Abstract

A galectina-3 (Gal-3), um membro de 31 kDa da família de beta-galactoside- proteínas de ligação, tem sido implicado na progressão de cancros humanos diferentes. No entanto, os papéis propostas diferem muito, variando de-tumor promovendo funções celulares e impacto negativo no prognóstico do paciente às propriedades tumor-supressora e impacto prognóstico positivo. Nós e outros autores anteriormente identificada como Gal-3 sobre-expressa em cancro do pâncreas, em comparação com pancreatite crónica e tecido de pâncreas normal. O objectivo deste estudo era, assim, a análise exaustiva de funções celulares putativos de Gal-3 por transientes, bem como silenciamento estável ou a sobre-expressão de Gal-3 no um painel de 6 linhas de células de cancro pancreático bem estabelecidos. Os resultados confirmam que a galectina-3 é sobre-regulada ao nível do ARNm em cancro do pâncreas e fortemente expresso na maioria das linhas celulares do cancro do pâncreas. Em linhas celulares individuais, knockdown de expressão transiente de Gal-3 resultou em efeitos inibidores moderados na proliferação, migração ou crescimento independente de ancoragem das células, mas estes efeitos não foram consistentes ao longo do espectro de linhas de células analisadas. Além disso, os efeitos funcionais da modulação da expressão de Gal-3 não foram observados em knockdown ou superexpressão abordagens estáveis ​​

in vitro

e não alterou as características de crescimento de tumores do rato de xenotransplante nus

in vivo

. Nossos dados, portanto, não suportam um papel funcional direta de Gal-3 na transformação maligna de células epiteliais pancreáticas, embora os efeitos parácrinos ou sistêmicos de expressão Gal-3 não são excluídos

Citation:. Hann A, Gruner A , Chen Y, Gress TM, Buchholz M (2011) Análise abrangente de Cellular galectina-3 não revela Função Oncogênicos consistente em células de cancro do pâncreas. PLoS ONE 6 (6): e20859. doi: 10.1371 /journal.pone.0020859

editor: Iris Schrijver, Faculdade de Medicina da Universidade de Stanford, Estados Unidos da América

Recebido: 15 Abril de 2011; Aceito: 10 de maio de 2011; Publicado: 16 Junho 2011 |

Direitos de autor: © 2011 Hann et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado em parte pelo Ministério Federal Alemão de educação e pesquisa (BMBF) no âmbito do programa NGFN da pesquisa do genoma médica (PaCa-Net; ID de projeto PKB-01GS08), bem como FP6 UE concessão LSHB-CT-2006- 018.771 (Projeto Integrado “MolDiag-Paca”). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Nenhum financiamento externo adicional foi recebida para este estudo

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

pâncreas adenocarcinoma ductal, a forma mais comum de câncer pancreático, tem uma taxa de sobrevivência de 5 anos global do 5%. Mais de 80% dos pacientes apresentam numa fase avançada da doença sem a opção para a ressecção do tumor potencial curativo [1], [2]. Embora a quimioterapia combinada com um inibidor de pequena molécula de direccionamento a sinalização do receptor de EGF foi recentemente mostrado para resultar em um aumento modesto, mas significativo, na sobrevivência em tumores localmente avançado ou metastático, o prognóstico permanece sombrio, com a sobrevivência mediana inferior ou igual a 6,2 meses [3] . Assim, novas abordagens diagnósticas e terapêuticas que melhoram resultados são urgentemente necessárias.

A família de beta-vinculativo galactósido proteínas (galectinas) é composto por 14 membros em mamíferos. Uma característica comum que distingue galectinas de outras lectinas é o seu domínio de carboidratos-reconhecimento. A galectina-3 (Gl-3), o elemento de 31 kDa desta família, tem sido associada a uma variedade de tumores, embora com funções muito diferentes [4]. Gal-3 superexpressão no tecido canceroso tem sido associada a um mau prognóstico em diferentes tipos de câncer, incluindo carcinoma hepatocelular [5], [6], carcinoma renal de células claras [7], [8] e cancro da bexiga [9]. Por outro lado, a expressão reduzida de Gal-3 no tecido do tumor em comparação com o tecido normal foi relatada em cancro do ovário [10], adenocarcinoma uterino [11], o cancro da mama [12], [13] e a neoplasia cervical [14]. No cancro colorectal, os relatórios têm sido contraditórios. Alguns autores descrevem uma associação positiva dos níveis elevados de expressão de Gal-3 com estágios avançados de tumor e o prognóstico pobre [15] – [17], ao passo que outros correlacionar a diminuição da expressão da Gal-3 com prognóstico pobre [18] – [20]. No cancro gástrico, Okada et al relataram que a expressão reduzida Gal-3 correlacionada com metástases em linfonodos e estágio do tumor avançada [21], ao passo que dois outros grupos identificados aumento da expressão de Gal-3 em câncer gástrico, mas não encontrou uma correlação com o histopatológico diferenciação ou progressão do tumor [22], [23].

Apesar dos resultados conflitantes relativos a um possível papel prognóstico da expressão Gal-3, alguns relatórios descreveram funções de promoção de tumor de Gal-3 em linhas celulares de tumores

in vitro

. Knockdown da Gal-3 resultou na migração celular reduzida e crescimento celular em células de cancro da próstata [24], a indução de apoptose em células de cancro aumentada gástricas [25], e inibiu o

In vitro

formação de colónias, bem como nu de xenoenxerto de ratinho indução em células de cancro da mama [26]. Nós e outros já anteriormente demonstrado que a Gal-3 é sobre-expresso de forma consistente em cancro do pâncreas, em comparação com ambos pancreatite crónica e pâncreas normal [27] – [30]. No entanto, investigações sobre um possível papel funcional da expressão de Gal-3 em células de cancro pancreático não foram relatados. O objetivo deste estudo foi, assim, avaliar experimentalmente os efeitos da sobre-expressão ou knockdown de Gal-3 em um conjunto abrangente de linhas celulares de cancro do pâncreas (Patu 8988s, Patu 8988t, S2-007, S2-028, IMIM-PC-1 e MIA PaCa-2). Análises funcionais incluídos ensaios de viabilidade celular, apoptose, proliferação, migração e crescimento independente de ancoragem, bem como o crescimento do tumor em um modelo de murganho de xenoenxerto. Além de efeitos isolados em linhas de células individuais, modulação da expressão de Gal-3 não teve efeito consistente sobre as características do tumor relevantes de células de câncer de pâncreas.

Materiais e Métodos

tecidos humanos e linhas celulares

A linha de células de adenocarcinoma pancreático humano IMIM-PC-1 [31] foi gentilmente fornecido pelo FX Real (Insitute Municipale de Investigación Médica, Barcelona, ​​Espanha). S2-028 e S2-007 [32] eram de T. Iwamura (Miyazaki Medical College, Miyazaki, Japão). MIA PaCa-2 foi obtido a partir da American Type Culture Collection (ATCC, RMD, EUA). Patu 8988t e Patu 8988s foram gentilmente cedidas por H. P. Elsässer (Institut für Klinische Zytobiologie und Zytopathologie, Philipps Universität, Marburg, Alemanha). Todas as linhas celulares foram mantidas em meio mínimo essencial modificado por Dulbecco (Gibco, Invitrogen Corp., Nova Iorque, EUA) suplementado com 10% de FCS (Gibco, Invitrogen Corp., Nova Iorque, EUA) e gentamicina 0,045 mg /ml (Gibco, Invitrogen Corp. , NY, EUA).

Ética Declaração

adenocarcinoma do pâncreas cirurgicamente ressecado e tecidos pancreatite crônica foram fornecidos pelos serviços de cirurgia na Universidade de Ulm e Homburg /Saar. amostras de pâncreas normais foram obtidos em zonas saudáveis ​​nas fronteiras da resectates pancreatite crônica. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes antes de usar amostras de tecido. O estudo foi aprovado pelo comitê de ética da Universidade de Ulm, Alemanha (Ethikkommission der Universitaet Ulm), bem como o comité de ética da Universidade de Homburg /Saar, Alemanha (Ethikkommission der Universitaet Homburg).

A transfecção de linhas celulares

pequeno ARN interferente (siRNA) foi transfectado em Patu 8988s, S2-007 e S2-028 células usando Lípido siLentFect Reagente (Bio-Rad, Munique, Alemanha) de acordo com o protocolo do fabricante. SiRNA transfecção em células MIA PaCa-2 foi realizada utilizando Transmessenger reagente (Qiagen, Hilden, Alemanha) e células IMIM-PC-1 foram transfectadas com X-tremeGENE siARN Transfection Reagent (Roche, Mannheim, Alemanha) de acordo com os protocolos dos fabricantes, respectivamente. Os siRNAs específicos de Gal-3 foram: Sigal-3-1, Hs_LGALS3_1 FlexiTube siARN SI00470036 e Sigal-3-2, Hs_LGALS3_2 FlexiTube siARN SI00470043 (Qiagen). Silenciador de Controlo Negativo Ambion foi usado como controlo não silenciamento.

O vector de expressão de Gal-3 foi construído por clonagem do quadro de leitura aberta de PCR amplificado de Gal-3 no /V5 dest vector pcDNA V3.2 utilizando a tecnologia de recombinação de clonagem gateway (Invitrogen Life Technologies, Karlsruhe, Alemanha). A seguir à transfecção de células 8988t Patu utilizando Lipofectamina 2000 Transfection Reagent (Invitrogen), selecção de clones de células transfectadas de forma estável foi realizada por adição de 800 ug /ml de G418 ao meio de cultura.

Gal-3-específico construção de expressão shRNA no vector pGIPZ foi adquirido a Abrir Biosystems, Huntsville, AL, EUA (cat. # RHS4430-99137619). Não silenciamento shRNAmir (cat. # RHS4348, Open Biosystems) foi utilizado como controlo negativo. Transfecção estável das células S2-007 foi realizada utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Os clones estavelmente transfectadas foram seleccionadas por adição de higromicina (400 ug /ml) ao meio de cultura.

Extração de RNA e qRT-PCR

ARN a partir de linhas de células foi extraído utilizando peqGold ARN total Kit (PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Alemanha) de acordo com o protocolo do fabricante. amostras de tecidos tumorais em massa foram homogeneizadas em nitrogênio gelo /líquido seco usando um almofariz e pilão. O ARN foi extraído utilizando o Kit RNeasy Mini (Qiagen) de acordo com o protocolo do fabricante. O ADNc da primeira cadeia foi sintetizado a partir de ARN total de 1 ug usando o Kit Omniscript RT (Qiagen) de acordo com o protocolo do fabricante. Quantitative PCR em tempo real (qRT-PCR) foi realizada utilizando SYBR Green MasterMix (Applied Biosystems, Wellesley, MA, EUA) e os pares de iniciadores específicos desenhados com o programa PrimerExpresss (Applied Biosystems). Os seguintes pares de iniciadores foram utilizados para qRT-PCR: proteína ribossomal, grande, P0 (RPLP0) Fwd: 5′-TGGGCAAGAACACCATGATG-3 ‘; rev. 5’-AGTTTCTCCAGAGCTGGGTTGT-3 ‘; A galectina-3 Fwd: 5’-AGAGGGAATGATGTTGCCTTCC-3 ‘; Rev:. ACAATGACTCTCCTGTTGTTCTCATT-3 ‘

fraccionamento subcelular e imunotransferência

fraccionamento subcelular foi efectuada como descrito anteriormente [33]. Resumidamente, as células foram lavadas duas vezes com PBS arrefecido com gelo e colhidas por centrifugação a 1,600 rpm a 4 ° C. Os lisados ​​foram então ressuspensas em tampão A (10 mM de HEPES pH 7,9; KCl 10 mM; EDTA 0,1 mM; EGTA a 0,1 mM; DTT 1 mM; inibidores de proteases) durante 15 min e, subsequentemente, centrifugada durante 20 min a 3.600 rpm Os sobrenadantes foram transferidos para novos copos e centrifugou-se a 14000 r.p.m. Para obter 4 min. As peletes foram ressuspensas em 30-100 ml de tampão C (20 mM de Hepes pH 7,9; NaCl 0,4 M; EDTA 1 mM; EGTA a 1 mM; DTT 1 mM; inibidores de proteinase) e incubou-se em gelo durante 30 min. Um passo final de centrifugação a 14000 r.p.m. durante 10 min foi realizada para separar as proteínas nucleares a partir de detritos celulares. Para Western blot, os extractos proteicos nucleares resultantes foram sujeitas a electroforese através de um gel de 7,5% de SDS-poliacrilamida e transferidos para membranas de PVDF Immobilon-P (Millipore, Billerica, MA, EUA) como descrito anteriormente [34]. As membranas foram sondadas com anticorpo anti-Gal-3 (monoclonal de ratinho, Cat. # A3A12, Abcam, Cambridge, UK), anti-ORC2 (policlonal de coelho, Cat. # 559266, BD Biosciences), anti-PARP (policlonal de coelho, gato . # 9542, Cell Signaling Technology, Boston, MA, EUA), ou anti-β-actina (monoclonal de ratinho, cat. # A1978, Sigma-Aldrich, St Louis, MI, EUA) anticorpos, lavou-se em tampão de lavagem TBS e incubadas com anticorpos secundários conjugados com peroxidase. Avançado sistema de reacção de quimioluminescência (Roche) foi usado para visualização.

viabilidade celular MTT ensaio

As células foram re-semeadas 24 horas após a transfecção em 3,9 cm

2 pratos em 60.000 a 100.000 células /poço . Após mais 24 h ou 48 h de cultura, o meio foi substituído por meio contendo MTT (azul de tiazolilo, Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha) e os pratos foram incubados durante 2 h a 37 ° C. O MTT contendo o meio foi substituído por solução de solubilização (10% de Triton X-100 (Carl Roth), ácido clorídrico 0,1 molar (Fisher Scientific, Schwerte, Alemanha) dissolvida em isopropanol (Sigma-Aldrich)) e extinção medida a 570 nm. 48 h os valores foram divididos por 24 h valores para corrigir possíveis variações no número de células semeadas.

proliferação de células BrdU ensaio

replicação do ADN como medida directa da actividade mitótica foi medida usando a célula proliferação de ELISA, BrdU kit de quimioluminescência (Sigma) de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, de 5.000 a 10.000 células foram re-semeadas 24 horas após a transfecção em placas de 96 poços uma μClear (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemanha). BrdU contendo meio foi adicionado durante 4 ou 6 horas. Após remoção do meio contendo BrdU, as células foram fixadas durante 1 h e subsequentemente incubado com o anticorpo anti-BrdU conjugado com peroxidase durante 1,5 h. A reacção de quimioluminescência foi medida em unidades de luz relativas por segundo (RLU /s).

fuga apoptose induzida

De modo a induzir a apoptose em extrinsecamente Patu 8988s células, 300.000 células foram semeadas em 9,6 cm

2 pratos de cultura e tratadas com proteína TRAIL (R D Systems, Minneapolis, MN). a uma dosagem de 25 ng /ml durante 24 h

a migração celular ensaio

modificação de Boyden Os ensaios foram realizados pela câmara reseeding 20.000 a 40.000 células ressuspensas em meio livre de soro em Transwell inserções com um tamanho de poro de 8 um (BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha). Inserções foram suspensos em 24well placas enchidas com meio suplementado com 1% de FCS. As células foram deixadas migrar para a face inferior da membrana durante 2 ou 4 horas a 37 ° C. As células que não migraram foram removidos do interior das inserções, utilizando compressas de algodão. células migradas foram coradas por submersão das membranas em 0,2% de violeta de cristal dissolvido em 20% de metanol durante 10 min. As células migraram foram contadas utilizando um microscópio óptico com uma ampliação de 10 ×.

ensaios de agar mole

A fim de avaliar o potencial de crescimento independente de ancoragem, ensaios de agar mole foram realizados como descrito anteriormente [ ,,,0],35]. Em resumo, 1 x 10

4 células por 9,6 cm

2 placa de cultura de células foram semeadas em DMEM /0,33% de Bacto-agar sobre uma camada inferior de DMEM /0,5% de bacto-agar. crescimento Anchorage-independente foi medido após 7 dias de incubação através da contagem do número de colónias viáveis.

xenotransplantes nua de rato

NMRI-

nu /nu

ratos foram propagados e mantidos num ambiente isento de organismos patogénicos. Fêmeas ratos 6-8 semanas de idade foram usados ​​nas experiências. Para gerar os xenoenxertos, 10

6 células tumorais em 0,1 ml de DMEM isento de soro foram injectados subcuntaneously nos flancos dos ratos. Três semanas após a inoculação, os ratinhos foram sacrificados, os tumores foram explantados e os tamanhos do tumor foram determinados. Metade de cada tumor foi armazenado em formaldeído a 2% e embebidos em parafina para exame histológico e imuno-histoquímica. A outra metade foi congelados em nitrogênio líquido por RNA e isolamento de proteínas.

Resultados

A superexpressão de Gal-3 no cancro pancreático

Na análise anterior microarray de alto conteúdo, identificámos Gal-3, como um dos genes sobre-expressos em tecidos de cancro do pâncreas microdissecadas [28]. Para validar esses resultados, foi realizada quantitativa RealTime PCR (qRT-PCR) em um conjunto de amostras de tecido incluindo 10 cancro do pâncreas, 5 pancreatite crônica e 5 amostras de tecido pancreático normais. Os níveis de ARNm de Gal-3 foram ligeiramente elevada nas amostras pancreatits crónicas, e foram fortemente regulada positivamente na maioria das amostras de cancro (Fig. 1A), confirmando os dados de microarray. Análise subsequente de linhas celulares de cancro pancreático demonstraram forte expressão, tanto no ARNm, bem como sobre o nível de proteínas, em 5 de 6 linhas de células testadas (Fig. 1B).

foram determinados

os níveis de Gl-3 ARNm quantitativa por PCR em tempo real (qRT-PCR) (A, B). proteína ribossomal, grande, P0 (RPLP0) foi utilizado como o gene de referência. PC: cancro do pâncreas; CP: pancreatite crônica; NP: pâncreas normal. A expressão da proteína em diferentes linhas celulares de cancro pancreático foi determinada por Western blot (C) analisa. β-actina foi utilizada como controle de carga.

O nível de expressão de Gal-3 não tem qualquer influência sobre o crescimento de células tumorais

in vitro

Para avaliar o papel funcional do Gal-3 expressas de forma aberrante em células de cancro do pâncreas, Gal-3 foi transientemente ou estavelmente sobre-expresso ou silenciados em diferentes linhas de células de cancro do pâncreas e dos efeitos analisados ​​em diversos ensaios funcionais in

in vitro

. Para silenciamento transitória, foram utilizadas duas sequências de siRNA independentes, bem como a não-silenciamento siRNA controle. Para cada uma das cinco linhas celulares analisados ​​(Patu 8988s, S2-007, S2-028, IMIM-PC-1 e MIA PaCa-2), os reagentes de transfecção e -Condições foram optimizadas para obter eficiências knockdown 80% (Fig. 2A).

(a) knockdown transiente de Gal-3 foi realizada por transfecção transitória de várias linhas celulares utilizando dois-3 Gal sequências diferentes específicas siRNA (Sigal-3 1 e 2) ou um controlo não-silenciamento siRNA (NC). (B) knockdown Estável em S2-007 foi realizado utilizando construções de expressão shRNA. Três Gal-3 específicos clones shRNA transfectadas (shGal-3 1, 2 e 3) e três clones de controlo nonsilencing shRNA transfectadas (SHC 1, 2 e 3) foram escolhidos para análise posterior. (C) a sobre-expressão estável de Gal-3 foi obtida por transfecção de células 8988t Patu com um vector de expressão de Gal-3 (pGal-3 1, 2 e 3) ou um vector de controlo (PC 1 e 2). L indica a células não transfectadas. Os lisados ​​celulares totais foram analisados ​​por qRT-PCR (painéis superiores) e Western blot (painéis inferiores) para os níveis de Gl-3 Expressão. Os níveis de ARNm de Gal-3 foram determinados em relação ao RPLP0. Sigal-3 1 e 2 foram normalizados para NC. β-actina foi utilizado como controlo de carga para as transferências de Western.

knockdown clones estáveis ​​foram gerados utilizando S2-007 células transfectadas com sequências de shRNA clonados no vector pGIPZ. Três clones transfectados de forma estável, bem como três clones transfectados de controle de vetores foram escolhidos para análise posterior (Fig. 2B).

Uma vez que as células 8988t Patu mostrou muito baixos endógenos Gal 3 níveis, esta linha celular foi escolhido para a construção de estável Gal-3 que sobre-expressam clones. Três clones independentes foram estabelecidos. Dois destes mostrou sobre-expressão moderada de Gal-3 recombinante no nível de ARNm, o qual foi muito mais acentuada no nível de proteína (Fig. 2C, pistas 4, 6). O clone restantes não apresentaram expressão recombinante apreciável de Gal-3 (Fig. 2C, pista 5), ​​mas foi incluída nas experiências adicionais como clone de controlo adicional. Curiosamente, os clones de controlo transf ectadas com vector vazio apresentaram também um tanto elevados níveis de Gal-3 (Fig. 2C, pistas 2, 3).

Num primeiro ensaio funcional, a influência de Gal-3 expressão sobre a viabilidade celular foi analisada por ensaios MTT. Nem knockdown transiente em qualquer uma das 5 linhas de células testadas, nem knockdown estável em células S2-007 ou sobre-expressão estável em células de 8988t Patu teve qualquer efeito significativo na viabilidade das células sob condições de cultura normais tal como comparado com os controlos adequados (Fig. 3 A- C).

transitoriamente Gal-3 linhas celulares silenciados (a), de forma estável Gal-3 silenciados S2-007 clones celulares (B) ou de forma estável Gal-3 que sobre-expressam Patu clones de células 8988t (C) foram cultivadas durante 24 e 48 h, seguido de incubação com MTT. 48 h os valores foram divididos por 24 h (valores para corrigir possíveis variações no número de células semeadas) e normalizado para controlar células transfectadas siRNA (NC). Valores de clones de células knockdown estáveis ​​Gal-3 (shGal-3 1, 2 e 3) e clones de células GAL-3 que sobre-expressam estáveis ​​(pGal-3 1, 2 e 3) foram normalizados para a média de vector de controlo transfectadas clones de células estáveis ​​( SHC 1, 2, 3 e pC 1, 2), respectivamente. Os dados incluem um mínimo de três experiências independentes.

Análise de proliferação de células BrdU utilizando ensaios revelou uma inibição moderada, mas significativa da actividade proliferativa em células S2-028 após knockdown da Gal-3 (Fig. 4A , painel 3). No entanto, a tendência para a proliferação reduzida não alcançou significância em Patu 8988s e S2-007 células, estava ausente em IMIM-PC-1 e até mesmo revertido em células MIA PaCa-2 (Fig. 4A). Nem knockdown estável em células S2-007, nem sobre-expressão estável de Gal-3 em células 8988t Patu teve qualquer efeito significativo na proliferação de clones de células resultantes.

transitoriamente Gal-3 linhas celulares silenciados (A), estavelmente Gal-3 silenciados S2-007 clones celulares (B) ou de forma estável Gal-3 que sobre-expressam Patu célula 8988t clones (C) foram cultivadas com o agente de BrdU durante 2 ou 4 horas. incorporação de BrdU por células em proliferação foi medida por ELISA. Os valores de células transf ectadas transitoriamente com diferentes de Gal-3 siRNAs específicos (Sigal-3 1 e 2) foram normalizados para controlar células transfectadas siRNA (NC). Valores de clones de células knockdown estáveis ​​Gal-3 (shGal-3 1, 2 e 3) e clones de células GAL-3 que sobre-expressam estáveis ​​(pGal-3 1, 2 e 3) foram normalizados para a média de vector de controlo transfectadas clones de células estáveis ​​( SHC 1, 2, 3 e pC 1, 2), respectivamente. Os dados incluem um mínimo de três experiências independentes. * Indica

p Art 0,05 em comparação com células transfectadas controle siRNA (frente e verso não pareado

t

-teste)

Da mesma forma, transitória Gal-3. knockdown não teve nenhum efeito sobre a actividade apoptótica (como medido por clivagem de PARP) de Patu 8988s células na ausência (Fig. 5, pistas 1-4) ou na presença (Fig. 5, pistas 5-8) do indutor de apoptose extrínseca fuga. clivagem de PARP foi induzida pelo procedimento de transfecção e foi mais pronunciado na presença de fuga (Fig. 5, pistas 2 e 6), mas não foi ainda reforçada por knockdown da Gal-3 (Fig. 5, pistas 3-4 e 7 -8).

células transfectadas transientemente com Gal-3 siRNAs específicos (Sigal-3 1 e 2), o controlo nonsilencing siRNA (NC) ou células não transfectadas (U) foram analisados ​​por Western blot para poli ADP-ribose polimerase (PARP) clivagem. O aumento da clivagem, indicado pelo sinal melhorado da banda inferior, foi observada em todas as células transfectadas. clivagem PARP foi reforçado por tratamento com o extrínseca Trail apoptose indutor, mas não foi influenciada pela Gal-3 knockdown. p-actina foi utilizado como controlo de carga. Os resultados apresentados são representativos de três experiências individuais.

replicação deste conjunto de experiências sob condições isentas de soro produziram resultados semelhantes, não conseguiram demonstrar qualquer influência consistente da modulação de Gal-3 no crescimento celular expressão ou apoptose nas linhas celulares testadas (dados não mostrados).

efeito inconsistente de Gal-3 na migração celular

ext analisada a influência da Gal 3-expressão na migração celular numa Boyden ensaio de câmara. As células foram capazes de transmigrar através de um filtro ao longo de um gradiente de soro fetal de vitelo. Números de transitoriamente Gal 3-silenciados células migradas foram normalizados para as células transf ectadas não silenciamento de ARNsi de controlo. knockdown transiente de Gal-3 resultou numa tendência para uma diminuição da migração celular em três em cada cinco linhas celulares analisadas, embora este efeito não atingiu significância na maioria dos casos (Fig. 6A). Além disso, este efeito não foi reproduzida nas S2-007 clones de células estáveis ​​com knockdown Gal-3 (Fig. 6, B). Em analogia inversa para os resultados das experiências de knockdown transitórios, a sobre-expressão estável de Gal-3 em células 8988t Patu induziram uma tendência para o aumento da migração de células (Fig. 6, C), embora esta tendência também não alcançaram significância e também foi evidente em clone pGal-3 2, que mostrou expressão baixa ou ausente de Gal-3 recombinante (ver Fig. 2C). Tomados em conjunto, modulação da expressão de Gal-3 teve um efeito suave e pouco consistente nos ensaios de câmara de Boyden, argumentando assim contra um papel importante de Gal-3 celular na migração dirigida de células de câncer de pâncreas.

transitoriamente Gal- 3 linhas celulares silenciados (a), de forma estável Gal-3 silenciados S2-007 clones celulares (B) ou de forma estável Gal-3 que sobre-expressam Patu célula 8988t clones (C) foram cultivadas em insertos de câmara de Boyden-para 2 ou 4 h. As células que migram através dos poros das inserções ao longo de um gradiente de soro fetal de vitela foram fixadas, coradas de azul de metileno e contados utilizando microscopia de luz. O número de células que migraram transfectadas transientemente com diferentes de Gal-3 siRNA específico (Sigal-3 1 e 2) foram normalizados para controlar células transfectadas siRNA (NC). Gal-3 células de knockdown estáveis ​​migrados (shGal-3 1, 2 e 3) e as células de Gal-3 que sobre-expressam estáveis ​​(pGal-3 1, 2 e 3) foram normalizados para a média de vector de controlo transfectadas clones de células estáveis ​​(SHC 1, 2, 3 e pC 1, 2), respectivamente. Os dados incluem um mínimo de três experiências independentes. * Indica

p Art 0,05 em comparação com células transfectadas controle siRNA (frente e verso não pareado

t

-teste)

A inibição da expressão Gal-3. prejudica o crescimento independente de ancoragem num subconjunto de linhas celulares de cancro pancreático, mas não tem nenhum efeito sobre o crescimento de tumores de xenoenxerto in

in vivo

O potencial para o crescimento independente de ancoragem das células cancerosas foi avaliada por avaliação o número de colónias formadas em ensaios de agar mole. knockdown transitória de Gal-3 resultou em uma redução clara da capacidade de formação de colónia para as linhas celulares Patu 8988s, S2-007 e IMIM-PC-1, com o efeito mais forte e de maior significância estatística observada para S2-007 células (Fig. 7A ). Por outro lado, as células S2-028 e Mia PaCa-2 não foram afetados pela knockdown Gal-3. Desde os relatórios anteriores tinham indicado que as funções de promotores de tumor de Gal-3 em outro sistema de células pode depender da localização subcelular da proteína [26], [36], [37], analisou-se o efeito diferencial de Gal-3 knockdown capacidade de formação de colónias correlacionada com a localização subcelular diferente da Gal-3 nas linhas celulares testadas. proteína Gal-3 foi igualmente distribuído entre núcleo e citoplasma em 2 PACA e S2-007 células MIA e foi ligeiramente sobre-representadas nas fracções citosólicas em Patu 8988s, S2-028 e células (Fig. 7B) 1 IMIM-PC-, assim, mostrando nenhuma correlação com a sensibilidade em relação a Gal-3 knockdown.

(a) de Gal-3 foi transitoriamente silenciados em linhas celulares de cancro pancreático utilizando duas sequências de siRNA independentes (Sigal-3 1 e 2). células de knockdown e de controlo foram semeados em agar de formação de colónias e macio avaliada após 7 dias. Os resultados foram normalizados para controlar células transfectadas siRNA (NC). Os dados incluem um mínimo de três experiências independentes. * Indica p 0,05 em comparação com células siRNA transfectadas de controle (frente e verso não pareado

t

-teste). (B) Análise de transferência de Western de nuclear (N) e as fracções citoplasmática (c) proteínas derivadas de linhas celulares de cancro pancreático. Gal-3 é mostrado na pista superior. coloração de p-actina foi utilizado como controlo de carga. A coloração para o factor ORC2 nuclear foi usado para avaliar a pureza das fracções subcelulares. (C) tumores de xenoenxerto foram induzidos em ratinhos nus, por injecção subcutânea de duas Gal-3 clones estáveis ​​knockdown S2-007 celulares (shGal-3 2 e 3) e duas de controlo nonsilencing shRNA transfectadas S2-007 clones (SHC 2 e 3). Seis ratos por grupo experimental foram analisados. parcelas Box-e-suiça ilustrar volumes de tumor no dia 22 após a injecção. Bigodes denotam 1,5 × intervalo interquartil (IQR). Os valores fora desta faixa são mostrados como triângulos cheios. (D) os níveis de ARNm de Gal-3 no tecido grandes quantidades de tumores de xenoenxerto quando determinado por qRT-PCR. RPLP0 foi usado como gene de referência.

Em seguida, testamos se o efeito sobre o crescimento independente de ancoragem em S2-007 células também traduzidas em diferenças no crescimento do tumor

in vivo

.

Para este fim, os tumores de xenoenxertos foram induzidos em ratinhos nus, por injecção subcutânea de células S2-007 com Gal-3 células estáveis ​​knockdown ou transfectadas com vector de controlo, respectivamente. Não houve diferença significativa nos volumes tumorais entre Gal-3 knockdown e controle tumores foi observada (Fig. 7C). O exame histológico dos tumores também não revelou quaisquer diferenças sistemáticas na diferenciação, invasividade local ou densidade de microvasos entre os diferentes grupos (dados não mostrados).

A fim de confirmar a redução persistente da Gal 3-níveis na knockdown tumores, o ARNm foi preparado a partir de tecido de tumor em massa e analisado por qRT PCR. Como esperado, os níveis de ARNm de Gal-3 foram significativamente mais baixos nos tumores derivados dos clones S2-007 knockdown do que os derivados a partir de clones transfectados com vector de controlo (Fig. 7D).

Discussão

a desregulação da expressão de Gal-3 foi descrita em vários cancros humanos, embora o valor prognóstico das mudanças observadas permanece uma matéria de controvérsia [37], [38]. adenocarcinoma ductal do pâncreas é entre os tumores humanos, em que uma sobre-expressão significativa de Gal-3 tanto no ARNm, bem como sobre o nível de proteína está bem estabelecida [27], [30]. Os nossos próprios resultados de microarray análises de tecidos tumorais pancreáticas microdissecadas indicou que Gl-3 é expresso pelas próprias células tumorais, em vez de por as células do estroma, que normalmente constituem a maior parte do tumor [28]. No presente estudo, nós confirmar a superexpressão de ARNm de Gal-3 no tecido tumoral por qRT-PCR e mostram que a forte expressão de Gal-3 é retida na maioria das linhas celulares de cancro do pâncreas e

In vitro

.

Como é o caso com dados sobre o papel prognóstico no câncer, relatórios sobre as funções celulares putativos de Gal-3 em células cancerosas são, em parte inconclusivos ou mesmo contraditórias. Enquanto Honjo et al. perda de relatório (independente de soro) e capacidade proliferativa revogação de crescimento independente de ancoragem em células de cancro da mama seguinte silenciamento de expressão Gal-3 [26], Matarrese et ai. Não foi observada nenhuma diferença no crescimento ou proliferação das células mediante modulação da expressão de Gal-3, mas descrevem maior resistência à apoptose após superexpressão de Gal-3 [36]. Da mesma forma, o mesmo grupo que observou os efeitos inibidores do crescimento de Gal-3 silenciamento em células de cancro da mama descritos efeitos anti-tumorais fortes de Gal-3 knockdown em células de cancro da próstata, incluindo a migração de células reduzidos, invasão, proliferação celular, colónia independente de ancoragem formação, e o crescimento do tumor em xenoenxertos de ratinhos nus [24]. Em contraste, Califice et ai. não observaram qualquer efeito de expressão Gal-3 sobre a proliferação de células de câncer de próstata em qualquer constelação, e relatou que Matrigel invasão, crescimento independente de ancoragem e formação de rato xenotransplante nu foi promovido apenas por citoplasmática expressão Gal-3, enquanto que a localização nuclear de Gal -3 teve o efeito oposto [37].

um tema comum em muitos destes estudos é o facto de, frequentemente, muito poucas ou apenas uma única linha de células foi analisado, e de que alguns dos efeitos foram apenas observadas sob condições experimentais muito específicas. Jiang et al.