Abstract

aberrante Wnt /β-catenina sinalização tem sido fortemente associado com o tumorigênese do câncer colorretal humano. Inibidores desta via pode, então, oferecer estratégias terapêuticas, bem como quimioprevenção para esta doença maligna. Henryin é uma ent-kaurane diterpeno isolado do

Isodon

rubescens

var.

lushanensis

, uma planta sido muito utilizado na medicina popular para prevenir a inflamação e doença gastrointestinal. No presente estudo, relatamos que henryin seletivamente inibe a proliferação de células de câncer colorretal humanos com IG

50 valor na faixa nano-molar. microarrays análise e ensaios repórter mostrou que henryin trabalhou como novo antagonista da via de sinalização Wnt. Henryin reduzida a expressão de ciclina D1 e C-myc, e induziu paragem de fase G1 /S em células HCT116. Ao mesmo tempo, henryin não afectou a distribuição citosol-nuclear de β-catenina solúvel, mas prejudicada a associação de β-catenina /TCF4 complexo transcricional provavelmente através do bloqueio directo da ligação de β-catenina para TCF4. Nós também, em seguida, analisaram a relação estrutura-actividade entre o tipo de diterpenos ent-kaurane. Nossos dados sugerem que henryin, como um novo inibidor da sinalização Wnt, poderia ser um candidato potencial para uma maior avaliação pré-clínica para o tratamento de câncer de cólon, e, como tal garante uma maior exploração

Citation:. Li X, Pu J, Jiang S, Su J, Kong L, B Mao, et ai. (2013) Henryin, um ent-kaurane diterpeno, inibe a sinalização Wnt através da interferência Interação β-catenina /TCF4 em células de cancro colo-rectal. PLoS ONE 8 (7): e68525. doi: 10.1371 /journal.pone.0068525

editor: Chunming Liu, da Universidade de Kentucky, Estados Unidos da América

Recebido: 04 de março de 2013; Aceito: 30 de maio de 2013; Publicação: 02 de julho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Li et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada tanto pelo Programa 100 talentos (YL) ea Fundação Luz Oeste (JP) da Academia chinesa de Ciências, o Programa de Desenvolvimento de Pesquisa básica do Estado Maior da China (No. 2009CB522300), a Fundação de Ciência Natural da China (No. 81173076, 81172939), eo Recrutado Top Talent de Ciências e Tecnologia da província de Yunnan (2009C1120), China. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CRC) é um tumor maligno comum que, apesar dos avanços no tratamento medicamentoso e um melhor diagnóstico, continua a ser um grande desafio para o estabelecimento médico em todo o mundo. Embora a patogénese exacta da doença não é claramente entendida, doença de inflamação do intestino crónica é considerada um factor de risco que contribui para o desenvolvimento e metástase para o cancro colo-rectal [1]. Numerosos estudos têm, no entanto, sugerido que a activação aberrante da via de sinalização Wnt /β-catenina canónica desempenham um importante papel na tumorigénese. Na ausência de Wnt ligandos, β-catenina é fosforilado por um complexo incluindo polipose adenomatosa coli (APC) /Dsh /Axin /Gsk3β, que é então ubiquitinadas e degradadas através da via do proteassoma. Quando a via é activado pela ligação dos ligandos de Wnt ao seu complexo receptor de membrana, a destruição β-catenina dissocia complexos e β-catenina estabiliza-se e entra no núcleo para activar a expressão do gene alvo em conjunto com os factores de transcrição TCF [2,3 ].

Em células cancerígenas do cólon, a via /β-catenina Wnt é frequentemente anormalmente ativados [4-6]. De acordo com relatórios recentes do Atlas Rede Cancer Genome, a via Wnt é constitutivamente activado em mais de 90% do cancro colorectal humano tanto por alterações genéticas e epigenética para um número de genes que estão envolvidos na via de sinalização Wnt, tais como β-catenina , APC e Axin2 [7]. A activação da sinalização de Wnt /β-catenina subsequentemente aumenta a expressão de genes Wnt-alvo, tais como ciclina D1 [8], C-myc [9] e Survivina [10], todos os quais estão envolvidos na proliferação celular, apoptose e ciclo celular desregulamentação no desenvolvimento e progressão de fenótipos câncer colorretal malignas [11-13]

.

até o momento, os avanços no tratamento e diagnóstico de cancro colorectal são ainda limitados em sua eficácia, o que levou-nos a considerar opções alternativas em movimento para a frente. Na medicina popular, alguns

Isodon

espécies, amplamente distribuídas plantas, são utilizadas como bebida de chá para prevenir a inflamação, infecções bacterianas gastrointestinais e mesmo os tumores. Nossa hipótese é que as substâncias químicas presentes em alguns

Isodon

espécies provavelmente possuía propriedades quimiopreventivos, bem como efeitos quimioterápicos contra o câncer. Em nosso trabalho anterior, muitos constituintes químicos foram isoladas e caracterizadas a partir de

Isodon

espécie, mas o estudo de seu perfil bioativo é muito limitado e mecanismos faltam [14-16].

Nosso presente estudo concentra-se no rastreio de compostos que conferem efeitos anti-tumorais, especialmente em células de cancro colorrectal humano. Descobrimos que henryin, um diterpeno ent-kaurane, isolado a partir de

Isodon

rubescens

var.

lushanensis

, exibiu efeitos inibidores do crescimento seletivos sobre células de câncer colorretal humanos através da inibição da sinalização de Wnt. Os nossos dados mostraram que henryin interfere com a β-catenina TCF /interacção complexa e induz a paragem de fase G1 /S em células de cancro colorrectal. Por conseguinte, henryin, como novo inibidor da via Wnt /β-catenina, poderia fazer um candidato promissor fármaco tanto para a prevenção do cancro colo-rectal, bem como um agente terapêutico novo.

Materiais e Métodos

reagentes

RPMI 1640, meio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM), soro fetal de bovino (FBS), solução de antibióticos, e tripsina-EDTA foram adquiridos de HyClone (Logan, UT, EUA). O cocktail de inibidor de protease completo foi adquirido a partir de Roche Applied Science (Indianapolis, IN, EUA). Monoclonal de ratinho anti-anticorpos β-catenina anti-CyclinD1 e foram adquiridos a BD Biosciences (San José, CA, EUA). Coelho monoclonal anti-TCF4 e anticorpo anti-fosfo-β-catenina policlonal foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EUA). Coelho monoclonal anti-p21 foi comprado de Epitomics, Inc. (Burlingame, CA, EUA). Monoclonal de rato anti-lamina A /C, anti-β-actina, os anticorpos anti-c-myc e os outros reagentes, a menos que indicado de outro modo, foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). proteínas recombinantes humanos purificados β-catenina foi comprado de Inc biológica sino. proteínas recombinantes humanos purificados TCF4 foi comprado de OriGene. Dual-luciferase sistema de ensaio de gene repórter foi adquirido de Promega (Madison, WI, EUA). Lipofectamine 2000 foi adquirido a partir de Invitrogen (Camarillo, CA, EUA). O Kit QuantiTect SYBR Verde PCR foi obtido de Qiagen (Alemanha).

Compostos

Henryin e seus análogos foram extraídos de

Isodon

rubescens

var .

lushanensis

, como descrito anteriormente [14-16]. Os compostos foram dissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO).

As linhas celulares

linhas celulares de cancro do cólon (SW480, HT-29 e HCT116), pulmão humano linha celular de cancro A549, epiteliais do pulmão humano normal A linha de células (Beas-2B) e HEK293T foram adquiridas a partir da ATCC. A linha normal do cólon células epiteliais (CCD-841-CON) [17] foi gentilmente oferecida por Dr. Lin, Li, do Instituto de Bioquímica e Biologia Celular, Academia Chinesa de Ciências (Xangai, China). As células foram cultivadas de acordo com as recomendações do fabricante. Todos meio foram suplementados com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de antibióticos e antimicóticos (100 unidades /ml de penicilina G sódio, 100 mg /ml de estreptomicina) (Gibco, Invitrogen, EUA).

ensaio MTS e GI

50 determinação

As células foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 5 x 10

3cells /poço e incubadas durante 12h em uma

2 incubadora de CO. As células foram tratadas com a dose que varia de 0,008 a 4μM de henryin e seus análogos, com cisplatina, como um controlo positivo durante 48 h. Em seguida, foi adicionado 20 ul de CellTiter 96® Aqueous One Solution Reagent (Promega, Madison, EUA) e as células foram adicionalmente incubadas a 37

° C durante 1-2h. A viabilidade celular foi então medido através da leitura da absorvância a um comprimento de onda de 490 nm. A fórmula seguinte foi utilizado para determinar os valores da taxa de crescimento celular: 100 * (A490 (amostra, t) – A490 (amostra, T0)) /(A490 (controlo, T) – A490 (controlo, T0)). O GI

50 valores-as concentrações que causam 50% de inibição-se o crescimento de células determinada por análise de regressão não-linear usando software TableCurve.

Microarray e análise de dados

SW480 células foram incubadas com 4μM de henryin ou o dimetilsulfóxido (DMSO) como um controlo, durante 12 h. As células foram lisadas com Trizol (Invitrogen, EUA) e ARN totais foram isolados com o QIAGEN RNeasy Mini Kit (Qiagen, Alemanha) antes da transcrição reversa, rotulagem e hibridação com Agilent Total Humano Genoma Oligo Microarray (4 × 44K) (Agilent Technologies, Palo Alto, CA). O ensaio de micromatriz foi conduzido por Shanghai Bio Corporation. Após GO anotação e análise de caminho, foram seleccionados genes com mais do que duas vezes na alteração do nível de expressão, para posterior análise.

transfecção celular e ensaios de repórter de luciferase

Para os ensaios de gene repórter, as células foram semeadas em placas de 96 poços e incubadas a 37 ° C em 5% de CO

2 incubadora durante 12 h. células SW480 e HCT116 foram co-transfectadas com 100 ng de plasmídeos no total, incluindo 80 ng de um Wnt via bem caracterizada /β-catenina responsivo SuperTOPflash luciferase de pirilampo plasmídeo repórter (ST-Luc) e 20 ng de pRL SV40-(Promega) repórter controle plasmídeo usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Cada poço de células HEK293T transfectadas com 200 ng foi de plasmídeos no total, incluindo 80 ng de ST-Luc e 20 ng de pRL-SV40 e 10 ng de β-catenina ou 64ng de Wnt1 e plasmídeos vector vazio como indicado. Alguns 3h após a transfecção, as células foram incubadas com várias concentrações de compostos durante 24 h. As células foram lisadas com 50 ul de tampão lise Promega actividade em cada poço e luciferase foi medida e normalizada por actividade repórter pRL-SV40. Todas as experiências foram realizadas de forma independente em triplicado. Os resultados são apresentados como médias e desvios padrão (SD).

A transcrição reversa e quantitativa PCR em tempo real

O ARN total foi extraído a partir de células cultivadas e com TRIzol transcrição reversa foi realizada utilizando o SuperScript III Kit de Transcrição reversa (Invitrogen) com oligo (dT) de escorva de acordo com as instruções do fabricante. transcritos de genes foram quantificados por PCR em tempo real utilizando SYBR Green I e β-actina foi utilizado como um controlo. Os primos utilizados foram:

CyclinD1 Humano iniciador directo: 5′-AAGTGCGAGGAGGAGGTCTT-3 ‘e o iniciador inverso: 5′-GGATGGAGTTGTCGGTGTAGA-3’

Human C-myc iniciador directo: 5. ‘-CTTCTCTCCGTCCTCGGATTCT-3’ e o iniciador inverso: ‘.

Humano β-actina iniciador directo: 5′-CGCGAGAAGATGACCCAGAT-3′ 5′-GAAGGTGATCCAGACTCTGACCTT-3 e o iniciador inverso: 5′-3-GATAGCACAGCCTGGATAGCAAC ‘.

experiências de RT-PCR foram realizadas em triplicado e eficiência da PCR com os iniciadores indicados era entre 95 e 100%. curvas de fusão também foram realizados para monitorizar as amplificações específicas de iniciadores.

citosol e fraccionamento núcleo e análise de transferência de Western

células SW480 foram tratados com o henryin em placas de 6 poços. Os lisados ​​nucleares e citosólicos fraccionadas foram obtidas usando tampão de extracção nuclear e tampão de lise hipotónico, respectivamente. Todos os tampões de extracção de proteína foram suplementados com um cocktail inibidor da protease completo e cocktail de inibidores de fosfatase (Roche). A concentração de proteína de cada ligado em bruto foi determinada utilizando o kit de ensaio de proteína BCA (Enhanced Beyotime, Xangai, China). As quantidades normalizadas de amostras de lisado foram carregados em SDS-PAGE e transferidos para o difluoreto de polivinilideno (PVDF) membranas (Millipore, Bedford, MA, EUA). A imunotransferência foi realizada utilizando anticorpos de detecção de fosfo-β-catenina (Ser33 /37 /Thr41), β-catenina, Axin2, CyclinD1, C-myc, Survivina, P21, TCF4, com lamina A /C e β-actina utilizada como controlo de carregamento . HRP de ratinho anti-IgG conjugada e IgG anti-coelho foram utilizados como anticorpos secundários. SuperSignal West Pico Substrato quimioluminescente (Thermo Scientific) foi utilizado para detectar quimiluminescência e borrões foram fotografadas usando a imagem luminescente Analyzer Sistema LAS-4000mini (GE, EUA).

Co-imunoprecipitação análise

células SW480 foram cultivadas em placas de 6 poços, tratadas com henryin e seus análogos enmenol e minheryin C durante 12 h, submetidas a lise em tampão de lise proteína (Tris-HCl a 50, pH 7,4, 150 mM de NaCl, 1% de Triton X-100, 1 mM de EDTA e inibidores de proteinase) e centrifugou-se a 14000 × g durante 15 min a 4 ° C. O sobrenadante foi incubado com um anticorpo primário específico durante a noite a 4 ° C e, em seguida, incubadas com A /G PLUS de agarose (Santa Cruz Biotechnology, Inc.) durante pelo menos 2 h. As esferas foram depois lavadas cinco vezes e re-suspenso em 50 ul de tampão de SDS carregamento. A análise por Western blot foi realizada nas amostras.

In vitro

ensaio de ligação

Para ensaiar o efeito de compostos na inibição da β-catenina /TCF4 ligação, as proteínas recombinantes purificadas p -catenina (0.8μg) e TCF4 (0,5? g) foram incubadas com henryin e os seus análogos e enmenol minheryin C em concentrações indicadas, a 4 ° C durante 2 h, respectivamente. β-catenina complexos /TCF4 foram puxados para baixo usando /G PLUS contas de agarose de proteína A saturadas com anticorpo β-catenina. A detecção foi então realizada utilizando anticorpo TCF4 em análise de transferência de Western.

análise do ciclo celular

células HCT116 (5 × 10

5cells /poço em placas de 12 cavidades) foram incubadas com henryin para 0h, 12h e 24h, respectivamente. Todas as células aderentes foram recolhidas e lavadas duas vezes com PBS. As células foram fixadas com 70% de etanol durante a noite. As células fixadas foram lavadas com PBS, e depois coradas com 50 ug de um /ml de iodeto de propídio solução (PI) contendo 50 ug /ml de RNase A durante 30 min à temperatura ambiente. A intensidade da fluorescência foi analisada por citometria de fluxo FACSCalibur1 (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA). As percentagens das células distribuídas em diferentes fases do ciclo celular foram determinadas usando ModFIT LT 2.0.

Estatísticas

Os dados são apresentados como a média ± SD para os números indicados de experimentos realizados de forma independente. A análise de regressão não-linear para o cálculo de GI

50 ou IC

50 valores foi realizada pelo TableCurve. A significância estatística foi analisada por Estudante de

t

-teste ou one-way ANOVA em SigmaStat 3.1. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas quando P 0,05.

Resultados

Henryin inibe selectivamente o crescimento de células de câncer colorretal e induz a prisão fase G1 do ciclo celular

Os efeitos de inibição do crescimento de henryin sobre células cancerosas humanas eram avaliadas principalmente com ensaios MTS. Como mostrado na Figura 1B, henryin exibiu efeitos mais fortes de crescimento inibidores sobre as células cancerígenas do cólon (SW480, HT-29 e HCT116) do que quaisquer outros tipos de cancerígeno (câncer de pulmão linha de células A549) ou células normais (CCD cólon humano normal epitelial linha celular -841-Con e linha de células epiteliais do pulmão normal de Beas-2B). Como um controlo, cisplatina tinham efeitos inibidores semelhantes, em todas as diferentes linhas celulares testadas (Figura 1C). Análise do GI

50 valores de henryin e cisplatina em diferentes linhas celulares também apoiada a observação de que henryin teve um efeito inibidor selectivo sobre as células de cancro do cólon (Figura 1D). Os efeitos inibidores do crescimento de células SW480 no henryin mostrou uma maneira dose-dependente do tempo (dados não mostrados). Análise do ciclo celular mostraram que as células foram presas na fase G1 em células HCT116 tratados com henryin de uma forma dependente do tempo (Figura 1E). Estes resultados em conjunto sugerem que henryin exibiram inibição do crescimento seletivo em células de câncer colorretal.

(A) As estruturas de henryin e ent-kaurane são mostrados. (B) de inibição de crescimento de henryin em várias linhas celulares, incluindo linhas de cancro colorectal celulares (SW480, HCT116 e HT29), normais do cólon linha de células epiteliais CCD-CON-841, câncer de pulmão linha de células A549, e linha de células epiteliais pulmão normal Beas- 2B, determinada por ensaios de MTS com cisplatina utilizadas como um controlo (C). As células foram tratadas com henryin até 72 h a várias concentrações. A absorvância foi medida a 490 nm. Todos amostragem foi realizado em triplicado e os dados são apresentados como média ± DP. (D) A concentração de inibição de crescimento médio (GI

50, 72h) valores de henryin e cisplatina para várias linhas de células. (E) histogramas representativos que descrevem a distribuição do ciclo celular tal como analisado por citometria de fluxo em células HCT116 tratados com 4μM de henryin para 0h, 12h e 24 h, respectivamente. A contagem de células em fase G1 aumentou notavelmente nas células tratadas de um modo dependente do tempo.

Henryin interfere com a sinalização de Wnt em células CRC

A fim de investigar os mecanismos subjacentes através do qual henryin inibe o crescimento de células de câncer colorretal, foi realizada uma análise de microarray e alterações de expressão gênica foram ensaiadas em henryin trataram células SW480. Os genes foram filtrados, definindo critério de alteração vezes 2 (sobre-regulada) ou 0,5 (regulados negativamente) na forma de genes expressos diferencialmente. Ambos vão de anotação e análise de caminho mostrou que henryin afeta fortemente a via de sinalização Wnt, bem como outras vias alteradas que estão associados com o cancro colorectal processos biológicos em ambas as bases de dados KEGG e BioCarta (Figura 2A-B).

( A) (análise B) ensaio Microarray e os dados de expressão gênica diferencial em tratamento henryin. células SW480 foram tratadas durante 12 h com de 4μM henryin com 0,5% de DMSO utilizada como um controlo no ensaio. anotação e via de análise GO foram empregados dos bancos de dados BioCarta e KEGG, respectivamente. Os genes com alteração de dobragem de, pelo menos, 2 (sobre-regulada) ou 0,5 (regulados negativamente) foram tomados como genes expressos diferencialmente. análise de dados e as estatísticas foram geradas apenas quando os hits 5 em cada via de sinalização. vias representativos obtidos após análise de dados de microarray são mostrados. (C) Henryin inibe a expressão de Wnt repórter de uma forma dependente da dose em células HEK293T transfectadas Wnt1, e em células de cancro colorrectal, SW480 e HCT116. Três horas após a transfecção do Wnt1 e /ou ST-Luc, DMSO ou henryin com dose indicada foi adicionado às células durante 24 h adicionais e a actividade da luciferase foi então medida. (D) Henryin (4μM) inibe preferencialmente a sinalização Wnt (ST-Luc) sobre a via de sinalização de NF-kB (NF-kB-Luc) em células HEK293T. sinalização Wnt foi estimulada por transfecção de Wnt1 e de sinalização de NF-kB foi estimulada com 25 ng /ml de TNFa. Cada barra representa a média ± DP de três experiências independentes. * P 0,05, ** P 0,01, em relação ao veículo de controlo. NS, não significativo.

Na sequência da análise de microarray, verificamos o efeito de henryin na sinalização de Wnt /β-catenina utilizando o ensaio repórter TOPflash. Em células HEK293T transfectadas Wnt1, henryin inibiu a expressão de repórter de sinalização Wnt de uma forma dependente da dose depois de 24 horas de tratamento (Figura 2C). sinalização Wnt é constitutivamente activada em células SW480 e HCT116 devido à APC truncamento e mutação β-catenina, respectivamente. Em ambas as linhas celulares, a sinalização Wnt também foi inibida dependentemente da dose por henryin (Figura 2C). Ao mesmo tempo, henryin mostrou nenhum efeito evidente sobre a actividade de NF-kB sinalização repórter de luciferase responsivo (NF-kB-Luc) (Figura 2D). Estes dados sugerem que henryin especificamente inibe a sinalização Wnt /β-catenina.

Para caracterizar a relação de henryin estrutura-atividade, investigamos as atividades de análogos henryin adicionais (Figura 3A) e examinou seus efeitos sobre a sinalização Wnt com ST-Luc ensaio de repórter. Dois dos compostos, phyllostachysin F e oridonin, que possuem um grupo cetona em C-15 e 14β-OH, semelhante ao henryin, também exibiu efeitos inibidores sobre a actividade distintas ST-Luc. Enquanto isso, os análogos henryin enmenol, minheryin eriocalyxin e B, que não possuem o grupo cetona em C-15 ou 14β-OH, não mostrou nenhum efeito na actividade repórter de Wnt (Figura 3B-C). Posteriormente, analisou igualmente os efeitos de inibição do crescimento de enmenol, minheryin e eriocalyxin B. Enmenol e minheryin C, de acordo com as suas actividades não inibitórios sobre a sinalização de Wnt, exibiu nenhum efeito inibidor do crescimento nas células do câncer colorretal (Figura 3D). Notavelmente, eriocalyxin B mostraram forte citotoxicidade contra células de câncer colorretal, células de câncer de pulmão e até mesmo as linhas de células normais (Figura 3D). Este largo espectro de citotoxicidade eriocalyxin B poderia ser devido à sua actividade inibitória sobre a via de NF-kB, tal como um inibidor de NF-kB relatada [18]. Estes dados sugerem que o grupo cetona em C-15 e 14β-OH são responsáveis ​​pelo efeito inibidor da sinalização de Wnt na henryin.

(A) Estruturas de henryin e seus análogos. (B) Efeitos de análogos sobre a actividade henryin Topflash em células HEK293T. As células foram transfectadas com Wnt1 e ST-Luc durante 3 h e, em seguida, incubadas com henryin e os seus análogos de diferentes dosagens de 24 horas e as actividades de luciferase foram medidas depois. (C) A inibição do crescimento médio (GI

50, 72 h) e a inibição ST-Luc (IC

50, 24 h) valores de henryin e seus análogos em células SW480 são mostrados. (D) Efeito de análogos henryin sobre o crescimento de várias linhas de células (48hours). Os dados apresentados é a média ± SD de três experiências independentes.

Henryin inibe a expressão do gene alvo endógena Wnt

Nós verificamos a expressão de genes alvo Wnt endógenos em nossos dados de microarranjos e descobriu que a expressão de genes alvo Wnt, incluindo Axin2, ciclina D1, SP5, DKK1, NOS1, PPARô e FGF20, foram significativamente regulada negativamente após o tratamento com henryin (Figura 4A). Para confirmar os efeitos inibidores de henryin sobre a expressão de genes alvo de sinalização Wnt, que trataram células HEK293T e SW480 transfectadas com Wnt1 henryin durante 12 h e monitorizada a expressão de C-myc e Ciclina D1 por RT-PCR. Os resultados mostraram que henryin reduzida a sua expressão num modo dependente da dose (Figura 4B-C). Nós também empregou análises de Western blot para detectar as expressões de proteínas de ciclina D1, Survivin, Axin2 e C-myc em HEK293T, as células SW480 e células HCT116 tratados com henryin. Consistente com os resultados anteriores, o nível de proteína de Axin2, ciclina D1, C-myc e Survivina foram reduzidos por henryin dentro de 24 horas de tratamento (Figura 4D-F).

(A) Henryin sub-regula a expressão de Wnt genes alvo em ensaio de micromatriz. (B-C) Henryin inibe ciclina D1 e expressão C-myc em Wnt1 transfectadas células HEK293T e células SW480. As células foram tratadas com as doses indicadas de henryin para 12 horas. Os níveis de ARNm da ciclina D1 e C-myc foram determinadas por PCR em tempo real e normalizado para p-actina. (D) Os efeitos de henryin sobre a expressão de proteínas Axin2, CyclinD1 e survivina em células HEK293T transfectadas Wnt1. As células foram transfectadas com Wnt1 3 horas antes do tratamento henryin. (E) Os efeitos de henryin sobre a expressão de proteínas Axin2, CyclinD1 e survivina em células SW480. (F) Os efeitos de henryin sobre a expressão de CyclinD1, Survivina, C-myc e proteínas P21 em células HCT116. As células foram tratadas com henryin para 6, 12, 24 h e extractos celulares foram ensaiados com transferência de Western das proteínas indicadas. β-actina foi utilizado como um controlo de carga. * P 0,05, ** P . 0,01, em relação ao controle do veículo

Henryin interfere com a associação de β-catenina /TCF complexo

Uma característica da ativação da sinalização Wnt é a estabilização e acumulação nuclear de β-catenina em células de cancro colorrectal. Nós checar o efeito do henryin no nível e distribuição de β-catenina em células SW480. células SW480 foram tratadas durante 24 horas com henryin a várias concentrações e β-catenina totais e forma fosforilada de β-catenina foram examinados (Figura 5A). Enquanto isso, o β-catenina nuclear e citoplasmática também foram examinadas utilizando análise de Western blot. Os resultados revelaram que henryin tratamento não afecta nem o nível de forma total e fosforilada de β-catenina, nem a distribuição de β-catenina nos compartimentos nucleares e citoplasmáticos (Figura 5b), o que sugere que henryin tem como alvo a via Wnt jusante de β-catenina . Consistente com o resultado acima, a actividade de ST-Luc nas células HEK293T com β-catenina overexpressed foi significativamente reduzida por henryin, bem como a forma estabilizada de β-catenina devido à mutação S37A (Figura 5C). LiCl é um inibidor de GSK-3β que bloqueia a fosforilação e subsequente degradação de β-catenina, resultando, assim, na estabilização de β-catenina [19]. Sem surpresa, henryin antagonizou a ativação induzida por LiCl do Wnt canônica de sinalização, bem como (Figura 5C). Tomados em conjunto, estes dados sugerem que henryin não afecta a estabilização de β-catenina ou sua translocação nuclear, mas sim tem como alvo a jusante de sinalização de Wnt dele.

(A) Henryin não afecta a quantidade de total de β -catenina e Pho-β-catenina em células SW480. (B) Henryin não afecta a distribuição de β-catenina em fracções de citosol e no núcleo em células SW480. células SW480 foram tratados com as doses indicadas de henryin durante 24 h. Os extractos celulares ou fracções foram preparados e analisados ​​por transferência de Western. Lamina A /C e β-actina foram utilizados como controlos de carga dos núcleos e as proteínas citoplasmáticas, respectivamente. (C) Henryin antagoniza a sinalização de Wnt estimuladas com LiCl ou β-catenina. células HEK293T foram transfectadas transientemente com plasmidos constitutivamente activa β-catenina (S37A) ST-Luc e β-catenina ou, respectivamente, ou tratado com LiCl (20 mM). Cerca de 3 horas após a transfecção ou tratamento, foi adicionado henryin e as células foram incubadas durante mais 24 h. Cada barra representa a média ± DP de três experiências independentes. (D) Henryin, mas não enmenol e minheryin C, reduziu os níveis TCF4 associados com β-catenina em células SW480 de uma forma dependente da dose. As células foram tratadas com as doses indicadas de henryin e os seus análogos e enmenol minheryin C durante 12h e imuno-precipitação foi realizada por anticorpo β-catenina com IgG de rato como controlo, e, em seguida, TCF4 foi detectada por transferência Western. (E) Henryin interrompe directamente a interacção de β-catenina com TCF4 no ensaio de ligação in vitro. β-catenina humano recombinante (0.8μg) e TCF4 (0,5? g) foram misturados, incubados com diferentes concentrações de henryin e os seus análogos e enmenol minheryin C, e a mistura foi submetida a co-imunoprecipitação com anticorpo β-catenina e análise de transferência de Western com anticorpo TCF4, com IgG de rato usado como controle. (F) A quantificação das manchas de Western mostradas em D e E. O software ImageJ foi utilizado para analisar as intensidades das bandas. Os dados foram apresentados como a média ± DP de três experiências. Hen, henryin, En, enmenol, Min, minheryin C.

No núcleo, β-catenina precisa se ligar fatores de transcrição da família TCF para regular a expressão do gene alvo. Fizemos o check-se henryin prejudica a β-catenina interação /TCF. células SW480 tratados com henryin foram imuno-precipitados por anticorpo β-catenina ou IgG de rato como controlo, e TCF4 foi detectada por transferência Western e as manchas foram analisadas com ImageJ para intensidades das bandas. Os resultados mostraram que henryin fortemente inibida a ligação de TCF4 a p-catenina em uma maneira dependente da dose em células SW480, mas não os seus análogos enmenol e minheryin C (Figura 5D, 5F), o que é consistente com as actividades inibitórias sobre a sinalização de Wnt e o crescimento de células de cancro dos compostos.

de modo a determinar se henryin pode perturbar directamente a interacção de β-catenina com TCF4, in vitro os ensaios de ligação foram realizados com Puri fi cou β-catenina recombinante e proteínas TCF4. O resultado mostrou que henryin fortemente inibiu a p-catenina de ligação para TCF4 nos ensaios de ligação in vitro, ao passo que os seus análogos e enmenol minheryin C não exibiu qualquer efeito como esperado (Figura 5E, 5F).

Discussão

Segmentação de sinalização Wnt pode representar uma estratégia promissora para erradicar a doença maligna com a ativação anormal desta via. Por conseguinte, para identificar novos inibidores da via de sinalização /β-catenina de Wnt são de grande importância e significado. Esta inibição pode ser conseguida por perturbar a interacção de /TCF [20] ou proteína β-catenina CREB ligação (CBP) [21]. Estabilização Axin2 [22,23] e ativação de CK1α também foram tomados como mecanismos eficazes para inibir a sinalização Wnt para a terapêutica específicas contra o cancro do cólon [24]. Na pesquisa anterior, vários compostos têm sido encontrados para possuir a capacidade de interromper β-catenina associação /TCF directamente, tal como PKF115-854 e CGP049090, e semelhantes.

Nos últimos anos, tem havido um interesse significativo na procura de Wnt /β-catenina antagonistas de sinalização a partir de produtos naturais [25]. Com efeito, têm sido identificados diversos tipos de estrutura de produtos naturais que inibem a sinalização de Wnt /β-catenina, incluindo o Murrayafoline A [26], tetrandrina alcalóide [27], a curcumina [28], EGCG [29,30], FL avonoids [31, 32], Magnolol [33] e outros [34,35]. Recentemente, o resveratrol foi relatado como sendo capaz de inibir a sinalização Wnt jusante da β-catenina, contribuindo assim para a repressão de tumorigênese cancro do cólon [36].

Henryin, um diterpeno ent-kaurane, isolado a partir de

Isodon

rubescens

var.

lushanensis

preferencialmente induzida células de câncer colorretal morte, deixando con CCD-841 células do cólon normal e epitélio pulmonar normal Beas-2B menos afetado (Figura 1B, D). Foram identificadas as vias de sinalização afectadas pela henryin em células de cancro de cólon por ensaio de micromatriz, entre os quais a via de sinalização Wnt foi encontrado para ser um fortemente alteradas. Consistente com os dados de microarray, em ambas as células HEK293T transfectadas Wnt1 e células de cancro colorectal, henryin inibiu a actividade repórter de Wnt-sensível de um modo dependente da dose (Figura 2C). Henryin diminuiu a expressão de genes alvo Wnt endógenos (Figura 4A-F) e interfere com a associação de β-catenina /TCF transcrição complexo provável, bloqueando directamente a d o β-catenina ligação a TCF 4 (Figura 5D, 5E, 5F). Tomados em conjunto, estes dados sugerem que a actividade anti-proliferação de henryin em células de cancro colorrectal foi associada com a sua inibição da sinalização de Wnt.