Sumário

O microambiente do tumor, incluindo células do estroma, em torno dos vasos sanguíneos e componentes da matriz extracelular, foi definido como um factor importante que influencia a proliferação, a resistência aos medicamentos, invasão e metástase de células epiteliais malignas. Entre outros fatores, as comunicações e interação entre as células cancerosas e células estromais foram relatados para desempenhar um papel central na promoção e progressão do câncer. Para investigar estas relações, o modelo de co-cultura em chip foi desenvolvido para o estudo da interacção celular entre células de carcinoma de pulmão humano A549-e células epiteliais do pulmão para MRC-5 humanos em ambas as condições normais de proliferação e de tratamento. Em resumo, um dispositivo de co-cultura que consiste de 2 câmaras fluídicos individuais em paralelo, os quais foram separados por uma cerca de 100 um foi utilizado para padronização de células. Microeléctrodos matrizes foram instalados no interior de cada câmara de eléctrodos, incluindo a várias distâncias de distância da linha de confronto para a avaliação de detecção electroquímica impedimétrico influência de célula-a-célula. Após a cerca foi removido e o contacto célula-a-célula ocorreu, pela avaliação das respostas de sinais que representam impedância condição e o comportamento de células, ambas as interacções directas e indirectas de célula-a-célula através de meios condicionados foram investigados. O impacto das distâncias específicas que levam a diferentes influências de células de fibroblastos em células cancerígenas no ambiente de co-cultura também foi definida

Citation:. Tran TB, Baek C, Min J impedância (2016) Eléctrica Cell-Substrato Sensing (ECIS), com microeletrodos Arrays de Investigação da Cancer Cell – fibroblastos Interaction. PLoS ONE 11 (4): e0153813. doi: 10.1371 /journal.pone.0153813

editor: Jonghoon Choi, da Universidade Chunag-Ang, República da Coreia

Recebido: 12 de fevereiro de 2016; Aceito: 04 de abril de 2016; Publicação: 18 de abril de 2016

Direitos de autor: © 2016 Tran et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiada pelo Centro de pesquisas BioNano Saúde-Guard, financiado pelo Ministério da Ciência, TIC Planejamento Futuro (MSIP) da Coreia como Projeto fronteira global (H-GUARD_2015M3A6B2063548) e foi apoiado pelo Programa de Desenvolvimento de Tecnologia nanomaterial através da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF), financiado pelo governo da Coreia (MSIP) (NRF-2014M3A7B4051907).

Conflito de interesses: os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

há uma evidência crescente demonstrando que o microambiente do tumor, incluindo as células do estroma, células inflamatórias, extracelular. matriz (ECM), citocinas, factores de crescimento de vasos e, desempenha um papel importante na iniciação, progressão e invasão de cancro [1-3]. Durante a tumorigénese, células cancerosas interagem dinamicamente com células do estroma circundante, tais como fibroblastos, células adiposas e células imunitárias residentes. Entre estes, os fibroblastos formam o maior grupo de células do estroma e parecem funcionar de forma proeminente na progressão do cancro [4-5].

Descrita pela primeira vez no final dos anos 19

th século, os fibroblastos são alongadas, não-vascular , células não epiteliais e não-inflamatórias do tecido conjuntivo com processos celulares extensos que mostram uma forma fusiforme ou fusiforme no perfil. Fibroblastos executar muitas funções importantes, incluindo a deposição de ECM, a regulação da diferenciação epitelial e a regulação da inflamação; Eles também estão envolvidos na cicatrização de feridas [5]. Durante a proliferação normal em órgãos saudáveis, fibroblastos sintetizam e secretam vários tipos de colagénios (i.e., tipos I, III e V), bem como a fibronectina e proteoglicanos, que são os constituintes essenciais da ECM [6]. Os fibroblastos também segregam colagénio tipo IV e laminina, que auxiliam na formação da membrana basal [7]. Em órgãos feridos, fibroblastos desempenham um papel importante no processo de cicatrização de lesões e ao invadir gerar ECM para servir como um andaime para outras células [8].

Na fase inicial de desenvolvimento de neoplasias, células cancerosas formar uma lesão neoplásica dentro dos limites da membrana basal, mas separados do tecido circundante [9]. A membrana basal, f ibroblastos, células do sistema imunológico, capilares e de ECM que rodeiam as células cancerosas formar uma área que é chamado o microambiente do tumor. Como a principal fonte de componentes da matriz extracelular, os fibroblastos são definidos como um componente celular chave de tumores. Em associação com as células cancerosas, fibroblastos normais pode adquirir um fenótipo perpetuamente activado por comunicação célula-célula directa ou por vários estímulos que surgem quando ocorre lesão tecidual [10]. fibroblastos activados exibem a UP-regulamentos de metaloproteinases-2 ECM que degradam a matriz, 3 e 9 (MMP-2, MMP-3 e MMP-9), bem como muitos factores de crescimento, que induzem sinais de proliferação de células epiteliais adjacentes [11] . A partir desta associação próxima, surge uma pergunta sobre as interações celulares heterotípicos entre as células tumorais e fibroblastos no microambiente do tumor. Na última década, um número de estudos de investigação têm clarificado o efeito de fibroblastos em vários aspectos do comportamento de células de cancro, incluindo da proliferação, angiogénese, invasão, metástase e resistência a drogas; no entanto, o comportamento células cancerosas ainda não foi completamente explicado. Proeminente, Stoker et al. (1966), Wadlow et ai. (2009) e Flaberg et ai. (2011, 2012) demonstraram que os fibroblastos normais podem inibir o crescimento de células cancerosas

in vitro Comprar e eles chamaram este efeito como a supressão vizinho [12-15]. Flaberg et ai. (2012) desenharam um ensaio de co-cultura com células tumorais H2A-MRFP-etiquetadas em um mono-camada de fibroblastos [15]. Ao longo de 62,5 h, as células de tumor a proliferação e a motilidade foram significativamente inibidos pelos fibroblastos através da interacção directa célula-a-célula. Para entender completamente esses efeitos, temos conjecturado se existe uma interação indireta vizinho entre fibroblastos e células cancerosas, o que denominado como um efeito de distância. A hipótese é dado que o efeito inibitório de fibroblastos em células cancerosas é uma função da distância entre estes tipos de células 2 num microambiente estromal comum.

Neste estudo, foi proposto um modelo de co-cultura com simples incorporado matrizes de alto rendimento microeletrodos (MEA) usando uma célula-substrato elétrica impedância de detecção do ensaio (ECIS) (figura 1) para monitorar as condições de células tumorais de forma contínua quando confrontado com cultura de fibroblastos. Este método de detecção elétrica foi utilizada neste estudo devido às vantagens proeminentes; este método é não-invasivo, simples de configurar, fácil de executar, extraordinariamente sensíveis às condições celulares e capaz de monitoramento em tempo real [16,17]. O MEA foi modelado em ambos os lados das superfícies de cultura de células a várias distâncias da linha de separação. Durante as interacções celulares, cada eléctrodo grava continuamente um sinal de impedância através de um sistema de aquisição de dados de alto rendimento. Este tipo de dados tem sido reconhecido impedimétrico para reflectir a adesão celular, espalhamento, proliferação e viabilidade, em condições de tratamento com toxinas ambientais, drogas e produtos químicos, assim como outras substâncias

(A) microeletrodos arrays de (1.: eletrodo, 2 trabalho: contra-eléctrodo comum) foram fabricados em lâminas de vidro experimentais (76mm x 52mm) por processos de fotolitografia comuns. SU-8 fotorresistente foi usado como camada de passivação para cobrir os traços condutores. (B) A plataforma de detecção foi dividida em 2 partes, uma para as células de cancro e um para os agentes do microambiente. Vários eléctrodos de trabalho de tamanho mirco-se instalado em cada área a distâncias diferentes: 100, 250, 650, 1450 e 3050μm longe da linha de confronto. (C) um único eléctrodo era de 100 um de diâmetro. (D) Uma imagem de um chip real depois a co-cultura de 2 tipos de células diferentes em 2 lados. (E) O processo de padronização de co-cultura utilizando um molde de câmara dupla. (E

1) Após o tratamento da superfície de cultura de células, o chip de células foi colocado no suporte concebido, e o molde de câmara dupla foi fixado na posição adequada por meio de parafusos. As câmaras 2 foram separados um do outro por uma parede de espessura de 100 um para padronização de células. (E

2) Depois de as células em ambos câmara tinha ligado à superfície do chip, o molde de câmara dupla foi substituído por um bem-tipo aberto reservatório. Uma cama de PDMS foi também instalado para evitar a solução de vazamento. O chip de células foi ligado ao sistema de medida e foi mantido na incubadora durante as medições.

Neste estudo, mostrou que o efeito inibitório de MRC 5-fibroblastos pulmonares humanos na proliferação normal das A549 cancro do pulmão células humanas. diferenças de sinal de impedância foram determinados para demonstrar indirectamente o efeito de distância entre células MRC-5 e células A549 em um ambiente de co-cultura. Particularmente nas condições de tratamento de droga, também observamos uma supressão intensiva em interacção directa de fibroblastos-cancro, que era maior do que a exercida pela interacção indirecta. Além disso, o efeito inibitório de fibroblastos foi confirmada utilizando o celular activada por fluorescência método (FACS) em um modelo de cultura mista. Nosso estudo teve como objetivo imitar um

in-vivo

efeito estromal terapêutico na progressão do tumor com um romance detecção e técnica de análise no domínio tempo real.

Materiais e Métodos

MEA fabricação

O padrão MEA foi fabricado em lâminas de microscópio de vidro (52 mm x 76 mm) por processos de fotolitografia comuns usando AZ-5214E ​​(MicroChemicals GmbH, Alemanha) como um fotorresiste negativo para um processo de decolagem. A modelação foi seguida pela deposição de uma 250 A /500 A Ti /Au bi-camada, utilizando um sistema de evaporação de feixe electrónico, e as porções desnecessárias foram removidos selectiva em acetona. Depois que os eletrodos foram formados, foi realizada uma segunda etapa de fotolitografia para aplicar uma espessa camada 2 m de SU-8 de 2002 (Microchem, EUA) como uma camada de isolamento para os traços de ouro, deixando apenas as matrizes de eletrodos e almofadas de contacto expodes.

cultura celular

MRC-5 de fibroblastos de pulmão humano e células de cancro do pulmão humano A549 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA) e foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Gibco ) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS, Gibco) e 1% de antibióticos /antimicóticos (Gibco). Estas células foram mantidas em condições de 37 ° C e 5% de CO

2 e sub-cultivadas sob tratamento de EDTA de tripsina-solução (Gibco). O número de células foi contado usando o Cellometer (Cellometer Auto T4, EUA).

padronização celular no chip MEA

Neste estudo, a célula foi modelado usando um método de barreira física comum para criar regiões livres de células para a migração de células coletiva [18]. A barreira física foi aplicado antes da semeadura de células para bloquear mistura de células, e a remoção da barreira física inicia o processo de migração celular e confronto. luminárias de acrílico para o chip de celular e molde de dupla câmara foram projetados usando AutoCAD e foram fabricados usando uma fresadora CNC (Fig 1E). Antes de ser utilizada para a cultura de células, todas as peças foram esterilizadas num banho de álcool e secaram-se numa estufa com luz UV. Depois de o molde de câmara dupla foi fixado para o chip de pilha na posição adequada por meio de parafusos, cada câmara foi tratada com uma solução de colagénio (10%) durante 15 min à temperatura ambiente para promover a adesão celular. Em seguida, as câmaras foram lavadas com 1X PBS, e os 2 tipos de suspensão de células (5 × 10

5 células /câmara) foram injectados no 2 câmaras separadas. Depois de 12 h, quando ambos os tipos de células tinha ligado e assim havia formado uma monocamada na superfície do chip, as câmaras foram desmontados e foram substituídos por poço de tipo reservatório. O chip de células foi ligado ao sistema ECIS e mantido na incubadora durante as medições.

coloração CellTracker para verificar a migração

MRC-5 de fibroblastos foram coradas com CellTracker antes de co-cultura para avaliar a sua migração para a área das células tumorais A549. Em resumo, as células MRC-5 foram cultivadas numa placa de cultura de células (SPL), e foram recolhidas utilizando tripsina-EDTA (Gibco). As células foram centrifugadas, o sobrenadante foi removido, e as células foram re-suspensas em 1 ml de cultura de meio (RPMI-1640 com 10% de FBS, 1% de PS, HEPES 25 mM, Gibco). A solução de células recebeu 20 uM de CellTracker

TM (Life Technologies, CellTracker

TM verde CMFDA) e as células foram subsequentemente incubadas durante 30 min. Em seguida, as células foram centrifugadas e o sobrenadante foi removido; em seguida, as células foram re-suspensas em 1 ml de meio de cultura fresco. As células marcadas foram então pronto para ser injectado na câmara de co-cultura, tal como descrito na secção de modelação de células. A coloração de células foi confirmada utilizando a microscopia de fluorescência (Eclipse 80i, Nikon).

análise de citometria de fluxo

A549 e células MRC-5 (5 × 10

5 células /ml) foram cultivadas em placas de 6 poços, tanto para o mono-cultura de células A549 e a co-cultura de A549 e as células MRC-5). Cada tipo celular foi tratada com 30 uM de curcumina (Sigma-Aldrich) durante 3 dias. Em seguida, as células foram lavadas três vezes com PBS frio (Sigma-Aldrich) e tampão de ligação suspensa (HEPES 10 mM, NaCl 140 mM, CaCl 2,5 mM

2, pH 7,4, Sigma-Aldrich). Cada amostra recebeu 5