frente), 5′-TGGGTGCTTATTGGTTCTCC-3′ (reversa); integrina α2:5’-GAGCACCAGCAACAAAGTGA-3 ‘(Forward), 5′-CGGGTGTGTGTTCTGACATC-3′ (reverso); integrina α4:5’-GAGATTTTCCCCTTGCATGA-3 ‘(Forward), 5′-GAGTGCAATGCAGACCTTGA-3′ (reverso); integrina α5:5’-CACAGAGTTGCCCCGAGCACA-3 ‘(Forward), 5′-GCAGGGCTAGTGCCAGGGTTT-3′ (reverso); integrina β1:5’-AATGAAGGGCGTGTTGGTAG-3 ‘(Forward), 5′-CCTCGTTGTTCCCATTCACT-3′ (reverso); e GAPDH: 5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 ‘(Forward), 5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’ (reverso)

Quantitative PCR em tempo real (qRT-PCR)

qRT-PCR. foi realizada por PikoReal (Thermo Scientific, Waltham, MA) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, o ARN total (1 ug) foi submetido a transcrição inversa utilizando os iniciadores específicos do seguinte modo: α2:5′-CACAGAGTTGCCCCGAGCACA-integrina 3 ‘(para a frente), 5′-GCAGGGCTAGTGCCAGGGTTT-3′ (reversa); integrina β1:5’-GACGCCGCGCGGAAAAGATG-3 ‘(Forward), 5′-GCACCACCCACAATTTGGCCC-3′ (reverso); EGFR: 5’-CGCAGATAGTCGCCCAAAG-3 ‘(Forward), 5′-CCATCAGGGCACGGTAGAA-3′ (reverso); e β-actina: 5’-GAGCCTCGCCTTTGCCGATCC-3 ‘(para a frente), 5′-ACATGCCGGAGCCGTTGTCG-3’ (reversa), que foi usado como um gene de referência para a normalização

pequeno ARN interferente (siRNA) transfecção.

as células foram transfectadas com ARNsi contra a integrina α2 sequência alvo 5′-AACCAAAGAAGAAATGATTGTAG-3 ‘(sentido sequência, siα2-1) ou 5′-AACAAGAATGCTCAGATAATTCT-3′ (sentido sequência, siα2-2) utilizando Lipofectamina RNAiMAX Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA). Um ARNsi contra a sequência alvo Azami verde 5’-AGCAGATATTCAGGACTATTTCA-3 ‘(sequência com sentido) foi utilizado como um controlo negativo.

Ensaio de Proliferação

2 × 10

4 células foram cultivadas em gel de colagénio em 3D placa de 24 poços e tratadas com inibidores ou anticorpos quando indicado, durante a cultura. O meio com ou sem inibidores ou anticorpos foram trocados a cada dois dias. As células em cultura foram fixadas 3D colagénio em 200 uL de TCA arrefecido em gelo durante 3 min, e digeriu-se com 200 uL de 0,1% de colagenase a 37 ° C durante 1 h, pipetados cuidadosamente e continuar a ser digerido durante mais 1 h. Os sedimentos celulares foram recolhidos por centrifugação e ressuspendeu-se com PBS. A densidade celular foi determinada com um hemacitómetro. Todas as determinações foram efectuadas em triplicado em 3 experiências independentes.

Análise estatística

Cada condição experimental foi repetido pelo menos 3 vezes. Os dados são expressos como a média ± S.D. A análise estatística foi realizada por meio de Student

t

-teste, e um valor de P ≤0.05 foi considerado significativo.

Resultados

IR células apresentam maior capacidade invasiva

Para examinar se a IV podem promover a invasão de células de cancro, fenótipo celular foi comparada primeiro entre P e células IR. Ao contrário de morfologia semelhante em substrato duro 2D, morfologias celulares diferem significativamente quando incorporado em um gel de colágeno 3D, onde as células P são esféricos; IR células são mais alongada, com saliências [10].

A quantificação da velocidade de invasão de células individuais mostrou que as células IR movido mais rapidamente em cerca de duas vezes maior do que as células P em gel de colagénio (Fig. 1a). Além disso, trajetórias de células IR eram mais longas e mais direcionada do que os de células P, com células muitas vezes se virar (Fig. 1B). O aumento da capacidade de invasão de células de IR foi ainda confirmada por ensaio de invasão esferóide 3D para imitar a característica de tumores

in vivo

(Fig. 1C). Os resultados mostram que, depois de incorporado no gel de colagénio, durante 24 h, ambos P e esferóides IR aumentaram de volume em cerca de 20-40% (Fig. 1D), ao passo que os esferóides IR estendida saliências maciças, com algumas células já ter escapado do corpo , e apresentados como uma relação de aspecto maior do que a de células P (fig. 1E), o que sugere uma maior capacidade de invasão de células de IR em microtissues.

(a) Quantificação da velocidade na invasão P e células IR apresentados como média valores ± SD, *** p 0,001. (B) Diagramas representando as trajetórias invasão de 4 células representativas de P e células IR em colágeno gel de areia 3D cobertos por 6 h. origens da célula definido como (0,0), e a unidade de escala é um. (C) imagens Confocal de MFP488 representante P manchado de phalloidin e esferóides IR em gel de colágeno a 0 h ou 24 h. barra de escala, de 200 mm. (D) Quantificação da área de esferóides por software ImageJ. (E) A proporção de esferóides aspecto foi calculada a partir do perímetro

2 /[4π (área)]. Os resultados são apresentados como valores médios ± SD (*** p 0,001) a partir de 3 experiências independentes em triplicado

integrina α2β1 é abundante em células de IR, e é necessário para o alongamento e invasão de IR. As células em 3D de colagénio

As integrinas são receptores de superfície adesiva célula formada por subunidades a e p, que se ligam a proteínas da matriz extracelular (ECM). a adesão mediada pela integrina ao ECM desencadeia vias de sinalização intracelulares para modular a morfologia celular, a migração, invasão, proliferação, sobrevivência e [17]. A mudança morfológica dramática de células IR em comparação com células P quando cercado por uma matriz de colágeno nos incentivou a investigar o padrão de expressão de integrina. Em nosso estudo anterior, mostramos que knockdown de β1 integrina por siRNA ou tratamento com o seu AIIB2 anticorpo inibidor induzido morfologia esférica de células IR em gel de colágeno 3D, semelhante às células P [10]. Dado que o colágeno tipo I e fibronectina (sequestradas das FBS a médio e segregado a partir das células) são os principais componentes de ECM no nosso modelo de gel de colagénio, o padrão de integrinas expressão, incluindo α1β1, α2β1, α4β1 e α5β1, foi investigada por RT-PCR. Entre eles, α1β1 e α2β1 são relatados como os receptores de colágeno principais, enquanto α4β1 e α5β1 são relatados como os principais receptores de fibronectina [18]. Os resultados de RT-PCR indicam que, em células de IV, os níveis de transcrição de α2 e β1 aumentada, o nível de α1 diminuiu, e não houve alteração óbvio nos níveis de α4 e α5 (Fig. 2A). Os resultados de qRT-PCR confirmaram ainda que o nível de transcrição de α2 foi aumentada de 4,8 vezes, e de que β1 foi aumentada em 2,2 vezes (Fig. 2B). Além disso, a transferência de Western foi levada a cabo para detectar os níveis de proteína, e um alçado semelhante foi observado (Fig. 2C). Estes resultados sugerem que a integrina α2β1 pode desempenhar um papel importante na interacção entre células alterada IR e o ECM. Para confirmar se a expressão elevada de α2β1 integrina é essencial para a capacidade de invasão de células de IV, knockdown de expressão α2 em células IR por dois tipos de siRNA específicas para integrina α2 foi realizada, e o efeito foi verificada por meio de RT-PCR (Fig. 3A, esquerda). Na verdade, knockdown de α2 prejudicada alongamento celular IR (Fig. 3A, direita) e invasão em gel de colágeno (Filme S1, S2).

Análise

(A) semi-quantitativa dos níveis de mRNA de subunidades de integrina, incluindo α1, α2, α4, α5, e β1, a partir de P e células IR por RT-PCR. (B) A análise quantitativa dos níveis de ARNm de integrina alfa2 e b1 subunidades de P e células IR por qRT-PCR. A intensidade dos sinais foi quantificada por densitometria e normalizado com β-actina. A representação é o valor médio ± D.P. de nível de ARNm relativa (** p 0,01) a partir de 3 experiências independentes, como indicado mudança vezes em relação a células de P. (C) A análise dos níveis de proteína de integrina alfa2 e b1 subunidades P a partir de células cultivadas e IR no gel de colagénio 3D por western blotting. GAPDH foi usada como um controlo de carga.

(A) Queda da subunidade de integrina nas células α2 IR resultou em uma morfologia redonda em gel de colagénio 3D. IR células que foram transfectadas com ARNsi 2 específico para a integrina α2 (siα2-1 ou siα2-2), ou um ARNsi específico dirigido para Azami-verde (SIAG) como um controlo, foram transferidos para um gel de colagénio 3D e cultivadas durante 24 h . À esquerda: resultados de RT-PCR para verificar o efeito do knockdown específico de integrina α2. Direita: imagens representativas de morfologias celulares. Ampliação da célula individual representado pelas caixas brancas. Barra de escala, 20 mm. (B) de bloqueio funcional do α2β1 integrina induziu uma retracção reversível de saliências e invasividade de células IR. observação de lapso de tempo de células IR tratados com BHA2.1 em colágeno gel de areia 3D. As imagens representativas de células IR que eram não-tratadas (NT), tratados com BHA2.1 (BHA2.1), ou lavadas (lavagem) com meio fresco são mostrados. caixas brancas delinear a área a certeza de que ampliada. barra de escala, 100 mm. (C) análise da morfologia celular de células IR tratados com BHA2.1 contra controlos em gel de colagénio por 3D quantificar a percentagem de células alongadas no total, expresso como valores médios ± DP (*** p 0,001) a partir de 3 experiências independentes incluindo sobre 100 células. (D) Quantificação de velocidade em P e células IR em gel de colagénio-areia 3D durante 6 h, expressos como valores médios ± D.P. (*** p 0,001) a partir de 3 experiências independentes incluindo cerca de 50 células. (E) imagens Confocal de representante da MFP488 esferóides manchado de phalloidin P e IR em gel de colágeno a 0 h ou 24 h. barra de escala, de 200 mm. (F) A quantificação da área de esferóides por software ImageJ. (G) A proporção de esferóides aspecto foi calculada a partir do perímetro

2 /[4π (área)]. Os resultados são apresentados como valores médios ± DP (*** p 0,001). A partir de 3 experiências independentes em triplicado

Desde integrinas ligam-se directamente componentes da ECM e proporcionar a força necessária para a motilidade celular e invasão , considerou-se a interacção entre α2β1 integrina e no ECM foi importante para a invasão da célula IR. O BHA2.1 anticorpo de bloqueio de função (400 ng /ml), que reconhece o domínio I de α2, o sítio de ligação para colagénios, foi utilizado para tratar células IR no gel. observação de lapso de tempo mostraram que o bloqueio da activação de integrina α2β1 induzida tanto a contracção das protuberâncias celulares e baixa capacidade invasiva imediatamente após o tratamento e remoção do anticorpo através da adição de meio fresco restaurado invasão (Fig. 3B, Filme S3). tratamento BHA2.1 diminuiu significativamente a relação de fenótipo alongada (Fig. 3C) e velocidade de invasão em células IR (Fig. 3D), e aboliu invasão esferóide (Fig. 3E-3G), o que sugere que α2β1 integrina funcional é requerida para RI invasão celular.

O aumento da expressão de EGFR e ativação em células de IR está envolvido em IR celular Invasion

EGFR é um receptor tirosina quinase que é frequentemente sobre-expressos ou portos mutações constitutivamente activas em NSCLC [19]. Assim, fizemos o check-se quaisquer alterações de EGFR ocorreu em células IR. Surpreendentemente, tanto a nível transcricional o EGFR e o nível de proteína foram muito elevados em células de IV, em comparação com aqueles em células P (Fig. 4A, 4B). Um nível elevado de activação do EGFR no resíduo relacionados com a sinalização Tyr1068 foi também observada em células IR sem qualquer estimulação por ligando de EGFR (Fig. 4B). Portanto, um inibidor específico de segmentação da cinase da tirosina do EGFR, PD168393 (10 | iM), foi utilizado para tratar células RI, e foi demonstrado para diminuir a fosforilação do EGFR (Fig. 4C), a proporção de células IR alongados (Fig. 4D , 4E), e a velocidade de invasão (Fig. 4F). Como integrina α2β1 inibição, esferóides IR tratados com PD168393 permaneceu esferóides regulares sem expansão de volume (Fig. 4G, 4H) ou saliência (Fig. 4G, 4E). Estes resultados suportam a hipótese de que a via de sinalização de EGFR está envolvida no aumento da capacidade de invasão de células de IV.

(A) análise quantitativa dos níveis de ARNm de EGFR a partir de células P e IR por qRT-PCR, representados como valores médios ± SD do nível relativo de ARNm (*** p 0,001) a partir de 3 experiências independentes, como indicado mudança vezes em relação a células de P. (B) A análise dos níveis de proteínas de EGFR total e EGFR fosforilado (Tyr1068) por western blotting. A intensidade dos sinais foram quantificados por densitometria e normalizados com GAPDH. Os resultados são representados como valores médios ± D.P. do nível de proteína relativa (** p 0,01) a partir de 3 experiências independentes, como indicado mudança vezes em relação a células de P. (C-E) A inibição da activação do EGFR induzida uma morfologia redonda de células IR. IR células em gel de colagénio 3D foram tratadas com 10? M PD168393 inibidor de EGFR ou DMSO como um controlo, durante 24 h. (C) Análise da expressão do EGFR fosforilado (Tyr1068) e EGFR total dos PD168393- e amostras tratadas com DMSO por Western blotting. GAPDH foi usada como um controlo. (D) Imagens representativas de morfologias celulares das amostras tratadas com PD168393 em relação ao controlo tratado com DMSO. (E) A percentagem de células alongadas foi quantificada a partir de 3 experiências independentes incluindo cerca de 100 células, *** p 0,001. (F) Quantificação de velocidade em DMSO ou células IR tratados com PD168393 em gel de colagénio-areia 3d por 6 h são representados como valores médios ± D.P. (*** p 0,001) a partir de 3 experiências independentes, incluindo cerca de 50 células. (G) imagens Confocal de MFP488 representante esferóides IR manchado de phalloidin em gel de colágeno para 0 h e esferóides IR tratadas com DMSO ou PD168393 por 24 h. barra de escala, de 200 mm. (H) A quantificação da área de esferóides por software ImageJ. (I) a proporção de esferóides aspecto foi calculada a partir do perímetro

2 /[4π (área)]. Os resultados são representados como valores médios ± DP (*** p 0,001). A partir de 3 experiências independentes em triplicado

α2β1 integrina e EGFR Promover celular IR Invasion parcialmente através PI3K /Akt

Para identificar ainda mais o mecanismo do α2β1- integrina e EGFR-dependentes a invasão de células IR, nós examinamos várias moléculas de sinalização a jusante importantes que foram regulados por integrina α2β1 e /ou EGFR, incluindo MEK /ERK1 /2 [20], [21] , PI3K /Akt [21], [22], Stat3 [23], e MAPK p38 [24], [25]. Entre eles, Western blotting mostrou apenas ERK1 /2 e a activação de Akt para ser significativamente regulada positivamente em células de IV, com os níveis de proteína total e fosforilada dos formadores sobre os resíduos necessários para a transdução do sinal (Fig. 5A). Para confirmar se a sua activação está relacionada com a capacidade de invasão de células de IR, foram utilizados inibidores específicos de segmentação suas quinases a montante, incluindo U0126 inibidor MEK (10 uM) para ERK1 /2 e inibidor de PI3K LY294002 (50 uM) para Akt. A activação de Akt e ERK1 /2 foi anulada pela diminuição da fosforilação mediante a inibição das suas moléculas a montante (Fig. 6A). Morfologia análise mostrou que o tratamento LY294002 diminuiu a percentagem de células alongadas (Fig. 5C) e, assim, a velocidade de invasão (Fig. 5D), enquanto que o tratamento não U0126. Consistentemente, 3D esferóides ensaio de invasão mostrou que a invasão de células de IV em gel de colagénio foi suprimido apenas após tratamento com LY294002, ao passo que U0126 teve pouco efeito (Fig. 5E, 5G), embora a expansão esferóide foi inibida ligeiramente (Fig. 5F). Estes resultados sugerem o envolvimento de PI3K /Akt, mas não MEK /ERK1 /2, na transdução de sinal em células invasiva IR.

(A) Análise da expressão das formas totais e fosforiladas de Akt (Ser473), Erk1 /2 (Thr202 /Tyr204), p38 (Thr180 /Tyr182) e Stat3 (Ser727) por western blotting. A intensidade dos sinais foi quantificada por densitometria e normalizados com GAPDH. Os resultados são representados como valores médios ± D.P. do nível de proteína relativa (** p 0,01) a partir de 3 experiências independentes, como indicado mudança vezes em relação a células de P. (B-C) Efeitos de inibição de AKT e ERK1 /2 activação na morfologia das células IR. (B) as imagens de contraste de fase de inibidor de PI3K LY294002 (50 uM) ou MEK inibidor U0126 (10 uM) tratada células IR contra células IR tratados com DMSO durante 24 h em gel de colagénio 3D (c) a percentagem de células alongadas foi quantificada a partir de três experiências independentes incluindo cerca de 100 células, *** p 0,001. (D) Quantificação de velocidade em DMSO, 50 mM LY294002-, ou 10 células IR mM U0126-tratados em colágeno gel de areia 3D para 6 h, representada como valores médios ± DP (*** p 0,001) a partir de 3 independente experimentos, incluindo cerca de 50 células. (E) imagens Confocal de MFP488 representante esferóides IR manchado de phalloidin em gel de colágeno para 0 h e esferóides IR tratados com DMSO, LY294002, ou U0126 por 24 h. barra de escala, de 200 mm. (F) A quantificação da área de esferóides por software ImageJ. (G) A proporção de esferóides aspecto foi calculada a partir do perímetro

2 /[4π (área)], e os resultados são apresentados como valores médios ± DP (*** p 0,001). A partir de 3 experiências independentes em triplicado

(a) O Regulamento de EGFR em PI3K /Akt e caminhos /Erk1 2 de sinalização /MEK. IR células em gel de colagénio 3D foram tratadas com DMSO (controlo), PD168393 inibidor de EGFR (10 uM), inibidor de PI3K LY294002 (50 uM), ou MEK inibidor U0126 (10 uM) durante 24 h. As células foram recolhidas, e as quantidades de fosforilado e Akt total (Ser473) e ERK1 /2 (Tyr202 /Tyr204) foram analisadas por western blotting.